高效液相色谱详解-郝建涛
高效液相色谱法测定律复康胶囊中人参皂苷Re和Rg1的含量
虫垦塑垡荭堑瘗旦垫！Ｑ生！旦笠垒鲞箜！塑垦塾垫』丛鲤旦型ｇ垒ＰＰ！：里！垫！Ｑ：！堂：！：盟！：！高效液相色谱法测定律复康胶囊中人参皂苷Ｒｅ和Ｒｇｌ的含量陈舒茵申洪超黎瑞汝韩丽华王振涛梁生旺【摘要】目的建立律复康胶囊中红参人参皂苷Ｒｇｌ与Ｒｅ的含量测定方法。
方法采用ＨＰＬＣ法本品红参中人参皂苷Ｒｇｌ、人参皂苷Ｒｅ。
Ｄｉａｍｏｎｓｉｌｃ。
柱色谱柱，流动相为乙腈旬．０５％磷酸水（２１．５：７９．５），检测波长２０３ａｍ。
结果人参皂苷Ｒｇｌ、Ｒｅ在范围内呈良好线性，分别为２．３３—２０．９５斗ｇ（ｒ＝０．９９９４Ｕ＝５），０．９７２～８．７４８ｐ．ｇ（ｒ＝０．９９９２，ｎ＝５），平均回收率分别为１００．２％（ＲＳＤ＝１．９％）、９７．１％（ＲＳＤ＝０．８％）。
结论ＨＰＬＣ方法简便、准确，精密度高、重现性好，适用于含人参皂苷Ｒｇｌ、Ｒｅ成分产品含量的测定。
【关键词】律复康胶囊人参皂苷Ｒｇｌ；人参皂苷Ｒｅ；高效液相色谱法ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐａｎａｘｇｉｎｓｅｎｇＣ．九ＭｅｙｉｎＬｖｆｈｋ，ａｎｇＣａｐｓｕｌｅｓＣＨＥＮＳｈｕ—ｔｉｎ，ＳＨＥＮＨｏｎｇ－ｃｈａｏ，ＨＡｌＬｉ—ｈｕａ，ｅｔａ１．ＧｕａｎｇｄｏｎｇＰｈａｒｍｏｚｚｕｔｉｃａｌｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｎａｎｇｚｈｏｕ５１０００６；ｌ－ｌｅＮａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴＣＭ，ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ，４５０００８，Ｃｈｉｎａ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏａｎＭｙｚｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐａｎａｘｓａｐｏｎｉｎＲｇｌｐａｎａ】【ｓａｐｏｍｎＲｅｉｎＬｖｆｕｋａｎｇＣａｐ—ｓｕｌｅｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＨＰＬＣＷａＳｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｓ０ｆｐａｎａｘｓａｐｏｎｉｎＲ９１ｐａｎａｘｓａｐｏｎｉｎＲｅｉｎＬｖｆｕｋａｎｇＣａｐｓｕｌｅｓ．ＴｈｅＤｉａｍｏｎｓｉｌＣ１８ｃｏ｜ｕｔａｈ（５ｐｍ，２５０ｘ４．６咖）Ｗａｇｕｓｅｄ．Ｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｃｏｎｓｉｓｔｅｄｏｆａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ一０．０５％ｏｒｔｈｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃｗａｔｅｒ（２１。
反相高效液相色谱法测定葛根素和大豆苷元
反相高效液相色谱法测定葛根素和大豆苷元
何建涛;石志红;赵美萍;常文保
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2004(32)4
【摘要】利用反相高效液相色谱法,配以二极管阵列检测器测定了心可舒片中的葛根素和大豆苷元,建立了一种心可舒片的质量控制方法.色谱柱为C18柱,流动相为乙腈和0.02 mol/L磷酸二氢钾,柱温为25℃,流速为0.8 mL/min,梯度洗脱,检测波长为250 nm.葛根素和大豆苷元的平均回收率分别为97.3%和101.4%;RSD为0.6%和1.9%.
【总页数】3页(P519-521)
【作者】何建涛;石志红;赵美萍;常文保
【作者单位】北京大学化学与分子工程学院,北京,100871;北京大学化学与分子工程学院,北京,100871;北京大学化学与分子工程学院,北京,100871;北京大学化学与分子工程学院,北京,100871
【正文语种】中文
【中图分类】R972
【相关文献】
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张薇;张宇霞;张晗
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第五章高效液相色谱法6hppt课件-PPT精品文档
四、检 测 器 高效液相色谱仪中的检测器是三大关键部件 (高压输液泵、色 谱柱、检测器)之一，主要用于检测经色谱柱分离后的组分浓 度的变化，并由记录仪绘出谱图来进行定性、定量分析。一 个理想的液相色谱检测器应具备以下特征：灵敏度高；对所 有的溶质都有快速响应；响应对流动相流量和温度变化都不 敏感；不引起柱外谱带扩展；线性范围宽；适用的范围广。 可惜至今没有一种检测器能完全具备这些特征。 常用的检测器为紫外吸收检测器 (UVD)、折光指数检测器 (RID)、电导检测器(ECD)和荧光检测器(FD)。 在高效液相色谱技术发展中，检测器至今是一个薄弱环节， 它没有相当于气相色谱中使用的热导池检测器和氢火焰离子 化检测器那样的即通用又灵敏的检测器。但近几年出现的蒸 发激光散射检测器(ELSD)有望成为高效液相色谱全新的通用 灵敏的质量检测器。
第四节 高效液相色谱仪简介 高效液相色谱仪可分为分析型和制备型，虽然它们的性能 各异、应用范围不同，但其基本组件是相似的，对分析型商品 仪器可有如下两种组合方式： ①完全紧凑的整体系统。其死体积小，灵敏度高，体现高 效液相色谱仪总体实用的特点。 ②独立部件的组合系统。其灵活性高，可根据不同的分析 目的，组装成不同的联接方式。 现在用微处理机控制的高效液相色谱仪，其自动化程度很 高，即能控制仪器的操作参数 ( 如溶剂梯度洗脱、流动相流量、 柱温、自动进样、洗脱液收集、检测器功能等 ) ，又能对获得 的色谱图进行收缩、放大、叠加，以及对保留数据和峰高、峰 面积进行处理等，为色谱分析工作者提供了高效率、功能齐全 的分析工具。
（二）柱连接方式 柱接头通过过滤片与色谱柱管连接，在色谱柱管的上 下两端要安装过滤片，过滤片一般用多孔不锈钢烧结 材料。此烧结片上的孔径小于填料颗粒直径，却可让 流动相顺利通过，并可阻挡流动相中的极小固体颗粒， 柱出、入口的连接管的死体积亦 应愈小愈好，一般常用窄孔 (内径0.13mm)的厚壁(1.5— 2.0mm)不锈钢管，以减少柱 外死体积。所用柱接头，联 接螺帽，密封圈及色谱柱接 头皆为不锈钢材料。
