黑龙江大学生物药物分析期末复习

生物药物分析总结

运用各种技术、手段（包括化学的、生物的及物理的或彼此间交叉的技术手段）结合统计分析方法解决药品质量控制问题

主要包括药品质量标准的建立问题和标准的执行问题，前者涵盖药品研发、生产、使用各个环节的知识以及社会整体技术水平和人员素质等综合问题，后者主要涉及对质量标准的理解和操作技能问题

1药品质量标准的形式与内容

1.1药品质量标准的形式、类别

1.1.1 中华人民共和国药品国家标准，其他国家或地区的药品标准

药品标准：国家标准；企业标准

●国家标准：

1.中国药典（疗效确切、广泛应用、质量可控）

2.药品注册标准：临床研究用标准；生产上市用标准；SFDA颁布的其他药品标准

●企业标准：

可使用非成熟(非法定)方法标准规格高于法定标准

1.1.1.1 中华人民共和国药典，美国药典，英国药典，欧洲药典，日本药局方等主要形式

中华人民共和国药典：

2010年版药典共收载4567种，新增1386种。

?一部2165种：药材，饮片，植物油脂，提取物，成方制剂，单味制剂

?二部2271种：化学药品，生化药品，抗生素，放射性药品，药用辅料

?三部131种：生物制品，预防药，医疗药，体内诊断药

●药典内容

凡例（General Notices)；正文（Monographs)；附录（Appendices)；索引(Index)

●凡例（General Notices)

——为正确理解和使用药典所作的解释和说明，对正文品种、附录及质量检定中有关的共性问题加以规定。例：

●正文（Monographs)

——为收载药品或制剂的质量标准

?一部：品名目次，药材及饮片，植物油脂和提取物，成方制剂和单味制剂

?二部：品名目次，正文品种第一部分，正文品种第二部分（药用辅料）

?三部：目次，通则，各论

?USP（美国药典）

凡例:为解释和准确使用药典提供基本指导

正文:正文收载的药物品种数为世界第一。内容按英文字母排序，制剂在原料药后。

附录:内容相当丰富，除一般检查分析外，还附有“一般信息”。

?英国药典（BP）2011版共6卷；

测试方法；红外光谱参考；补充资料；收载欧洲药典品种。

?日本药局方JP（第十五改正版）（The Japanese Pharmacopoeia）

分为一部和二部：

一部收载化学药品，抗生素，放射性药品及制剂

二部收载生药，生物制品，附加剂等

两部均附有药品红外光谱图

索引（日文名，英文名，拉丁名）

抗生素另有详细标准（JP中只有名称，结构和性状）

1.1.1.2 国家食品药品监督管理局颁布的其他药品国家标准，美国国家处方集等补充形式。

1.1.2企控标准，地方标准（主要是中药材的炮制规范，其他类别的药品地方标准已取消）

GLP：（药品非临床研究质量管理规范）Good Laboratory Practice

GMP:（药品生产质量管理规范）Good Manufacture Practice）

GSP:（药品经营质量管理规范）Good Supply Practice

保证医药商品进、存、销环节的药品质量

GCP:（药品临床试验管理规范）Good Clinical Practice

确保实验资料的真实性、完整性和可靠性，用于为申请药品注册而进行的非临床研究1.2 药品质量标准的主要内容

1.2.1 技术要求

1.2.1.1 检验项目：

概括为：鉴别；检查和含量（或效价）测定

检查分为：杂质检查，安全性检查等。一般杂质、特殊杂质

●一般杂质：

指在自然界中分布广泛,在多种药物的生产或贮存过程中容易引入的杂质。如氯化物、硫酸盐、铁盐、重金属、砷盐、酸、碱、水分、易炭化物、炽灼残渣ignited residue等。●特殊杂质：

指在该药物的生产或贮存过程中,根据药物的性质、生产方法和工艺条件,有可能引入的杂质。如阿司匹林中的游离水杨酸、异烟肼中的游离肼、甾体激素中的其他甾体。

五、药物中杂质的来源

1. 生产过程中引入

（1）原料、反应中间体及副产物

（2）试剂、溶剂、催化剂类

（3）生产中所用金属器皿、装置以及其他不耐酸、碱的金属工具所带来的杂质

例如：

1.阿斯匹林由水杨酸乙酰化制得,乙酰化不完全水杨酸(杂质)

2.制剂过程中可能产生新物质

制备过程中加热灭菌进一步脱羧转化盐酸

普鲁卡因注射剂对氨基苯甲酸苯胺(引起毒性反应)

