淋巴细胞抗原受体

常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞
饲养细胞一般在融合前一天制备
免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴 母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强 免疫3天后的脾脏。
融合比例：
骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10
融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）
融合24小时后加HAT培养液 2周后 改 用HT培养液 2周后 改用一般培养液
质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。如: 免疫血清（含多种特异性抗体）。 2.实际意义 （1）预防、治疗感染性疾病
（2）临床诊断
二、单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)
1.定义 由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗 原分子某一特定抗原决定簇的特异性抗体。
2.特点 具有高度均一性。 3.杂交瘤细胞
尿核苷单磷酸
胸腺嘧啶核苷酸
TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）
HAT选择培养基的原理
HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)
抗原免疫的脾细胞
（B细胞） 1. 抗体分泌（Ig+)
在HAT生长
（一）胚系基因结构：
肽链编码基因： 编码V区的基因， V区基因的下游是： 编码C区的基因
重链V区基因由基因片段：V、D、J拼接 轻链V区基因由V、J基因片段拼接 互补决定区CDR1+CDR2←V基因片段，
大部CDR3←D， 其余CDR3←J 。
பைடு நூலகம்
14号染色体 2号染色体 22号染色体
C区的基因在V区基因的下游，1~9 个，如H的C基因有9个功能性基因。
2、等位排斥和同种型排斥 (1) 等位排斥：
在一对同源染色体的某一基因座位上， 二条染色体的等位基因中只有一个基 因能表达。保证了一个B细胞或T细胞 只能表达一种特异性的抗原受体。
(2) 同种型排斥：
表达同一类型肽链的不同基因座位之间 的排斥。如表达L链的κ链基因在第2号染 色体上，而λ链基因在第22号染色体上， 在一个细胞内它们不能同时表达，只能 表达其中之一，κ/λ，κ：λ=65：35。
Tail Piece
五、IgE
1.单体分子； 2.血清中含量最低(占Ig的0.002%)； 3.半衰期 3天； 4.呼吸道和胃肠道浆细胞产生； 5.介导Ⅰ型超敏反应； 6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异
性IgE水平增高。
C4
第七节 单克隆抗体和基因工程抗体
一、多克隆抗体(polyclonal antibody) 1.定义 指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物
二、多样性产生的机制
1、组合造成的多样性
2、连接造成的多样性
CDR3区位于V、J和V、D、J片段连 接处，可丢失或加入数个核苷酸(N插入)， 在末端脱氧核苷酸转移酶作用下，不需 模板，直接加入核苷酸至DNA断端，在 V-D-J之间，形成VNDNJ ，而显著增加 了CDR3的多样性
3、体细胞高频突变造成的多样性
小鼠骨髓瘤细胞
（B细胞恶性肿瘤） 1.具永生性 2.HGPRT+ 2.8-AG筛选出
HGPRT-株
PEG 融合 HAT筛选
脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）
融合的结果及命运
未融合的骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
脾-脾杂交细胞
未融合的脾细胞
骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞
免疫动物
培养骨髓瘤细胞
收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。 目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细 胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分 泌细胞分开。
当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融 合在一起。融合细胞含有两个不同的细 胞核，称为异核体，产生具有原来两个 细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交 细胞（hybrid cell）。
细胞DNA合成途经
1.替代途径：次黄嘌呤（H）
2.主要途径： 氨基 酸
HGPRT 鸟嘌呤核苷酸
谷 氨 酰 胺 （A-）
克隆选择学说：Burnet(澳) 1957年
①免疫细胞随机形成多样性的细胞系(克 隆,Clone),每一克隆细胞表达同一种特异的识别 抗原受体，识别相同抗原。
②胚胎期的免疫细胞系接触抗原后，该细 胞系被排除或失去活性，处于抑制状态，成为 禁忌克隆，产生耐受。
③成熟淋巴细胞可识别外来抗原，被选择 而活化、产生效应。
