转换波长高效液相色谱
高效液相色谱简介及操作
HPLC和经典液相色谱法的比较
3.高效液相色谱法的分类
• 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色 谱法和凝胶色谱法四大类。
4.如何阅读色谱图？？
tR：保留时间；tM：死时间； ：调整保留时间； W：峰宽
• 定性分析：在同一色谱系统中相同物质具 有相同的保留值 • 定量分析：组分含量与其响应值（峰高或 面积）成正比
2 色谱柱使用的注意事项
• 色谱柱在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动。 • 当分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存（一般 为甲醇）。 • 每天工作结束后用适当的溶剂来清洗柱。
3 其他注意事项
• 未经提取净化的蛋白样品、血样、生物样品绝对禁 止直接进样分析。 • 要注意流动相的脱气。 • 避免使用高粘度的溶剂作为流动相。 • 使用新鲜配制的流动相，特别是水溶剂或缓冲液建 议不超过两天，最好每天更换。
（5）色谱柱平衡后，打开检测器（开灯） （6）测定样品 （7）清洗仪器
色谱柱及流路清洗 进样阀清洗 进样针清洗
四、主要注意事项
1 泵使用的注意事项
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防止任何固体微粒进入泵体（用0.22 um或0.45 um 的微孔滤膜过滤） 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲盐的流 动相不应保留在泵内更不允许留在柱内。 泵工作时防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运 转一是会使大量空气进入柱内柱床崩塌、也会磨损柱塞、 密封圈，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力。 流动相应先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量 的稳定性和分析结果。
c. 荧光检测器 (FLD) 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基 酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定。
高效液相色谱中紫外检测器的检测波长
高效液相色谱中紫外检测器的检测波长高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分离和分析技术，而紫外检测器则是HPLC 中最常用的检测器之一。
在紫外检测器的使用中，检测波长的选择对于样品的分离和检测结果的准确性具有重要影响。
1. 确定检测波长在选择紫外检测器的检测波长时，首先要考虑的是样品中各组分的紫外吸收特征。
通常，样品中的各组分在紫外区的不同波长处有不同的吸收峰。
通过实验或文献资料，可以了解各组分的紫外吸收特征，从而确定合适的检测波长。
2. 考虑样品性质除了组分的紫外吸收特征外，样品的性质也会影响检测波长的选择。
例如，对于含有共轭双键的化合物，其在280nm附近的紫外吸收较强；而对于含有苯环的化合物，其在260nm附近的紫外吸收较强。
因此，在选择检测波长时，需要根据样品的性质进行综合考虑。
3. 确定最大吸收波长在确定检测波长时，通常需要选择各组分最大吸收波长处的波长作为检测波长。
这样可以获得更高的灵敏度和更好的分离效果。
然而，如果各组分的最大吸收波长相差较大，为了兼顾各组分的检测灵敏度，也可以选择一个相对较小的波长作为检测波长。
4. 考虑溶剂和流动相的影响在HPLC分析中，通常使用有机溶剂作为流动相。
不同溶剂在紫外区的吸收特征不同，因此，在选择检测波长时需要考虑溶剂的吸收特性。
此外，流动相的组成和浓度也会影响检测波长的选择。
例如，流动相中含有缓冲盐时，其在紫外区的吸收较强，可能会干扰样品的检测。
因此，在选择检测波长时需要考虑这些因素的影响。
5. 参考标准方法在选择紫外检测器的检测波长时，可以参考已有的标准方法或文献资料。
这些方法通常会提供详细的实验条件和操作步骤，包括检测波长的选择等。
通过参考标准方法，可以更快地确定合适的检测波长，提高分析效率。
在高效液相色谱中使用紫外检测器时，选择合适的检测波长对于获得准确的分析结果至关重要。
需要考虑样品的性质、紫外吸收特征、溶剂和流动相的影响以及参考标准方法等因素。
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
[医学]中国药典-高效液相色谱
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度；
f为较正因子。
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（2）外标法：按各品种项下的规定，精密称（量
）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定 量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试 品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算 含量 含量（cX）=cR(AX/AR) 式中各符号意义同上。 由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法 测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或或自动 进样器进样为好。
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色谱柱
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积 、键合基团的表面覆盖度、含炭量和键合类型等）以 及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离 效果。分析分子量小于2000的化合物应选择孔径在 15nm以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应 选择孔径在30nm以上的填料。