2. 贮藏过程中产生

水解、氧化、分解、异构化、晶形转变、聚合、潮解和发霉等

例1:麻醉乙醚在日光、空气及湿气作用下, 易氧化分解为醛及有毒的过氧化物. 1.2.1.2 质量指标

1.2.1.2.1鉴别为定性项目，通常以出现阳性反应或与药品标准物质对照现象一致等表述方式；

1.2.1.2.2检查为定性或半定量项目：杂质限度的计算方法及怎样判断杂质限度是否合格； 1.2.1.2.3含量（或效价）测定属于定量项目： 原料药的含量（或效价）表示方法、合格范围及计算方法（要结合具体采用的分析试验方法）。药物制剂的含量（或效价）表示方法、合格范围及计算方法（要结合具体采用的分析试验方法）

1.2.2 分析试验的方法及技术

1.2.2.1 杂质检查常用方法及技术:

1.2.2.1.1杂质限度控制方法： 标准对照法，灵敏度法，比较法 ● 标准对照法 reference method

特点：不需知道杂质的准确含量，但需要杂质的对照品。

操作:

平行试验?比较两比色管的颜色或浊度,判断杂质限量是否符合规定. ●

2. 灵敏度法 sensitivity method

系指在供试品溶液中加入试剂，在一定反应条件下，不得有正反应出现。 特点：不需杂质对照品

如：蒸馏水中氯化物的检查

● 3. 比较法 comparative method

取一定量供试品,在规定条件下测定待检杂质吸光度、pH 值等。 与规定限量比较, 判断供试品中杂质限量.

特点：能给杂质定量，不需对照品。 ◆ 杂质限量计算问题

[例题]肾上腺素中酮体的检查：取本品0.2g, 置100m 容量瓶中，加盐酸溶液（9 2000）溶解并稀释到刻度，摇匀，310nm 处测得的A ≯0.05, 已知肾上腺酮的E=435 , 求肾上腺素中肾上腺酮的限量。

◆ （三）、 杂质限量的计算

供试品量允许杂质存在的最大量杂质限量=?=杂质标准溶液体积标准溶液浓度

杂质限量供试品量

%

100??=

S

c V L 6

ppm 10

??=

S

c V L

[例题]检查某药物中的砷盐，取标准砷溶液2ml （每1ml 相当于1μg 的As ）制备标准砷斑，砷盐限量为0.0001％，应取供试品的量为 （ B ）

A. 0.20g

B. 2.0g C ．0.020g D. 1.0g E. 0.10g

已知：c ＝1 μg/ml ＝1×10-6

g/ml V ＝2ml L ＝0.0001%

S=2.0g

[例题]检查维生素C 中的重金属时，若取样量为1.0g ，要求含重金属不得过百万分之十，问应吸取标准铅溶液（每1ml ＝0.01mg 的Pb ）多少ml ？ （ D ） A. 0.2ml B. 0.4ml C ．2ml D. 1ml E. 20ml

[例题]内消色法检查某药品中的氯化物： 取供试品0.3g ，加水溶解，加稀硝酸10ml, 用200mL 容量瓶定容。

取该溶液两份，分置于50mL 纳氏比色管中，一份中加硝酸银试液1.0mL, 摇匀，放置10min, 显浑浊，反复滤过，至滤液完全澄清，再加入规定量的标准氯化钠溶液（含氯10μg/mL) 3.0mL 与水适量定容, 作为对照液。

另一份中加硝酸银试液1.0mL, 与水适量使成50mL ，按上述方法与对照液平行对照测定。求该药物中氯化物的限量。

? L=C*V/S=10×10-6×3.0×100%/ （0.3×50/200) =0.04%

1.2.2.1.2 杂质限度检查常用技术手段

一般杂质检查：化学分析方法（常用标准对照法或灵敏度法），原子吸收分光光度法（测定药物中重金属等金属杂质）等； 特殊杂质检查：

a.紫外-可见分光光度法：例如，用比较法检查肾上腺素中肾上腺酮。

b.TLC 技术，HPLC 技术：二者常用标准对照法控制药物中特殊杂质， 标准对照法通常包括：杂质对照品法，供试品（主成分）自身对照法，标准药物对照法。 ● 薄层色谱法(TLC)

根据药物与杂质对吸附剂的吸附或对展开剂的解析能力不同(R f 值的差异), 加以分离和检查.

? 本法灵敏、简便、快速； ? 不需特殊的设备、费用低； ? 分离和鉴定同步进行. ●

2.薄层色谱法应用 1) 杂质对照品法

——适用于杂质已知并有杂质对照品的情况.

方法:根据杂质限量, 取供试品溶液和一定浓度的杂质对照品溶液,分别点于同一薄层板上展开,定位后进行检查

.

ml 110

100

.1101066=???=?=

--c S L V

盐酸普鲁卡因注射液中氢化可的松中“其他甾体”检查对氨基苯甲酸检查实验结果图

2)供试品自身对照法

——适用于杂质的结构不能确定或无杂质对照品的情况.

例：氢化可的松中“其他甾体”检查

供试液:3mg/ml对照液:60 g/ml(供试液稀释50倍)

判断:供试液的杂质斑点数≯3个,且供试液的杂质斑点颜色≯对照液主斑点颜色.

