第二章-紫外-可见光谱分析法
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第二章 可见紫外吸收光谱分析1
由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用于
用于可见光域内。 石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185－ 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三个光域。
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的。
它可用于紫外、可见及红外光域，而且
在整个波长区具有良好的、几乎均匀一 致的分辨能力。
它具有色散波长范围宽、分辨本领高、 成本低、便于保存和易于制备等优点。 缺点是各级光谱会重叠而产生干扰。
它是分光光度法定量分析的依据。
吸光系数
朗伯-比耳定律中，当c以克/升，液层厚 度b以厘米表示时，常数K以a表示，称 为吸光系数。 a的单位为升/克.厘米。 朗伯-比耳定律 :A=abc
摩尔吸光系数
朗伯-比耳定律中，浓度用摩尔/升，液 层厚度b用厘米为单位表示，则K用另一 符号ε来表示。 ε称为摩尔吸光系数(或克分子消光系数)， 单位为升/摩尔.厘米。 它表示物质的浓度为1摩尔/升，液层厚 度为1厘米时溶液的吸光度。 朗伯-比耳定律 : A=εbc
72型 721型
751型 WFD-8型
760 40000
～
硅碳棒或 辉光灯
岩盐或萤 石棱镜
WFD-3型 WFD-7型
一、组成部件
光源
单色器
样品池
记录装置
检测器
（一）光源
对光源的基本要求是应在仪器操作所 需的光谱区域内能够发射连续辐射，有足 够的辐射强度和良好的稳定性，而且辐射 能量随波长的变化应尽可能小。 常用的光源有热辐射光源（如钨丝灯 和卤钨灯）和气体放电光源（如氢灯和氘 灯）两类。
1)非单色光的影响： 光吸收定律的重要前提是入射光
仪器分析2-2紫外-可见吸收光谱分析法
例如：铌和钽都可与邻苯三酚生成二元络合物， 但是在草酸介质中，只有钽能与邻苯三酚形成黄色的 钽-邻苯三酚-草酸三元络合物，铌则不能形成类似的 三元络合物，因而提高了反应的选择性。
显色反需考虑的因素 灵敏度； 选择性； 显色剂吸收干扰易排除； 反应生成的有色化合物组成恒定、化学性质稳定。
2.6.2显色反应的选择 2.6.2.1显色剂用量 显色反应一般可以用下式表示：
响因素：灯电压，如钨丝灯和卤钨灯； ☻ 气体放电光源:气体放电发光光源：紫外光区，375-
180nm，如 氢灯和氘灯(功率大4-5倍) ； ☻ 紫外-可见分光光度计测定范围：185nm～1000nm 。
光源 分光系统 吸收池 检测系统 记录系统
2.5.2 分光系统 ☻ 将来自光源的光按波长的长短顺序分散为单色光，并
（2） 双光束分光光度计
通过一个快速转动的扇形镜将经单色器的光一分为 二，然后用另一个扇形镜将脉冲辐射再结合进入换能器 ，即两光束同时分别通过参照池和测量池。
特点：消除、补偿光源和检测器的不稳定，精确度高。
单色器
吸 收 池
吸
信号记录
收
处理系统
池
检测器
（3） 双波长分光光度计
由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个 单色器，得到两个不同的单色光（λ1、λ2），它们 交替地照射同一溶液，然后经过光电倍增管和电子控
2.4共轭烯烃λmax的经验计算
2.4.1链状共轭烯烃λmax的计算（Woodward经验规则） 母体为C=C-C=C，λmax的基本值为217nm； 增加一个特殊的取代基，λmax红移的值如下：
烷基：+5nm 卤素：+17nm 2.4.2单环共轭烯烃λmax的计算（Woodward经验规则） 母体为
显色反需考虑的因素 灵敏度； 选择性； 显色剂吸收干扰易排除； 反应生成的有色化合物组成恒定、化学性质稳定。
2.6.2显色反应的选择 2.6.2.1显色剂用量 显色反应一般可以用下式表示：