普通分析柱的填充剂粒径一般在3~10µm之间。粒径 更小（约2µm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约 2mm）。
AR／CR 式中 As为内标物质的峰面积或峰高； AR为对照品的峰面积或峰高； Cs为内标物质的浓度； CR为对照品的浓度。
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再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪 器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质 的峰面积或峰高，按下式──
相邻两峰的分离度以半高宽和保留时间的公式计算，对称因子的 计算公式与中国药典中的拖尾因子公式相同，并列出了容量因子 计算公式和信噪比测定法。在与正文有关内容项下，建议流动相 要经脱气，脱气装置应不影响流动相的组成；
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正文规定的定量方法如果不是内标法，建议用固定体积的定量环 进样器；
高效液相色谱仪紫外检测器原理
高效液相色谱仪紫外检测器原理
高效液相色谱仪紫外检测器是一种常用的色谱检测器。
它基于紫外光的吸收特性，对样品进行定量分析。
其原理是：样品在流动相中随着溶液流动进入检测器中，通过紫外灯激发发生吸收，从而测量出样品的吸光度值。
在检测过程中，紫外灯照射流动相，使样品中的化合物吸收紫外光能量，形成一个吸收峰。
然后，检测器通过光电二极管将吸收峰转换成电信号，并经过放大和滤波后，通过计算机处理和分析，得到样品中化合物的浓度。
高效液相色谱仪紫外检测器的检测范围为200-600nm，其中
254nm和280nm是常用的波长。
不同的化合物在不同波长下的吸收峰也不同，因此可以通过选择合适的波长，来检测不同种类的化合物。
另外，紫外检测器的检测灵敏度和线性范围也是影响检测效果的关键因素，通常采用不同波长下的标准溶液，来确定灵敏度和线性范围。
总之，高效液相色谱仪紫外检测器是一种可靠、灵敏、准确的色谱检测器，可以用于快速、准确地检测各种化合物的浓度。
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液相色谱法和高效液相色谱法
溶剂等级
➢ 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，放置 时间越短，水质越高。
➢ 理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过 0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空 气等。
溶剂等级
有机溶剂的等级 HPLC级 优级纯 分析纯
都经过蒸馏和0.45µm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒） 优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂 HPLC级经过0.2µm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质
《仪器分析》
液相色谱法
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography
For Short：HPLC
色谱基础知识
主要内容
液相色谱法基础知识 液相色谱仪的主要部件
液相色谱仪的维护
色谱基础知识
色谱起源
1903年俄国植物学家 M. S. Tswett 提出经典液相色谱
C18柱的使用注意点
柱压应低于柱子的承受压力 柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 缓冲液pH使用范围为2～7
硅胶在PH为3～4时稳定性最好 碱浓度越低，流动相含水量越低，硅胶越稳定。
检测器 进样器
储液瓶 高压输液系统
输液泵
数据处理系统
柱温箱
常用检测器
紫外检测器（UV） 二极管阵列检测器（PDA） 荧光检测器（FL） 示差折光检测器 蒸发光散射检测器
溶剂等级
分析纯级(实线）和 HPLC 级溶剂（虚线）的吸光度比较
甲醇
乙睛
正己烷
溶剂等级
缓冲盐的使用：
使用前必须过滤 使用后一定要对柱子进行清洗 ，以免造成腐蚀、磨
损及阻塞：首先用纯水冲洗10-30min，再用甲醇冲 洗30min(0.5-1ml/min)
高效液相色谱HPLC简介
h
AB
1/10h
拖尾
T
f
＝
B A
前伸
液相色谱图相关术语(3)
色谱图相关术语: 基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所 产生的响应信号的曲线 基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓 慢变化 基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起 的基线波动
• 溶剂过滤：常用0.5μm膜过滤。HPLC级溶剂：无微粒，无紫外吸收，已用 0.2μm膜过滤。
• 贮液瓶要不定期更换，要有2～3个备用瓶，定期用酸、水、溶剂清洗。 • 沉子：用三个月后必须清洗或更换，若未用沉子，则必须用0.5μm膜过滤。
溶剂脱气
脱气：正相色谱如非水性凝胶色谱的流动相不必脱气，反相色谱的流动相需 要脱气。 He氦气脱气：10min可以除去80～90％溶入的气体，但价格昂贵 真空脱气：这是最常用的方法，可用真空抽滤流动相的方法代替。 超声脱气：使用方便，但只能脱气30％ 加热回流：最彻底的脱气方法，混合流动相不能用
底相交两点之间的距离 –半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰
高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧 相交两点之间的距离
HPLC的图形结果 --色谱图(Chromatogram)
色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.
