生长因子促进转基因小鼠坐骨神经体外预变性的实验研究

组织工程与重建外科杂志２０１１年８月　第７卷第４期　ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１６７３－０３６４．２０１　１．０４．００３　生长因子促进转基因小鼠坐骨神经　体外预变性的实验研究　

王晓盼沈尊理秦金保金羽青　

・１９１・　・论著・　

【摘要】　目的探索一种简便高效的小鼠坐骨神经体外预变性的方法，以便在短期内获取大量高活性的雪旺细胞。方　法　选用绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）转基因的小鼠２４只，随机分为Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ四组。Ａ、Ｂ、Ｃ组切取双侧坐骨神经，分别置于　ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ及含生长因子的雪旺细胞培养液中体外预变性１周，Ｄ组切断一侧坐骨神经体内预变性１周。　１周后取材，行免疫组织学和细胞学方面的检测，比较各组获取的雪旺细胞量和纯度。结果Ｃ组获得的雪旺细胞量及　纯度较高，与Ｄ组的雪旺细胞相似。结论生长因子能促进小鼠坐骨神经的体外预变性，具有与体内预变性相似的效　果，能在短期能获得大量雪旺细胞。　【关键词】　生长因子预变性　坐骨神经雪旺细胞转基因小鼠　【中图分类号】Ｑ８１３．１＋１　【文献标识码】Ａ【文章编号】　１６７３—０３６４（２０１１）０４—０１９１—０５　

Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　Ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　Ｐｒｅ—ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉＯｎ　ｏｆ　Ｓｃｉａｔｉｃ　Ｎｅｒｖｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｍｉｃｅ／ｎ　Ｖｉｔｒｏ：　ａ　Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ　Ｓｔｕｄｙ　ＷＡＮＧ　Ｘｉａｏｐａｎ，ＳＨＥＮ　Ｚｕｎｌｉ，ＱＩＮ　Ｊｉｎｂａｏ，ＪＩＮ　Ｙｕｑｉｎｇ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆＰｌａｓｔｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｆｉｒｓｔ　Ｐｅｏｐｌｅ’Ｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　Ｊｉａｏｔｏｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ　２０００８０，Ｃｈｉｎａ．Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ：ＳＨＥＮ　Ｚｕｎｌｉ　一　ｍａｉｌ：ｚｕｎｌｉ＿ｓｈｅｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃ　．　

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ａ　ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ　ａｎｄ　ｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｐｒｅ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｃｉａｔｉｃ　ｎｅｒｖｅｓ　ａｎｄ　ｏｂｔａｉｎ　ｌａｒｇｅ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｐｕｒｅ　Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ａ　ｓｈｏｒｔ　ｐｅｒｉｏｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｔｗｅｎｔｙ—ｆｏｕｒ　ｇｒｅｅｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｄｉｖｉｄｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａ，Ｂ，Ｃ　ａｎｄ　Ｄ　ｆｏｕｒ　ｇｒｏｕｐｓ　ｒａｎｄｏｍｌｙ．Ｂｉｌａｔｅｒａｌ　ｓｃｉａｔｉｃ　ｎｅｒｖｅｓ　ｗｅｒｅ　ｈａｒｖｅｓｔｅｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｉｎ　ＤＭＥＭ（ｇｒｏｕｐ　Ａ），ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ｇｒｏｕｐ　Ｂ），ａｎｄ　ＳＣＣＭ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ（Ｇｒｏｕｐ　Ｃ）ｆｏｒ　ｏｎｅ　ｗｅｅｋ　ｆｏｒ　ｐｒｅ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎ　ｇｒｏｕｐ　Ｄ．ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ　ｓｃｉａｔｉｃ　ｎｅ￣ｅｓ　ｗｅｒｅ　ｃｕｔ　ｏｆｆ　ｆｏｒ　ｐｒｅ—ｄｅｇｅｎａｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｇｒｏｕｐ　Ｃ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｌａｒｇｅ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ，ｓｉｍｉｌａｒ　ｗｉｔｈ　ｇｒｏｕｐ　Ｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｃａｎ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｐｒｅ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｃｉａｔｉｃ　ｎｅｒｖｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｍｉｃｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，ｓｉｍｉｌａｒ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｅ—ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｖｏ，ａｎｄ　ｃａｎ　ｏｂｔａｉｎ　ｌａｒｇｅ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ．　【Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ】Ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒｓ；Ｐｒｅ－ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；Ｓｃｉａｔｉｃ　ｎｅｒｖｅｓ；Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌｌｓ；Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ　ｍｉｃｅ　