响因素：灯电压，如钨丝灯和卤钨灯； ☻ 气体放电光源:气体放电发光光源：紫外光区，375-
180nm，如 氢灯和氘灯(功率大4-5倍) ； ☻ 紫外-可见分光光度计测定范围：185nm～1000nm 。
光源 分光系统 吸收池 检测系统 记录系统
2.5.2 分光系统 ☻ 将来自光源的光按波长的长短顺序分散为单色光，并
（2） 双光束分光光度计
通过一个快速转动的扇形镜将经单色器的光一分为 二，然后用另一个扇形镜将脉冲辐射再结合进入换能器 ，即两光束同时分别通过参照池和测量池。
特点：消除、补偿光源和检测器的不稳定，精确度高。
单色器
吸 收 池
吸
信号记录
收
处理系统
池
检测器
（3） 双波长分光光度计
由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个 单色器，得到两个不同的单色光（λ1、λ2），它们 交替地照射同一溶液，然后经过光电倍增管和电子控
2.4共轭烯烃λmax的经验计算
2.4.1链状共轭烯烃λmax的计算（Woodward经验规则） 母体为C=C-C=C，λmax的基本值为217nm； 增加一个特殊的取代基，λmax红移的值如下：
烷基：+5nm 卤素：+17nm 2.4.2单环共轭烯烃λmax的计算（Woodward经验规则） 母体为
第2章 紫外可见光谱
3. n→ *跃迁 若形 成不饱和键的原子 含有杂原子（N、 S、P、O），则可 发生n→ * 跃迁
* * n → * → * n→ * →*
反键 反键
能 量
n
未成键 成键 成键
n→ *跃迁所需的能量较→ * 跃迁所需 的能量更小。吸收波长更长，但由于属跃 迁禁阻类型，吸收强度很小。如丙酮除有 → *跃迁外，还有n→ *跃迁，吸收波 长在280nm左右。
部吸收，它就呈现黑色；若反射所有
颜色的光则呈现白色；若透过所以颜 色的光，则为无色。
KMnO4溶液选择 性的吸收了525
nm附近的绿青色
光，而对与绿青
色光互补的400
nm附近的紫色光
几乎不吸收，所
以KMnO4溶液呈
紫红色。
此外，溶液颜色的深浅，决定于溶液
吸收光子的多少，即取决于吸光物质
浓度的高低。如CuSO4溶液的浓度愈高，
发射光谱
hv
无线电波 红外
分子 原子 原子核 分子光谱 原子光谱
紫外可见
紫外可见光谱 红外光谱
核磁共振波谱
核磁共振波谱
3
紫外可见分光光度法（紫外可见
吸收光谱法）是根据溶液中物质的分 子或离子对紫外-可见光谱区的辐射能
的吸收特征和强度对物质进行定性、
定量和结构分析的方法。
该方法具有较高的灵敏度和准确
波长（能量）顺序排列称为电磁波
谱（electromagnetic spectrum）。
15
电磁波谱按能量大小分为若干个区：
无线电波 1～1000 m
微波 10-3～1 m 红外 0.76～1000 m
可见 400～760 nm 紫外 10～400 nm
第二章 紫外-可见分光光度法
入射光通过溶液时，除一部分被吸光粒子吸收
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
第二章紫外-可见分光光度法(Ultraviolet-Visible
=40~80nm时，显色反应对比度为中等； 80nm时，显色反应具有较高的对比度。
一般要求显色剂与有色化合物的对比度 在60nm以上。
2. 对比度在实际分析测定中的意义 对比度实质上表示了显色反应颜色变化 的程度；反映了过量显色剂对测定体系的影 响。 如果显色反应的对比度大，则过量试剂 对测定的影响较小；反之，对比度小，则试 剂对测定的影响就比较大。
2.2 分子吸收光谱概述 1．分子吸收光谱产生的本质 在分子中，除了原子的核能En，质心在 空间的平动能Et外，还有电子运动能Ee，原 子之间的相对振动能Ev，以及分子转动能Er 等。 分子的总能量可写为： E=En + Et + Ee+ Ev+ Er
由于En在一般化学实验条件下不发生变 化，分子的平动能Et又比较小，因此当分子 能级发生跃迁时，能量的改变为： E=Ee + Er +Ev
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