3) 标准药物对照法

——选用质量符合规定的与供试品相同的药物作为对照品.

●阴、阳对照法图1

?阳性对照：将要鉴别的药材按制剂工艺处理，再按鉴别方法提取的溶液

?阴性对照：把制剂中要鉴别的药材除去，用剩下的各味药按制剂工艺处理，再按

鉴别方法提取的溶液

图1 图2

图2 大补阴丸黄柏的TLC法鉴别

黄连、黄柏、三颗针中均有小檗碱。西药盐酸黄连素等

?含有丹皮酚paeonol 的中药就一定含有牧丹皮（丹皮）吗？

?牡丹皮，白芍，赤芍等药材中均含有丹皮酚。

●(二) 高效液相色谱法(HPLC)

根据供试品与杂质的对照品保留时间相同测定各杂质峰面积.

分离效能高、应用范围广，能准确、快速、分离分析同时进行.

1. 峰面积归一化法

2. 不加校正因子的主成分自身对照法

3. 加校正因子的主成分自身对照法

4. 加校正因子的内标法

5. 外标法

●(三)气相色谱法(GC)

——用于药物中挥发性杂质的检查, 如药物中残留溶剂、农药残留量等.

检查方法:同高效液相色谱法.

●光谱法spectrophotometry

(一) 紫外分光光度法

(二)可见分光光度法

（三）原子吸收分光光度法

（四）荧光分析法

?紫外分光光度法

——利用药物和待检杂质对光选择吸收性质的差异进行.

例1: 肾上腺素中肾上腺酮的检查

1.药典中的杂质检查按照操作方法不同可分为下列三种类型、、。

2.药物中存在的杂质，主要来源于两个方面，即和。

3.药物中微量的氯化物在酸性条件下与反应，生成氯化银的胶体微粒而显白色浑浊，与一定量的标准氯化钠溶液（浓度为）在相同条件下产生的氯化银浑浊程度比较，判断供试品中氯化物是否符合限量规定。

4. 肾上腺素中肾上腺酮的检查：称取肾上腺素0.250g，置于25mL量瓶中，加0.05mol/L盐酸液至刻度，量取5mL置另一25mL量瓶中，用0.05mol/L盐酸液稀释至刻度，用此液照分光光度法，在310nm处测定吸收度，不得大于0.05，问肾上腺素的限量是多少？（以百分表示，肾上腺素Ecm1% =453）

5.胃复康中检查二苯羟基乙酸的方法如下：取本品0.5g，酸性下用乙醚提取后蒸干，残渣用无水乙醇10mL溶解后，在258nm波长处测定吸收度，不得超过0.02,求胃复康中二苯羟基乙酸的限量（以百分表示，二苯羟基乙酸在258nm波长处的E1 %cm =19.7）

6.溴化钠中硫酸盐检查法如下：称取溴化钠0.5g，置50mL纳氏比色管中，加水使成约40mL，加稀盐酸2mL，加入25%氯化钡溶液5mL，用水稀释至刻度。精密吸取硫酸钾标准溶液（100μgSO42-/mL）2.0mL，依法检查，求溴化钠中的硫酸盐的限量为百分之几？

7.异戊巴比妥钠中重金属的检查：取本品1.0g，加水43mL溶解后，缓缓加稀盐酸3mL，随加随用强力振摇，滤过，弃取初滤液；取续滤液23mL，加醋酸盐缓冲液（pH3.5）2mL，依法检查，含重金属不得超过20ppm，求应取标准铅溶液（浓度为10μgPb2+/mL）多少mL？

c. 生化与分子生物学技术：例如，非还原SDS-PAGE检查基因工程多肽类药物中的杂蛋白等，DNA杂交技术检查基因工程药物中的外源DNA含量等。

安全性检查：微生物培养及技术，鲎试剂法检查细菌内毒素，热源试验等。

●安全性检查

包括：

?异常毒性检查

?热原检查

?升压物质检查

?降压物质检查

?致敏物质检查

一、异常毒性检查

是用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定体重的某种动物，观察其急性毒性反应，反应的判断以动物死亡与否为终点。

原理：

是用一定剂量的供试品注入小鼠体内或口服给药，在规定的时间内观察小鼠死亡情况。

二、热原检查

?热原检查法原理

将一定剂量的供试品溶液注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。

?操作方法

检查法：家兔三只，测定正常体温；耳缘静脉注射供试品液体，每隔30分钟测定体温一次，共6次，6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高度数。

判断：体温升高均低于0.6℃，并且三只家兔体温升高总和低于1.4℃。

复试：5只，体温升高0.6℃以上仅有一只，并且8只家兔体温升高总和低于3.5℃。

●宿主细胞DNA残留量测定方法

?概念:

供试品中的DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下，可与相匹配的单链DNA复性而重新结合成为双链DNA，称为杂交。将特异性DNA探针标记后，与吸附在固相膜上的供试品单链DNA杂交，并使用与标记物相应的显示系统显示杂交结果，与已知含量的阳性DNA对照对比后，可测定供试品中外源性DNA的含量。

?限量要求：

世界卫生组织(WHO)要求每一剂量药物中残余DNA含量不得超过100pg。

?我国《人用重组DNA制品质量控制要点》小于100pg／剂是安全的。

?基因工程药物中残余DNA的含量限度一般定为每一剂量＜100pg。

?测定原理

1．标记

DNA在随机启动标记前须经热变性。标记反应快速(1h)，其结果使新合成的DNA中每20～25个核苷酸掺入一个地高辛苷配基。(用于探针标记和阳性对照的DNA，由生产供试品用的传代细胞、工程菌或杂交瘤细胞提取纯化获得)

2．杂交

半抗原标记的DNA与硝酸纤维素膜或尼龙膜上DNA的杂交。

3．免疫检测

杂交后的滤膜上的半抗原标记DNA与抗体复合物（抗地高辛苷配基-碱性磷酸酶复合物）结合。酶促反应在碱性pH时进行，此时需加入无色的BCIP( 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)和NBT(氮蓝四唑)。数分钟后开始生成蓝色沉淀，并继续生成，直至3d。通常反应可以在24h后终止。

●宿主细胞蛋白质检查

宿主细胞蛋白质一般简称宿主蛋白，是指生产过程中来自宿主或培养基的残留肽等杂质。基因工程药物中的宿主蛋白含量，可用ELISA法(enzyme-linked immunosorbent assay)测定。

?测定原理

１包被：

在96孔细胞培养板中，以兔抗大肠杆菌肽组分(periplasmic E.coli peptides，简称PECP)抗体包被，4℃放置过夜（16～18小时），用洗涤液洗板3次．

２加样：

加入样品及PECP对照标准培养，37℃放置2小时．

３加抗体：

经洗涤后，加入抗PECP/HRP结合物(anti-PECP/HRP conjugate)[HRP为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)的简称]使其与固相抗体结合。

４检测：

结合的酶量用过氧化氢和四甲基联苯胺(3，3’5，5’tetra methylbenzidine，简称TMBZ)为底物进行测定。最后氧化的黄色产物于450nm波长处测定其吸收度，从而求出样品中宿主蛋白的含量。

1.2.2.2 含量（或效价）测定常用方法及技术

1.2.2.2.1 含量（或效价）测定常用定量方法： 标准曲线法；

对照品比较法（外标法）；

固定常数法（包括紫外-可见分光光度法中的吸收系数法；容量分析中根据化学反应计量关系所得的滴定度进行计算的方法）。

2．单组分的定量方法 1）吸收系数法（绝对法）：单色光很纯时采用 2）校正曲线法（标准曲线法）

必须使用相同仪器，且固定工作状态和测定条件，否则吸光度和浓度之间的关系就会偏离线性。

３）对照法（标准对照法）

Cx = (Ax / As)×Cs

Cs: 标准溶液的浓度。在相同仪器、相同波长下测定。标准物和试样为相同物质。 1）.吸光系数法（绝对法） 前提：单色光

[例题]精密称取B 12样品25.0mg ，用水溶液配成100ml 。精密吸取10.00ml ，又置100ml 容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm 的吸收池中，于361nm 处测定吸光度为0.507，求B 12的百分含量？(E 361nm =207) 解：

2）．标准曲线法

i

E C A mL g C i g W ???→???→?求含样过程：已知稀释)/(/)(l E A mL g C i ?=]100/[l A L mol C i ?=ε]/[或%

100%样?=

C C i i

mL g mL g C i /1045.2100/1045.21207507.053--?=?=?=mL g C /1050.2100

101001050.25

2

样

--?=??=%0.98%1001050.21045.2%100%55

样12=???=?=--C C B i 条件前提：固定仪器和测定

C A C K A ∝??=样

样同上条件

固定条件查得测定样品曲线~分别测定配制标准系列过程：C A A C A ??????→???????→?标

样

标样标

样

标样A A C C A A C C ?=

?

=

[例题]芦丁含量测定

3）．对照法 外标一点法

注：当样品溶液与标准品溶液的稀释倍数相同时

[例题] 维生素B 12的含量测定

精密吸取B 12注射液2.50mL ，加水稀释至10.00mL ；另配制对照液，精密称定对照品25.00mg ，加水稀释至1000mL 。在361nm 处，用1cm 吸收池，分别测定吸光度为0.508和0.518，求B 12注射液注射液的浓度以及标示量的百分含量（该B 12注射液的标示量为100 ug / mL ） 解：

a ）对照法

mL mg mL mL mL mg 250.3样品255~0标样/200.0分别移取→→标样与样品浓度相近

；截距为固定仪器和测定条件；

前提：0标

样和分别测定一定过程：A A →λS

i S i A A C C ?