骨髓瘤细胞 — 无限增殖； 免疫B细胞 — 合成、分泌特异性抗体。 4.杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H), 氨基蝶呤(A)和胸腺嘧 啶核苷(T)。
杂交瘤技术的理论基础
淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即 一种克隆只产生一种抗体
细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保 持双方亲代细胞的特性
利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞， 并克隆化，制备McAb
研究证明：
不同的V基因实际上是由少数原先分 隔的胚系基因片段，在淋巴细胞发生分化 过程中，通过重排(组合、拼接及高频突变 等)的过程，从而获得了特异性的V基因， 产生巨大数量特异的抗原受体以识别不同 的抗原，BCR的多样性可达1014，TCR的 多样性可达1016。
一、BCR、TCR基因结构及其重排
可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的 免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
V、D、J片段各有多个 一个淋巴细胞中只有一个片段参与组成 抗原受体V区的编码基因
14号染色体中 7号染色体q 7号染色体p
TCR的β、δ链 是由三种胚系 基因片段：V、 D、J 拼接而成， α、γ链基因是 由V、J 两个基 因片段拼接成 的。
BACK
二、基因重排：
1、重组酶：重组激活酶、末端脱氧核酸 转移酶、DNA外切酶、DNA合成酶等。
抗体
第四节 淋巴细胞抗原识别受体的 编码基因及多样性的产生
n(抗原表位) ↑↓
n(T/B细胞克隆) ← n(TCR/BCR) ← n(V基因)
机体存在着特异性识别各种抗原的T、B细胞 克隆，称T、B细胞库, 即TCR、BCR的多样性
一个机体每一个淋巴细胞是不是具有 这么巨大数量的V基因库呢？ 没有。
BCR/Ig的重链V区基因 是由三 种胚系基因片段：V、D、J拼接 而成，轻链V区基因 是由V、J 两个基因片段拼接成的。互补决 定区CDR1+CDR2←V基因片段， 大部CDR3←D， 其余CDR3←J 。
BACK
C区的基因在V区基因的下游，1~9个， 如H的C基因有9个功能性基因。
TCR的β、δ链是由三种胚系基因片段：V、 D、J 拼接而成，α、γ链基因是由V、J 两 个基因片段拼接成的。
2.介导免疫细胞活性 (1)调理作用(opsonization)：IgG + 抗原(颗粒性) → FcγR（单核、巨噬细胞及中性粒细胞） → 促吞噬细胞吞噬； (2)ADCC：IgG + 抗原(靶细胞) → Fc γR（NK 细胞）→ 杀伤靶细胞；
(3)介导超敏反应：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型超敏反应。
3.穿越胎盘和粘膜
4、BCR(膜型Ig)和分泌型Ig
在转录时如只转录到SC(分泌性外显子)， 不能表达疏水性氨基酸残基，只能分泌 出去。 如继续转录至MC(膜性外显子)，则可 表达疏水性的跨膜区和膜内区，插入细 胞膜，作为膜受体。
在转录时如只 转录到SC(分 泌性外显子)， 不能表达疏水 性氨基酸残基， 只能分泌出去。 如继续转录至 MC(膜性外显 子)，则可表达 疏水性的跨膜 区和膜内区， 插入细胞膜， 作为膜受体。
第六节 各类免疫球蛋白的特性和功能
一、IgG
1.一般特性
(1)单体分子；
IgG1, IgG2 and IgG4
IgG3
(2)四个亚类；
(3)血清中含量最高(75%Ig)；
(4)半衰期最长(21～23天)；
(5)3～5岁达成人水平(8.0～17 mg/ml)；
(6)可与SPA结合。
2.生物学活性 (1)通过胎盘（新生儿抗感染）； (2)激活补体（裂解细胞）； (3)调理作用（促进吞噬）； (4)介导ADCC（细胞毒作用）。 3.实际意义 (1)抗感染； (2)自身抗体 → 自身免疫病； (3)介导变态反应(Ⅱ、Ⅲ型)； (4)封闭抗体 → 肿瘤细胞逃逸； (5)亲合层析法 — IgG纯化； (6)免疫学检测。
骨髓瘤细胞系选择要点：
稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、 HGPRT缺陷株
常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）
防止支原体污染（胎牛血清）
融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好 的形态，活细胞计数高于95％
融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节 需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克 隆化和扩大培养过程中
细胞融合
HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞
检测筛选阳性细胞
克隆化培养（反复3-5次） 获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株 McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）
McAb 纯化及鉴定
制备单克隆抗体的基本技术
1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAB的制备 7 单克隆抗体的纯化
水平升高表明胎儿有宫内感染；
8.B细胞膜IgM(mIgM) →体液免疫应答；
C4
9.自身抗体 → 自身免疫病
三、IgA