量相对较小，吸收峰位于近紫外区甚至可见 区，对于紫外-可见分析具有实用意义。
n→*、→*跃迁区别：
n→*（，10~
100L/mol· cm）跃迁产生的 吸收峰强度低于→*（，104L/ mol· cm）；
随着溶剂极性的增加，→*跃迁所产生的
c的单位为g· L-1，b的单位为cm时，κ以a表示，称为吸 光系数，其单位为L· g-1· cm-1， A=abc。
c的单位为mol· L-1，b的单位为cm，κ用ε表示，称为摩尔 吸光系数，其单位为L· mol-1· cm-1， A=εbc。
摩尔吸光系数ε的讨论：
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 （2）不随浓度c和液层厚度b的改变而改变。 在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的 性质有关，与待测物浓度无关；
一般要求显色剂与有色化合物的对比度 在60nm以上。
2. 对比度在实际分析测定中的意义 对比度实质上表示了显色反应颜色变化 的程度；反映了过量显色剂对测定体系的影 响。 如果显色反应的对比度大，则过量试剂 对测定的影响较小；反之，对比度小，则试 剂对测定的影响就比较大。
2.2 分子吸收光谱概述 1．分子吸收光谱产生的本质 在分子中，除了原子的核能En，质心在 空间的平动能Et外，还有电子运动能Ee，原 子之间的相对振动能Ev，以及分子转动能Er 等。 分子的总能量可写为： E=En + Et + Ee+ Ev+ Er
由于En在一般化学实验条件下不发生变 化，分子的平动能Et又比较小，因此当分子 能级发生跃迁时，能量的改变为： E=Ee + Er +Ev
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
量相对较小，吸收峰位于近紫外区甚至可见 区，对于紫外-可见分析具有实用意义。
n→*、→*跃迁区别：
n→*（，10~
100L/mol· cm）跃迁产生的 吸收峰强度低于→*（，104L/ mol· cm）；
随着溶剂极性的增加，→*跃迁所产生的
c的单位为g· L-1，b的单位为cm时，κ以a表示，称为吸 光系数，其单位为L· g-1· cm-1， A=abc。
c的单位为mol· L-1，b的单位为cm，κ用ε表示，称为摩尔 吸光系数，其单位为L· mol-1· cm-1， A=εbc。
摩尔吸光系数ε的讨论：
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 （2）不随浓度c和液层厚度b的改变而改变。 在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的 性质有关，与待测物浓度无关；
紫外-可见吸收光谱法
基团 －COOR 跃迁类型 π→π* n→π* λmax 165 205
对于有机化合 物最有用
εmax(L/mol· cm) 4000 50
33
常用术语
1）生色团
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
能产生紫外-可见吸收的官能团，是含有非键轨道和π分子 轨道的电子体系。能引起ｎ→ π* 和π→π*跃迁
C C C C O
C O N O
34
37
2) 共轭不饱和烃
CH2=CH-CH=CH-CH=CH2: λmax= 258nm
38
3) 羰基化合物
R C Y O
K带： π→π*跃迁，强吸收（共轭体系中） R带：n →π*跃迁，弱吸收（生色团或助色团中）
39
基团结构
－C=O
π→π*
n→π*
λmax(nm)
166
λmax(nm)
280
－C=C－C=O －C=C－C=C－C=O
2) 助色团
是能使生色团吸收峰向长波方向位移并增强其强度的官 能团，是带有非键电子对的基团。含有孤电子对，能与生色 团中π电子相互作用，使π→π*跃迁能量降低并引起吸收峰 位移。 –OH, –NH2, –SH及卤族元素
3) 红移和蓝移 (或紫移)