=S

i

S i

A A m m ?=%100%?=m

m i i mL ug C C i i /5.24518

.0508.010********.25=???=

b ）吸光系数法

光谱分析仪器

研究吸收或发射的电磁辐射强度与波长关系的仪器称分光光度计。其组成图大致如下： 辐射源 → 分光系统 → 样品池 → 检测器 → 讯号处理及显示器 第二节 紫外-可见分光光度法及其在药物分析中的应用 一．基本原理和概念

UV -Vis 是研究物质在紫外-可见光区（UV : 200-400nm ，Vis: 400-800nm ）分子吸收光谱的分析方法

（一）UV-Vis 的常用概念

1．吸收光谱

吸收度或透光率与波长的关系曲线。

2.吸收峰及最大吸收波长λmax

3. 峰谷及最小吸收波长λmin

4. 肩峰(shoulder peak): 在一个吸收峰旁边产生的一个曲折。

5．末端吸收（end absorption ）：在图谱短波端呈现强吸收但不成峰形的部分。

（二）定量原理——Lambert-Beer 定律 A = -lgT = ECL

描述物质对单色光吸收的强弱与吸光物质的浓度与厚度间关系的定律。吸收系数可用于定性定量。

百分吸收系数： 指在一定波长下，溶液浓度为1%（W/V , g/ml ）, 溶液厚度为1cm 时的吸光度．

摩尔吸收系数ε： 指在一定波长下，溶液浓度为1mol/L, 溶液厚度为1cm 时的吸光度.

ε = (M /10)× ，M 为摩尔质量。 吸收系数的特点：

1）组分性质，温度，溶剂，λ一定时E 为常数；

2）不同物质在同一波长下E 可能不同（选择性吸收）；同一物质在不同波长下E 一定不同；

3）E ↑，物质对光吸收能力↑, 定量测定灵敏度↑；

4）吸收系数可作为定性、定量依据。

吸光度的加合性：混合组分的吸光度是各组分吸光度的和。（测定参比溶液的目的） 二．紫外-可见分光光度计 吸收池要求

光学玻璃吸收池：只能用于可见光区。

%

0.98%100标示量

5.210

%标示量12=??=

i C B 1

207508.010

50.2?=

?

??=

i i C l

E A

C mL

g C i /1.98μ=?%

1.98%100标示量%标示量12=?=i C B

熔融石英（氧化硅）吸收池：在紫外光区和可见光区都可用。 单光束分光光度计特点：

? 使用时来回拉动吸收池→移动误差 ? 对光源要求高；比色池配对 双光束分光光度计特点：

? 不用拉动吸收池，可以减小移动误差 ? 对光源要求不高 ? 可以自动扫描吸收光谱 双波长分光光度计特点：

? 两束不同波长的单色光交替通过同一试样溶液 ? 利用吸光度差值定量

? 消除干扰和吸收池不匹配引起的误差

例如：

青霉素钠（钾）的吸收度检查：取本品，加水制成每1ml 中含1.80mg 的溶液，照分光光度法，在280nm 的波长处测定吸收度，不得大于0.10；在264nm 的波长处有最大吸收，吸收度应在0.80~0.88。

此法中264nm 处吸收值用来控制青霉（钾）的含量，280nm 处吸收值用来控制杂质的量。

2．杂质限量的测定：

例：肾上腺素中微量杂质——肾上腺酮含量计算2mg/mL 的盐酸(0.05mol/L)溶液，λ 310nm 下测定规定 A310≤0.05 即符合要求的杂质限量≤0.06%

1.2.2.2.2 含量（或效价）测定常用技术手段：

a.容量分析（包括非水滴定法等）：准确度高，灵敏度低，适合纯度高的化学原料药含量测定；

b.紫外-可见分光光度法（包括比色法）：灵敏度高，准确度不如容量分析。 单组分：适合辅料对主成分无干扰的单方制剂分析 或原料药分析 多组分：考虑成分之间的相互干扰，采用双波长等吸收等方法排除干扰。

c.HPLC:

HPLC 仪器的基本组成，泵、色谱柱的维护保养，采用定量环进样时进样量注意事项，检测器的主要类型及各自特点； HPLC 仪器的基本组成 1 输液系统

(1) 高压输液泵

作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。 （2）在线脱气装置

1%

143

3

0.0543511.110

/1001.110/1.110

%1000.055%2cm A C E l

g m l

m g m l

---=

=

??=?=??=?=肾上腺酮

作用：脱去流动相中的溶解气体。流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。

在线脱气、超声脱气、真空脱气等

（3）梯度洗脱装置

等度洗脱：恒定组成的单一溶剂体系

梯度洗脱：

以一定速度改变多种溶剂的配比淋洗，目的是分离多组容量因子相差较大的组分

泵的保养

?使用流动相尽量要清洁；

?进液处的砂芯过滤头要经常清洗；

?流动相交换时要防止沉淀，尤其是更换流动相前、后用到缓冲溶液时，必须用纯水

清洗过渡

?避免泵内堵塞或有气泡；

?每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染；

2 进样系统

进样器：分六通进样阀和自动进样装置

进样注意事项：

●六通进样阀进样：体积由固定体积的进样管（sampling loop）控制。装样位置（load）

和进样位置(injection)。为了确保进样准确，用微量注射器装样时，所取样品体积应大于进样管的体积

●使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20μl的定量环最少

进样60至100μl的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性

●为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含

盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧

商品柱的维护保养

?必须仔细阅读商品填充柱的使用说明书

?柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动；

?在柱子和色谱仪连结前，阀件或管路一定要清洗干净；

?流动相脱气要彻底；

?避免使用高粘度的溶剂作为流动相；

?进样样品要提纯，样品溶解尽量采用流动相，复杂样品在柱前要安装预柱；

?严格控制进样量；

?每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱；

?反相柱分析生物样品后不能直接用甲醇冲洗，一般用50%的甲醇-水或水比例更大

的溶液洗柱，防止蛋白被甲醇沉淀严重影响柱效。

?反相柱流动相中含有缓冲盐时，不能直接切换成甲醇或乙睛洗柱，先用水或水比例

大的溶液洗柱，防止盐析出。

?若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭，反相柱通常用甲醇或乙睛保

存。

?每天分析工作结束后，取下柱子，清洗进样器中残留的样品。

3.4 色谱介质分类

?正相色谱：固定相极性大于流动相极性。

? 反相色谱：固定相极性小于流动相极性，常加入TFA

? 离子交换色谱：阴离子交换色谱（DEAE 二乙基氨基乙基，Q 季胺盐）阳离子交换

色谱（CM 羧甲基S 磺酸基）

3.5.3 示差折光检测器RID

通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。由于折射率是物质的通用性质，示差折光检测器是一种通用型的整体性质检测器。

原则上凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定，其检测限可达（10-6

~10-7

）

g/mL 。由于折射率对温度的变化非常敏感，大多数溶剂折射率的温度系数约为5×10-4

，因此，检测器必须恒温，才能获得精确的结果。折光（射）检测器的灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。

3.6 反相键合相色谱RP-HPLC

? 以非极性键合相或弱极性、中等极性键合相为固定相，极性溶剂为流动相进行的

HPLC.

? 目前，HPLC 中，70%以上是采用RP-HPLC 进行的。 分离对象：

? 分子型、离子型化合物均可用RP-HPLC 分离分析。

RP-HPLC 常用固定相

? 十八烷基硅烷（C18）、辛烷基硅烷（C8）、苯基键合硅胶等非极性固定相。 ? 短链烷烃基键合相能用于极性化合物的分离；

? 苯基键合相适用于分离分析芳香化合物及多羟基化合物。

? 当分离强极性化合物时，极性键合相也能用于反相色谱，如分离糖类时，可用氨基

键合相作固定相，用乙腈-水为流动相。 RP-HPLC 常用流动相

? 以水为基础溶剂，加入一定量与水混溶的极性调节剂；

? 常用甲醇-水，乙腈-水。

? 流动相极性越低，其洗脱能力越强。

RP-HPLC 分离机理

疏溶剂理论（solvophobic theory ） （疏水作用）

? 非极性溶质或溶质分子中的非极性部分与极性溶剂（流动相）接触时，产生相互排

斥力（即产生疏溶剂作用），而从溶剂中被“挤出”，与固定相表面的非极性部分产生缔合作用（即疏溶剂缔合），使溶质保留在固定相中。

? 即溶质的保留不是由于溶质与键合相之间的非极性相互作用引起的。

RP-HPLC 影响溶质保留行为的因素 1）溶质的分子结构：

溶质极性越弱，疏水作用越强，k 越大, 出峰时间越晚. ２）流动相溶剂的性质

? 溶剂的表面张力、介电常数增大，溶质的保留增加；

水-有机溶剂混合溶剂中，有机溶剂含量增加，表面张力和介电常数下降, 溶质的k 减小，出峰时间

3）流动相中中性盐的影响

? 盐（如：缓冲溶液）的加入，使溶剂的表面张力增加，非离子性溶质的k 增加，出

)1()1(k t V V K t t M m S M R +=?+=

峰时间延后；

?对离子性溶质，其k随盐浓度增加而减小，出峰时间提前，可能由于溶质与流动相

间的静电作用增强所致。

４）流动相pH

?对弱酸、弱碱性溶质的保留，影响大。

?若pH控制不当，则溶质解离，k减小，同时使色谱峰扩张和拖尾。

?需调节流动相的pH，抑制溶质的解离，增加溶质与固定相的非极性缔合作用，增强

保留，同时可改善色谱峰形------称离子抑制色谱法，通常适用于

3

调节pH的方法：

?流动相中加入少量弱酸：常用醋酸，等弱酸性溶质

?流动相中加入少量弱碱：常用氨水，三乙胺，等弱碱性溶质

?流动相中加入少量缓冲盐：常用磷酸盐，醋酸盐

5）固定相性质

?固定相性质对溶质保留行为的影响要结合溶质本身的性质加以区分

?分离弱极性的溶质时

●固定相非极性大，溶质保留强.

