过氧化氢酶的活性测定

过氧化氢酶的活性测定

方法一：高锰酸钾滴定法

1、实验目的：掌握高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶的活性的原理和方法。

2、实验内容：

实验原理：过氧化氢酶属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2。即可求出消耗的H2O2的量。

试剂：

10％H2SO4；

0.2mol／L磷酸缓冲液pH7.8；

0.02mol／L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，用0.1mol／L草酸溶液标定；

0.1mol／L H2O2：市售30％H2O2大约等于17.6mol／L，取30％H2O2溶液5.68mL，稀释至1000mL，用标准0.02molKMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定；

0.1mol／L草酸：称取优级纯H2C2O2·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。

操作步骤：

3.1酶液提取：

取高羊茅草叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000r／min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

3.2酶反应过程

取50mL三角瓶4个(3个测定，1个对照)，测定瓶中加入酶液2.5mL，对照瓶中加入煮死酶液2.5mL，再加入2.5mL 0.1mol／L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10％H2SO4 2.5mL。

3.3标定

用0.02mol／L KMnO4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色(在30s内不消失)为终点。

3.4结果计算

酶活性用每克鲜重样品1Min内分解H2O2的毫克数表示：

酶活(mg／g·min)＝（A-B）×V T×1.7FW×V1×t（3-2）

式中:A:对照KMnO4滴定毫升数(mL)；

B:酶反应后KMnO4滴定毫升数(mL)；

V T:酶液总量(mL)；

V1:反应所用酶液量(mL)；

W:样品鲜重(g)；

1.7:1mL 0.1mol／L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。

注意：所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定

方法二：过氧化氢酶的活性----紫外吸收法

[原理] H202在240nm波长下有强吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

[仪器与用具] 紫外分光光度计；离心机；研钵；容量瓶250ml1个；刻度吸管0.5ml2支；2ml1支；10ml试管3支；恒温水浴锅。

[试剂] 0.2mol?L-1pH7．8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；0．1mol?L-1H202(用0．1mol?L-1高锰酸钾标定)。

[方法]

1．酶液提取称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0．5g，置研钵中，加入2-3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀，将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000r.min-1下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，5℃下保存备用。

2．测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表42-2顺序加入试剂。25℃预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2，每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按式42-3计算酶活性。

3．结果计算以1min内A240减少0．1的酶量为1个酶活单位(u)。

过氧化氢酶的活性（u.g-1min-1）=

式中Aso--加入煮死酶液的对照管吸光值；

As1,As2-样品管吸光值；

Vt--粗酶提取液总体积(ml);

V1--测定用粗酶液体积(ml);

FW--样品鲜重(g); 0．1-A20每下降0．1为1个酶活单位(u);

t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。

注意:凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。