红移：某些有机化合物经取代反应引入某些基团后，吸 收峰的波长λmax向长波方向移动。 蓝移(紫移)：吸收峰的波长λmax向短波方向移动。
质吸收光能，透过溶液后光线的强度要减弱。
I0 It
s I0 Ix I
dx abc
12
透光度和吸光度
透过光强度I与入射光强度I0之比（以T表示）称为透光率
或透光度：
T I I0
（2－1）
T越大，表示它对光的吸收越小。透光率倒数的对数称为 吸光度A。A代表了溶液对光的吸收程度，为无因次量 。
对于有机化合 物最有用
εmax(L/mol· cm) 4000 50
33
常用术语
1）生色团
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
能产生紫外-可见吸收的官能团，是含有非键轨道和π分子 轨道的电子体系。能引起ｎ→ π* 和π→π*跃迁
C C C C O
C O N O
34
37
2) 共轭不饱和烃
CH2=CH-CH=CH-CH=CH2: λmax= 258nm
38
3) 羰基化合物
R C Y O
K带： π→π*跃迁，强吸收（共轭体系中） R带：n →π*跃迁，弱吸收（生色团或助色团中）
39
基团结构
－C=O
π→π*
n→π*
λmax(nm)
166
λmax(nm)
280
－C=C－C=O －C=C－C=C－C=O
2) 助色团
是能使生色团吸收峰向长波方向位移并增强其强度的官 能团，是带有非键电子对的基团。含有孤电子对，能与生色 团中π电子相互作用，使π→π*跃迁能量降低并引起吸收峰 位移。 –OH, –NH2, –SH及卤族元素
3) 红移和蓝移 (或紫移)
红移：某些有机化合物经取代反应引入某些基团后，吸 收峰的波长λmax向长波方向移动。 蓝移(紫移)：吸收峰的波长λmax向短波方向移动。
质吸收光能，透过溶液后光线的强度要减弱。
I0 It
s I0 Ix I
dx abc
12
透光度和吸光度
透过光强度I与入射光强度I0之比（以T表示）称为透光率
或透光度：
T I I0
（2－1）
T越大，表示它对光的吸收越小。透光率倒数的对数称为 吸光度A。A代表了溶液对光的吸收程度，为无因次量 。
仪器分析-紫外可见光光谱分析
1,3,5-己三烯
正己烷
258
n=4
1,3,5,7-辛四烯
环己烷
304
不共轭双键不发生红移。
C=O双键同C=C双键的共轭作用使n→*和→*跃迁的吸收峰都发生红移。
3）溶剂效应
01
02
03
04
05
极性溶剂使π-π*跃迁发生红移。
pH值
Note: 测UV-Vis应注明溶剂
pH增大，苯酚π-π*吸收带发生红移。
1
2
特点：灵敏度高，实际工作中常用。
1
常将M与某L（显色剂）生成具有电荷迁移的配合物，然后进行含量测定。
2
－* 跃迁 配体具有双键的金属络合物
3
2.3光的吸收定律
郎伯-比尔（Lambert-Beer ）定律 入射光强度 吸光强度 反光强度 透光强度 ＋ IS 散射光强度 均匀溶液，散射光小，可忽略
由于n—π共轭参与，使分子整体共轭效应增强。
取代基 苯环或烯烃（吸电子基）上的H被各种取代基取代，多发生红移。 空间异构
蓝移（紫移）：使化合物的吸收波长向短波方向移动效应。 影响蓝移因素： 1）溶剂效应 极性溶剂使n-π*跃迁发生蓝移 2）pH值 pH值减小，苯胺的π-π*吸收带蓝移n—π共轭参与少，使分子整体π共轭效应减少。
分子转动－转动能级(rotation)
分子整体能级 E=Ee+Ev+Er
01
03
02
04
05
分子从基态能级跃迁到激发态能级
当有一频率v , 如果辐射能量hv恰好等于该分子较高能级与较低能级的能量差时，即有：
激发态
基态
ΔE电=1-20eV ΔE振=0.05-1eV ΔE转 在分子能级跃迁所产生的能量变化，电子跃迁能量变化最大，它对应电磁辐射能量主要在区紫外—可见区。
正己烷
258
n=4
1,3,5,7-辛四烯
环己烷
304
不共轭双键不发生红移。
C=O双键同C=C双键的共轭作用使n→*和→*跃迁的吸收峰都发生红移。
3）溶剂效应
01
02
03
04
05
极性溶剂使π-π*跃迁发生红移。