?分离极性化合物时

●用短链烷烃键合相，例如：辛烷基硅烷（C8柱）

?分离强极性化合物时

●极性键合相也能用于反相色谱，如分离糖类时，可用氨基键合相作固定相，

用乙腈-水为流动相。

3.8 HPLC分离方法的建立

? 3.8.1分离机制选择

a.分子量小于1000且溶于有机溶剂的组分

1）固液吸附色谱

SP: 硅胶；MP: 有机溶剂。

2）反相色谱

SP: -C18, C8等；

MP：甲醇，乙腈，THF的混合液

3）正相色谱

SP: -CN, -NH2键合相，MP：有机溶剂

b.分子量小于1000且溶于水的组分

1）非离子型化合物用反相色谱

?SP: -C18, C8等

?MP：水或缓冲溶液，甲醇，乙腈，THF的混合液

2) 可离子化化合物用反相离子对色谱

?SP：-C18, C8等

?MP：水或缓冲溶液（含离子对试剂），甲醇，乙腈，THF的混合液

3）离子型化合物可用离子交换色谱

或采用反相离子对色谱

?SP: -SO3H, -NR3Cl型离子交换剂

?MP：缓冲液

c.分子量大于1000的组分

1. 组分溶于水：

凝胶过滤色谱例如：Sephadex G-10

SP：水溶性凝胶

MP：水溶液

也可采用离子交换色谱和特殊的反相键合色谱（疏水层析）

2. 组分溶于有机溶剂

凝胶渗透色谱：例如：Sephadex LH-20

SP：有机凝胶

MP：有机溶剂

常见分离机制（反相HPLC，还有正相、凝胶过滤（分子排阻、分子筛）、离子交换、手性分离等）；

反相HPLC常用固定相、流动相、分离机理，影响保留时间的主要因素，怎样通过调整流动相组成改变分离组分的保留时间?

怎样根据分析样品的特点选择HPLC的分离条件（从分离机制到流动相的调整）

例如：反相离子对色谱适合何种样品？氨基酸类适合用何种分离机制？蛋白类或多糖类适合用何种分离机制？旋光纯度测定适合用何种分离机制？

3.11.2 蛋白质、多肽的分析

?蛋白质、多肽的性质：

相对分子质量大，两性分子，具有高级结构，在溶液中的扩散系数比较小、黏度大等。

1.反相HPLC(RPC)

?孔径30nm的C3-C8或氰基键合硅胶固定相应用较多。

?采用中等极性的反相色谱固定相、以异丙醇—磷酸盐缓冲溶液作流动相，在pH3—7

范围分离能够保持其生物活性。

?保留值较小的小肽通过自由氨基端和碱性氨基酸(当以TFA作缓冲剂时)结合成离子

对，从而使保留值增大。

?大多数肽与蛋白质用浓度小于60％的ACN即可洗脱，一般初始试验选择0-60％的

ACN，肽30min、蛋白质60min。

?高温使谱峰变窄，压力降低。

?检测波长＜210nm时，流动相中用磷酸代替TFA，可以增强在200nm处的检测灵敏

度。

2. 离子交换色谱适宜于分离相对分子质量大于20000的蛋白质。这种分离模式能够保持蛋白质等生物大分子的天然构象和生物活性。

3. 体积排阻色谱法的柱效相对较低，不太适合用于分析复杂的生物样品。与生物分子的相对分子质量和形态有很大关系。

4. 硅胶填料粒径较小，柱效比聚合物基质填料与琼脂糖基质填料高。

◆纯度分析：

定性鉴别：肽图谱

◆含量测定:

氨基酸序列分析

3.11.3多糖的分析

多糖的性质：分子量大，极性强，结构的微观不均一性

多糖

?柱型：凝胶过滤，离子交换,正相色谱，反相色谱等

?检测：示差折光检测器、蒸发光散射检测器

?HPLC 条件

流动相：100mmol醋酸胺缓冲溶液（pH5.5）/乙腈（体积比为７８：２２），等度洗脱，流速1ml/min；紫外检测波长：245nm；进样量：10μｌ；柱温：室温。