改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质
在反相HPLC中溶剂强度会随着水/有机流动相中的有机相增加而增加 。
确定最佳的溶剂强度
• “试-凑法”，即先用一种可能过强的流动相，在后面的实验中逐步减小溶 剂强度以增加k’，当所有谱峰的k’介于1—20时，其流动相已经接近最佳 了。
高效液相色谱波长确定原则
高效液相色谱波长确定原则
在高效液相色谱分析中，正确确定波长对于获得准确的分析结果非常重要。
波长的选择应该考虑到样品的特性和分析目的。
以下是一些确定波长的原则：
1. 根据样品的吸收光谱选择波长：样品的吸收光谱可以帮助确定最佳的分析波长。
在选择波长时，应该选择最大吸收峰或者最小吸收谷附近的波长。
2. 根据分析目的选择波长：不同的分析目的需要不同的波长。
例如，检测化合物的浓度可以选择最大吸收峰附近的波长，而检测杂质可以选择最小吸收谷。
3. 考虑色谱柱的分离效果：波长选择应该考虑到色谱柱的分离效果。
如果柱子分离效果好，可以增加检测波长的宽度，这样可以增加检测的准确性和可靠性。
4. 考虑检测器的灵敏度：检测器的灵敏度应该在选择波长时考虑。
如果检测器对某个波长的响应较差，就应该选择其他波长。
5. 进行实验验证：最后，应该进行实验验证，确保选择的波长可以提供准确的分析结果。
可以通过比较不同波长的结果，确定最佳的分析波长。
总之，选择正确的分析波长非常重要，可以提高分析结果的准确性和可靠性。
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转换波长高效液相色谱
高效液相色谱（HPLC）是一种分离和分析化合物的技术，而波
长转换则是HPLC中的一种检测方式。
在波长转换HPLC中，化合物
在色谱柱中分离后，通过紫外（UV）或荧光检测器检测，然后根据
化合物的特定特性进行波长转换。
波长转换HPLC主要用于检测低浓
度的化合物，或者需要更高灵敏度的分析。
在进行波长转换HPLC时，需要考虑一些重要的因素。
首先，选
择合适的检测器是至关重要的。
对于UV检测器，需要选择适当的波
长范围以确保所需的化合物能够被检测到。
而对于荧光检测器，则
需要考虑化合物的荧光特性以确定最佳的激发和发射波长。
其次，
需要优化色谱条件，包括流动相的选择、流速和柱温等参数，以确
保色谱分离的效果和波长转换的准确性。
此外，还需要进行方法验
证和系统适应性测试，以确保波长转换HPLC方法的可靠性和准确性。
在实际操作中，波长转换HPLC可以应用于许多领域，包括药物
分析、环境监测、食品安全等。
通过合理的方法开发和优化，波长
转换HPLC可以实现对各种复杂样品的高灵敏度分析和定量检测。
综
上所述，波长转换HPLC作为HPLC分析技术的一种重要形式，具有
广泛的应用前景和重要的意义。