pH值
Note: 测UV-Vis应注明溶剂
pH增大，苯酚π-π*吸收带发生红移。
1
2
特点：灵敏度高，实际工作中常用。
1
常将M与某L（显色剂）生成具有电荷迁移的配合物，然后进行含量测定。
2
－* 跃迁 配体具有双键的金属络合物
3
2.3光的吸收定律
郎伯-比尔（Lambert-Beer ）定律 入射光强度 吸光强度 反光强度 透光强度 ＋ IS 散射光强度 均匀溶液，散射光小，可忽略
由于n—π共轭参与，使分子整体共轭效应增强。
取代基 苯环或烯烃（吸电子基）上的H被各种取代基取代，多发生红移。 空间异构
蓝移（紫移）：使化合物的吸收波长向短波方向移动效应。 影响蓝移因素： 1）溶剂效应 极性溶剂使n-π*跃迁发生蓝移 2）pH值 pH值减小，苯胺的π-π*吸收带蓝移n—π共轭参与少，使分子整体π共轭效应减少。
分子转动－转动能级(rotation)
分子整体能级 E=Ee+Ev+Er
01
03
02
04
05
分子从基态能级跃迁到激发态能级
当有一频率v , 如果辐射能量hv恰好等于该分子较高能级与较低能级的能量差时，即有：
激发态
基态
ΔE电=1-20eV ΔE振=0.05-1eV ΔE转 在分子能级跃迁所产生的能量变化，电子跃迁能量变化最大，它对应电磁辐射能量主要在区紫外—可见区。
紫外可见分光光度法课件
第二章 紫外-可见分光光度法
1
紫外-可见分光光度法
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱（UV-VIS光谱）
• 起源：价电子能级跃迁 由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分
子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生。 紫外光谱—又称为电子光谱—分子吸收光谱
问题1：为何UV-Vis光谱吸收带都比较宽??
pH值降低（加酸）→ E2、B带蓝移，ε减
pH值增大（加碱）→E2、B带红移，ε增大
6
第二节 紫外可见分光光度计
• 仪器校正
1、波长校正
• 苯的吸收峰校正波长（紫外光区）。在25ml容量瓶内，滴入一滴苯(A.R.)， 用无水乙醇稀释至刻度，摇匀后，以无水乙醇为空白，在200～280nm间用 lcm石英池测定吸收度。 如下： 229.2 233.5 238.9 243.2 248.5 254.5 260.6 268.4
图8-4 (+)和(-)丁醇-2的ORD谱线
2）发色团(如羰基) R带：270 nm 。ORD曲线在此处越过零点，进入另一个相
区。形成的一个峰和一个谷组成的ORD谱线—Cotton效应谱线 正的Cotton效应：当波长由长波一端向短波一端移动时， ORD谱线由峰向谷变化 负的Cotton效应： ORD谱线由谷向峰变化 ORD谱线与零线相交点的波长称为λK
2.3.1 蛋白质的圆二色性
在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键， 芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的 生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的 吸收不相同，产生吸收差值。由于这种吸收差的存在， 造成了偏 振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质 的圆二色性。
1
紫外-可见分光光度法
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱（UV-VIS光谱）
• 起源：价电子能级跃迁 由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分
子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生。 紫外光谱—又称为电子光谱—分子吸收光谱
问题1：为何UV-Vis光谱吸收带都比较宽??