雪旺细胞（Ｓｃｈｗａｎｎ　ｃｅｌｌｓ）是重要的神经胶质细　胞，在中枢和周围神经损伤后的修复中发挥重要作　用＿ｌｊ。周围神经损伤后，雪旺细胞开始大量增殖，并　同巨噬细胞一起，吞噬髓鞘及细胞裂解碎片，同时释　放各种神经营养因子，促进和引导神经轴突从近端　向远端生长［２１。雪旺细胞作为周围神经组织工程的　种子细胞，在修复神经缺损方面具有不可替代的作　用。但雪旺细胞是一种终末期细胞．来源有限．自我　基金项目：国家自然科学基金（３０８７２６３０）。　作者单位：２０００８０上海市　上海交通大学医学院附属第一人　民医院整形外科。　通讯作者：￣（Ｅｍａｉｌ：ｚｕｎｌｉ—ｓｈｅｎ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｒｎ．ｃｎ）。　增殖能力差，体外培养很难达到所需的量及纯度。虽　经基因修饰可获得雪旺细胞的永生株，但其分泌神　经修复因子的能力显著下降，且存在致瘤性可能。　神经预变性是一种有效的获取大量雪旺细胞的　方法［３－６］，已进行了广泛的研究，并得到了多数学者　的认可。我们采用一种简便高效的体外预变性方法．　能够在短期内获得大量高纯度的雪旺细胞。为临床　雪旺细胞移植修复神经缺损提供实验基础。　