核酸分析

?性质：对碱基、磷酸、戊糖。

?分离常用反相色谱或离子交换

?检测波长：260

?通常使用的缓冲液为pH 7的10-20mmol/L的磷酸盐或Tris缓冲液，含0.1mol／L

三乙胺(TEA)乙酸盐

1.2.3 实例：中华人民共和国药典的编排内容

1.2.3.1分几部，每部收载哪几类品种；几年修订一次，现在使用什么版本？

1.2.3.2 凡例、正文、附录、索引各部分内容各有何特点？（有关药典凡例中的一些专业术语）

1.2.3.3 以中国药典二部为例，说明药品制剂标准与原料药标准的主要区别？（即制剂分析的特点）

2．药品质量标准中常用技术方法

2.1 常用方法的选择和验证

准确度，精密度（RSD的计算，各种方法的范围），相关与回归

2.2常用技术方法

见 1.2.2.2.2，再补充以下

1．概念：酶的活力单位，酶的比活力，有什么意义？

●酶的活力单位enzyme-activity unit

酶活力单位定义：在规定的条件下，每分钟能转化1μmol底物所需要的酶量，称一个酶的活力单位（U）

●酶的比活力specific activity

每毫克酶蛋白所含酶活力，U/mg。

酶的比活力是经常应用的基本数据。

比活力越高，酶制品纯度越高。

说明酶活力大小时需要指明底物种类，温度、pH. 等条件。

2．结合酶促反应动力学原理，说明固定时间法测定酶类药物活性时对底物浓度的有什么要求?

●固定时间法注意事项

缺点：测定过程中无法了解整个反应过程是否都是零级反应。

要求：方法设计时必须满足

a)高底物浓度，符合零级反应。

b)在测定时间内底物浓度应该足够大。

c)需要加入变性剂终止酶反应

3．结合酶促反应热力学原理，说明酶法分析终点法测定底物浓度时对其它反应条件有什么要求，酶法分析速度法在何种情况下比终点法具有优势？

4．酶法分析、酶的活力测定方法中，通过哪些方法可以测定酶促反应的速度，或者反应前后各物质的浓度变化情况，从而求算反应开始浓度。

5．酶循环放大分析法中，哪些因素保证循环能顺利进行，循环次数怎样求得？怎样定量？

6．酶联免疫吸附分析:夹心法测定抗原、抗体

7．SDS-PAGE测定蛋白质分子量的基本原理，分子量测定，测定分子量的局限性

3．几大类生物药品常用质量分析方法举例

3.1多肽因子类药物分析：

肽图分析基本原理，常见选择性裂解某些肽键的方法；

?肽图检查

●肽图分析是指用酶解或化学法选择性的降解蛋白质中的肽键后，对生成的肽段进行分

离、分析的技术。

●酶裂解蛋白质分子

?胰蛋白酶作用于碱性氨基酸（Arg,Lys)的羧基端。

?Lys-C内肽酶只作用于Lys-x键，而不作用于Arg-x键。

?梭菌蛋白酶只作用于Arg-x键，而不作用于Lys-x键。

●化学裂解蛋白质分子

?最常用的是溴化氰裂解法

?溴化氰作用于甲硫氨酸Met羧基端和其次一个氨基酸形成的肽键。如γ-干扰素含

4个Met,经溴化氰作用后生成5个肽段。

●肽段的分离、分析

?SDS-PAGE，HPLC，毛细管电泳

最终产品的质量控制

?N－末端15个氨基酸序列

?二、肽图分析：工艺稳定性

?三、测定分子量：SDS-PAGE

?四、纯度

–HPLC，非还原SDS-PAGE

?五、等电点测定

–批与批之间必须一致

?六、紫外吸收

?七、外源性DNA测定

–一般认为：宿主细胞DNA残留含量小于100pg/每个剂量

?八、效价测定

–以体内或细胞法测定制品的生物学活性，标明其活性单位

–用免疫学方法测定的效价不能完全代替生物学效价

–测定效价同时，还要测定蛋白质含量，以活性单位/蛋白mg表示（比活性）

非还原SDS-PAGE测定杂蛋白；

外源性DNA的测定。

多肽因子类生物效价测定：3H－TdR掺入同位素法，MTT检测法

3.2多糖类药物分析

完全酸水解分析单糖组成；

部分酸水解或乙酰解分析多糖中单糖的连接顺序。

通过高碘酸氧化、Smith降解再用硼氢化钠还原的产物判断多糖中糖苷键的连接位置。

通过甲基化或乙酰化水解产物分析多糖中是否具有分支结构。

3.3氨基酸与蛋白质类药物分析

氨基酸定量分析方法: 甲醛滴定法，非水溶液滴定法，双波长分光光度法

蛋白质分子量测定：凝胶过滤层析，SDS-PAGE

蛋白质含量测定方法有哪些？

凯氏定氮法原理及基本步骤？紫外吸收法的波长选择？

蛋白质的氨基酸组成分析：柱后衍生和柱前衍生的分离机制和检测各有何异同？

结合HPLC一章加以分析。

4．生物制品类产品质量控制标准

人用重组DNA制品产品质量的控制要点

人用重组DNA制品原材料控制要求

卷面60%，读书工程15%，作业20% 考勤5%，