pH值降低（加酸）→ E2、B带蓝移，ε减
pH值增大（加碱）→E2、B带红移，ε增大
6
第二节 紫外可见分光光度计
• 仪器校正
1、波长校正
• 苯的吸收峰校正波长（紫外光区）。在25ml容量瓶内，滴入一滴苯(A.R.)， 用无水乙醇稀释至刻度，摇匀后，以无水乙醇为空白，在200～280nm间用 lcm石英池测定吸收度。 如下： 229.2 233.5 238.9 243.2 248.5 254.5 260.6 268.4
图8-4 (+)和(-)丁醇-2的ORD谱线
2）发色团(如羰基) R带：270 nm 。ORD曲线在此处越过零点，进入另一个相
区。形成的一个峰和一个谷组成的ORD谱线—Cotton效应谱线 正的Cotton效应：当波长由长波一端向短波一端移动时， ORD谱线由峰向谷变化 负的Cotton效应： ORD谱线由谷向峰变化 ORD谱线与零线相交点的波长称为λK
2.3.1 蛋白质的圆二色性
在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键， 芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的 生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的 吸收不相同，产生吸收差值。由于这种吸收差的存在， 造成了偏 振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质 的圆二色性。
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目视比色法
• 用眼睛观察、比较溶液颜色深度以确定物质含量的方法。 标准系列
未知样品
光电比色法(分光光度法）
• 通过滤光片得一窄范围的光(几十nm)
光电比色计结构示意图
二、紫外-可见分光光度法的特点
• 1.具有较高的灵敏度和一定的准确度，适用于微量组分的测定。
• 2.适用范围广 • 近年来，由于分光光度法的选择性和灵敏度都有所提高，几乎所有的
第四节 紫外-可见分光光度计
光源
参比
样品
0.575
单色器
吸收池
检测器
信号显 示系统
I0
AlgTlg1lgI0 bc T It
It
1.光源
• 光源的作用是供给符合要求的入射光。分光光度计对光源 的要求是：在使用波长范围内提供连续的光谱，光强应足 够大，有良好的稳定性，使用寿命长。
• 在可见区常用的光源为钨灯或卤钨灯，可用的波长范围为 320～1000nm；在紫外区常用的光源为氢灯和氘灯，它们 发射的连续光波长范围为185～375nm，其中氘灯的辐射 强度大、稳定性好、使用寿命长。
1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。
5、吸光系数
• 吸光系数是吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 • 吸光系数的特点 • （1）不随浓度和液层厚度的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，吸光
系数仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关，可作为定性鉴定的 参数。 • （2）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的，在最大吸收波长λmax处 的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该物质最大限度的吸光能力， 也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。 • （3）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越 高。εmax＞6×104L/(mol·cm)属于高灵敏度；εmax在1×104～6×104 L/(mol·cm)属于中等灵敏度，εmax＜1×104L/(mol·cm)属于低灵敏度。