１材料和方法　１．１主要试剂及仪器　ＤＭＥＭ培养液（Ｈｙｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）；胎牛血清（Ｈｙ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｕｇｕｓｔ　２０１　１，Ｖｏｌ　７　Ｎｏ　４　ｃｌｏｎｅ，ＵＳＡ）；Ｆｏｒｓｋｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）；Ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ－［３－１　（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＵＳＡ）；Ｂａｓｉｃ—ＦＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＵＳＡ）；兔　抗ｓｌＯ０￣多克隆抗体（Ｄａｋｏ，ＵＫ）；罗达明一羊抗兔多　克隆抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）；荧光封片剂（ＤＡＫＯ，　ＵＳＡ）；ＣＯ２恒温培养箱（Ｆｏｒｍａ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）；离心　机（Ｔｈｅｒｍｏ，ＵＳＡ）；倒置相差显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ，　Ｊａｐａｎ）；荧光显微镜（Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）；解剖显微镜　（Ｍｏｔｉｃ，ＵＳＡ）；显微外科手术器械（上海手术器械　厂）。　１．２实验动物　绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）转基因小鼠，由南京模式　生物研究所提供　１．３雪旺细胞培养液（ＳＣＣＭ）的配制及多聚赖氨酸　与层黏连蛋白铺板　１．３．１　ＳＣＣＭ　由ＤＭＥＭ加入ＩＯ％ＦＢＳ、２　ｔｚＭ　ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ、１０　ｎｇｍＬ　ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ—Ｇ一１及５０　ｎｇ／ｍＬ　ｂ—ＦＧＦ组成。　１．３．２多聚赖氨酸与层黏连蛋白铺板　用双蒸水配制浓度为０．１　ｍｇ／ｍＬ与１　ｐ￣ｇ／ｍＬ的　多聚赖氨酸及层黏连蛋白的工作液，培养皿中加入　多聚赖氨酸工作液，３７℃培养箱中孵育１　ｈ，双蒸水　冲洗干燥后行层黏连蛋白铺板，３７℃培养箱中孵育　ｌ　ｈ，干燥后４℃冰箱保存待用。　１．４动物分组及手术　４～６周龄ＧＦＰ小鼠２４只，雌雄不限，随机分为　Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组，每组６只，其中Ｄ组为体内对照组。　１．４．１体外预变性　将Ａ、Ｂ、Ｃ组中的ＧＦＰ小鼠颈椎脱臼处死，７５％　乙醇浸泡消毒１０　ｍｉｎ，超净工作台中暴露两侧坐骨　神经，分离切取坐骨神经１．５　ｃｍ，解剖显微镜下剥除　外膜，ＰＢＳ冲洗后，分别放于含有ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ＋　ＩＯ％ＦＢＳ、ＳＣＣＭ培养液的六孔板中，每组２孔，每孑Ｌ　３条神经为一小组。３７℃，５％ＣＯ　恒温培养箱中培　养，每２天换液，１周后待检。　１．４＿２体内预变性　Ｄ组中的ＧＦＰ小鼠１０％戊巴比妥腹腔注射麻　醉．无菌条件下暴露右侧坐骨神经，在远离脊神经根　部切断坐骨神经，并使断端游离，分为２小组，每小　组３只小鼠。术后１周取材待检。　１．５细胞培养及冰冻切片制作　１．５．１　细胞培养　分别于Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组各取ｌ小组，ＰＢＳ漂洗后　将坐骨神经切成２　ｍｍ　大小的碎块，０．２％Ｃｏｌｌａｇｅ—　ｎａｓｅ　ＮＢ４和０．２％Ｄｉｓｐａｓｅ混合液３７℃消化直至机　械性溶解，ｌ　５００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，弃上清，ＳＣＣＭ重　悬，细胞计数后铺于涂有赖氨酸和层黏连蛋白的培　养皿中，３７℃、５％ＣＯ。恒温培养箱中培养，连续观察　细胞生长　１．５。２冰冻切片　取四组中另外１小组，ＰＢＳ冲洗坐骨神经后．　４％多聚甲醛溶液＋ｌ０％蔗糖固定脱水１．５　ｈ，３０％蔗　糖梯度脱水至神经悬浮于蔗糖溶液中，冰冻切片　机一６０℃，ＯＣＴ包埋制作１０　ｍ厚度冰冻切片。　１．６组织和细胞免疫荧光检测　取上述各组的冰冻切片及培养的原代细胞行兔　抗ｓｌｏｏ￣３多克隆抗体的染色。切片及细胞固定后曲　拉通破膜、羊血清封闭，一抗３７　孵育１　ｈ，ＰＢＳ漂　洗３次，每次５　ｍｉｎ，二抗３７℃孵育０．５　ｈ后ＤＡＰＩ　衬染。激光共聚焦显微镜观察组织切片中绿色荧光　蛋白及ｓｌｏｏ￣表达情况，普通荧光显微镜下观察细　胞染色情况，随机选取５个视野计算细胞纯度。　１－７统计学　重复进行３次实验。所有计数值以均数±标准　差表示，应用ＳＰＳＳ　１３．０统计软件进行数据分析。组　间均数比较采用ｔ检验。Ｐ＜０．０５提示差异具有统　学意义。　

２　结果　２．１　大体观察　切取神经体外培养１周后，断端开始膨大，形成　神经瘤样的膨大结构。Ａ组断端稍增大，表面毛糙；　Ｂ组断端膨大，但整个神经开始明显卷缩：Ｃ组神经　瘤样膨大较明显，为雪旺细胞大量增殖的结果（图１）。　２．２免疫组织学检测　体外预变性１周后ＳｌＯ０Ｂ染色，激光共聚焦　微镜扫描绿色荧光蛋白及其表达情况。Ａ组绿色荧　光表达量明显减少，纵切面见大部分（包括边缘部　分）无绿色荧光表达，组织坏死严重；Ｂ组纵切面ｒｆ１　央部分见大面积的无绿色荧光蛋白表达区域，中央　部位坏死；Ｃ组中绿色荧光蛋白高表达，并形成典型　的纵行、半弧形的结构，即为变性后雪旺细胞增殖形　成的Ｂｕｎｇｎｅｒ氏带所在的位置。纵行或半弧形包裹　着中空的管，该管是内膜管。ＤＭＥＭ及ＤＭＥＭ＋１０％　ＦＢＳ中预变性的神经很少形成典型的Ｂｕｎｇｎｅｒ氏　带．其对神经的预变性作用明显弱于ｃ组。Ｄ组结　果与Ｃ组类似（图２　Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）。　￥１００］３免疫荧光染色呈红色，其在各组的表达　规律类似于绿色荧光蛋白，但更具有特异性。Ａ组及