• 如果把适当颜色的两种光按一定强度比例混合，也可成为 白光，这两种颜色的光称为互补色光。
红 紫
蓝
白
青蓝 青
橙 黄
绿
三、溶液颜色的产生
• 溶液颜色是基于物质对光有选择性吸收的结果。
光谱示意
表观现象示意
完全吸收
完全透过
吸收黄色光
四、溶液的吸收光谱曲线
• 吸收光谱曲线是通过实验获得的，具体方法是：将不同波 长的光依次通过某一固定浓度和厚度的有色溶液，分别测 出它们对各种波长光的吸收程度（用吸光度Ａ表示），以 波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，画出曲线，此曲 线即称为该物质的光吸收曲线（或吸收光谱曲线），它描 述了物质对不同波长光的吸收程度。
• 一、朗伯-比耳定律 • 1、透光度和吸光度
入射光 I0
透射光It
• 当一束辐射强度为I0的平行单色光垂直照射到一定浓度的均匀透明溶液时，
由于溶液的吸收，透过光的辐射强度变为It,则It与I0之比称为透光度，用T表
示：
T It I0
• 物质对光的吸收程度可用吸光度A表示，吸光度与光强度、透光度之间的关
无机物质和许多有机物质的微量成分都能用此法进行测定。 • 3.手续简便，分析速度快，适用于控制分析 • 分光光度法的操作过程，主要包括试样的溶解，待测组分的显色等内
容，操作简便，完成吸光光度分析的全过程一般只需几十分钟，甚至 可在几分钟内完成，适合于控制分析。 • 4.仪器简单，容易掌握 • 但吸光光度分析也有一定的局限性，对超纯物质的分析，灵敏度达不 到要求，相对误差较大，不利于高含量组分的测定。
• 当溶液的浓度为质量浓度单位g/L时，其数学表达式为 • A=abc • 式中：a为质量吸光系数，L/(g·cm)，相当于浓度为1g/L、液层厚度为1cm
时该溶液在某一波长下的吸光度。 • 当溶液的浓度单位为mol/L时，其数学表达式为 • A=εbc • 式中：ε为摩尔吸光系数，L/(mol·cm)，相当于浓度为1mol/L,液层厚度
• 当它们吸收一定能量ΔE后，这些价电子将跃迁到较高的能级（激发态），此 时电子所占的轨道称为反键轨道，而这种特定的跃迁是同分子内部结构有着 密切关系的。
• （1）σ→σ＊跃迁 • 所需能量最大。 • σ＊表示σ键电子的反键轨道，饱和碳氢化合物只有σ键电子，
它吸收远紫外线（10-200nm）后，由基态跃迁至反键轨道。 • （2）n→σ＊跃迁 • 所需能量较大。 • 饱和碳氢化合物中氢被氧、氮、硫、卤素等取代后（单
• 例2：铁（Ⅱ）浓度为2.5×10-4g/L的溶液，与邻菲罗啉反 应，生成橙红色络合物。该络合物在波长508nm，比色皿 厚度为2cm时，测得 A=0.15。计算邻菲罗啉亚铁的 a及ε, 铁的相对原子质量为55.85g/mol。
ab Ac 220 .5 .115 0 430L0 /g (cm ) 5.5 8 5300 1.671 640 L/m ( o cm l)
• 例1：已知含Fe3+浓度为500μg·L-1的溶液用KCNS显色， 在波长480nm处用2cm吸收池测得A＝0.197，计算摩尔吸 光系数，铁的相对原子质量为55.85g/mol。
c(F3e)501 0 068.9 51 06(moL l1) 5.5 85
b Ac8.90 5.1 1 9 06721.1140(Lm o1lcm 1)
• 利用比较待测溶液本身的颜色或加入试剂后呈现的颜色的 深浅来测定溶液中待测物质的浓度的方法就称为比色分析 法。比色分析中根据所用检测器的不同分为目视比色法和 光电比色法。
• 应用分光光度计，根据物质对不同波长的单色光的吸收程 度不同而对物质进行定性和定量分析的方法称分光光度法 （又称吸光光度法）。
级间距离较近，电子容易激发，吸收波长向长波长方向移动。 • （4）n→π＊跃迁 • 所需能量最低。 • 凡有机化合物中含有杂原子氮、氧、硫等同时又具有双键，吸收紫外
光后产生n→π＊跃迁，吸收带在200-400nm之间，为弱吸收，ε在10100之间。
• 上述四种类型的电子跃迁，按照所需能量的大小进行排列，其次序为： • σ→σ※> n→σ※>π→π※> n→π※
系为：
AlgTlg1lgI0 T It
• 2、朗伯定律
• 即当一束平行光照射到一固定浓度的溶液时，其吸光度
与光通过的液层厚度成正比，这就是朗伯定律，其数学
表达式为：
• A=k1b • 式中：b——液层厚度；
•
k1——比例系数。
• 3、比耳定律
• 当单色光通过液层厚度一定的有色溶液时，溶液的吸光度
第二章 紫外-可见 光谱分析法
第一节 概述
• 紫外-可见光谱分析法是基于物质分子对波长为 200-780nm区域内光辐射的吸收而建立起来的 分析方法。由于200-780nm光辐射的能量主要 与物质中原子的价电子的能级跃迁相适应，所以 紫外-可见分光光度法又称电子光谱法。
一、紫外-可见分光光度法分类
1、入射光非单色性引起偏离
• 吸收定律成立的前提是入射光是单色光。但实际上， 一般单色器所提供的入射光并非是纯单色光，而是 由波长范围较窄的光带组成的复合光。而物质对不 同波长的吸收程度不同（即吸光系数不同），因而 导致了对吸光定律的偏离。
2、溶液的化学因素引起偏离
• 溶液中的吸光物质因离解、缔合，形成新的化合 物而改变了吸光物质的浓度，导致偏离吸收定律。 因此，测量前的化学预处理工作十分重要，如控 制好显色反应条件，控制溶液的化学平衡等，以 防止产生偏离。
键），其孤对电子 n较σ键电子易于激发，使电子跃迁所需 能量减低，吸收波长较长，一般在1→π＊跃迁 • 所需能量较小。 • 含有π电子的基团如烯类、炔类都能发生π→π＊跃迁，非共轭的π→π＊
跃迁所吸收的波长较短。 • 具有共轭双键的化合物，相间的π键与π键形成大π键，由于大π键各能
• 4、溶剂效应 • 由于溶剂的极性不同引起某些化合物的吸收峰的波长、强
度及形状产生变化，这种现象称为溶剂效应。一般溶剂效 应有以下规则：当溶剂由非极性变为极性时，对于n→π＊ 跃迁类型化合物，吸收产生蓝移，并且吸收强度增大，对 于π→π＊跃迁类型的化合物，吸收产生红移，并且吸收强 度减弱。
第三节 光的吸收定律
要用于多组分同时测定。
二、影响光吸收定律的主要因素
• 根据吸收定律，在理论上，吸光度对溶液浓度作图所得的 直线的截距为零，斜率为εb。实际上吸光度与浓度关系有 时是非线性的，或者不通过零点，这种现象称为偏离光吸 收定律。
• 如果溶液的实际吸光度比理论值大，则为正偏离吸收定律； 吸光度比理论值小，为负偏离吸收定律。
高锰酸钾的光吸收曲线
• （1）KMnO4溶液对不同波长的光的吸收程 度不同，对绿色光区中 525nm的光吸收程度 最大（此波长称为最大吸收波长，以λmax表 示），所以吸收曲线上有一高峰。在进行光 度测定时，通常都选择在λmax处来测量，这 时可得到最大的灵敏度。
• （2）不同浓度的 KMnO4溶液吸收曲线相似， λmax不变。所不同的是吸收峰峰高随浓度的 增加而增高。这个特性可作为物质定量分析 的依据。
3、比尔定律的局限性引起偏离
• 严格地说，比尔定律是一个有限定律，它只适用于浓度小 于0.01mol/L的稀溶液。因为浓度高时，吸光粒子间平均 距离减小，以致每个粒子都会影响其邻近粒子的电荷分布。 这种相互作用使它们的摩尔吸光系数ε发生改变，因而导 致偏离比尔定律。为此，在实际工作中，待测溶液的浓度 应控制在0.01mol/L以下。
2、紫外吸收光谱中常用的术语
• 1、生色团（或发色团） • 分子中含有不饱和键，能吸收外来辐射时并引起n-*和-*跃迁，可
产生此类跃迁或吸收的结构单元，称为生色团。 • 如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—CN。 • 2、助色团 • 含有未成键n电子，本身不产生吸收峰，但与生色团相连时，能使生