高效液相色谱法测定保健食品纳豆红曲茶多酚软胶囊中洛伐他汀的方法
高效液相色谱法测定保健食品纳豆红曲茶多酚软胶囊中洛伐他汀的方法季加才，孟凡荣（山东润达检测技术有限公司，山东潍坊 261000）摘 要：目的：本文建立高效液相色谱法测定保健食品中（以纳豆红曲茶多酚软胶囊为例）洛伐他汀的方法。
方法：样品经乙腈提取后，用液相色谱C18柱分离，二元流动相洗脱，238 nm波长下紫外检测器检测，测定精密度、准确度。
结果：洛伐他汀在10～200 μg·mL-1线性关系良好，相关系数＞0.999 9，相对标准偏差为0.62%。
当加标浓度为0.5 mg时，回收率为98.8%；当加标浓度为1.0 mg时，回收率为102.7%；当加标浓度为1.5 mg时，回收率为99.7%。
结论：本方法检测灵敏度高、操作简单、定性定量准确、针对性强，为纳豆红曲茶多酚软胶囊质量控制和深度开发提供了科学依据。
关键词：高效液相色谱法；洛伐他汀；纳豆红曲茶多酚软胶囊Determination of Lovastatin in Health Food Natto Monascus Tea Polyphenol Soft Capsules by High Performance LiquidChromatographyJI Jiacai, MENG Fanrong(Shandong Runda Testing Technology Co., Ltd., Weifang 261000, China) Abstract: Objective: To establish a method for the determination of lovastatin in health food by high performance liquid chromatography. Method: After being extracted with acetonitrile, the sample was separated using a liquid chromatography C18 column, eluted with a binary mobile phase, and detected with a UV detector at a wavelength of 238 nm for precision and accuracy. Result: The linear range of lovastatin was 10～200 μg·mL-1, the correlation coefficient was more than 0.999 9, and the relative standard deviation was 0.62%. When the concentration was 0.5 mg, the recovery rate was 98.8%. When the concentration was 1.0 mg, the recovery rate was 102.7%. When the concentration was 1.5 mg, the recovery rate was 99.7%. Conclusion : This method has high sensitivity, simple operation, accurate qualitative and quantitative, and strong pertinence. It provides a scientific basis for the quality control and in-depth development of natto monascus tea polyphenol soft capsule.Keywords: high performance liquid chromatography; lovastatin; natto monascus tea polyphenol soft capsules洛伐他汀由红曲霉在其生长后期产生，能有效降低血浆胆固醇[1]。
高效液相色谱分析原理及流程
高效液相色谱分析原理及流程高效液相色谱以经典的液相色谱为基础，是以高压下的液体为流动相的色谱过程。
通常所说的柱层析、薄层层析或纸层析就是经典的液相色谱。
所用的固定相为大于100um的吸附剂(硅胶、氧化铝等)。
这种传统的液相色谱所用的固定相粒度大，传质扩散慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单混合物的分离。
而高效液相所用的固定相粒度小(5um-10um)、传质快、柱效高。
高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。
近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等应用广泛。
世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。
高效液相色谱分析原理(一)高效液相色谱分析的流程由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离(极性范围比较宽)还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
(二)高效液相色谱的分离过程同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
高效液相色谱法测定小儿清热口服液中绿原酸的含量
数所 制备 出 的不 含金 银 花的小 儿清 热 口服 液 ，并 以这一溶 液 为样 品 ，采 用与 对照 品 溶液 制备 相 同的方法 制备 出 阴性液 。 ２ ． ５ 药 材液 的配制 同样 需要 进行 精 密 称 取 ，并 将 所 称 取 的０ ． １ ５ ｇ 药 材放 置 到 到 具 塞锥 形 瓶 中 ， 注 ：样 品 中含 量 均为 ２ ． １ ３ ｍｇ ，ｎ ＝ ３ 加入５ ０ ｍ Ｌ 浓度为５ ０ ％的 甲醇 溶 液 之 后 将 瓶塞 塞 紧 ，然后 称量 其 重量 ，并对 其进 行 表 ２ 绿原 酸含 量测 定结 果 时长 为半 个小 时 的超 声 处理 。然后 待溶 液 冷却 后 ，再 称量 其重 量 ，并 用５ ０ ％甲醇 将 所损 失 的重量 补充 回来 ，并摇 匀 。 ２ ． ６ 标 准 曲线 的绘制 精 密 量 取 绿 原 酸 对 照 品２ 号 溶 液 ２ ，４， ５ ，６，８ ｌ 进 样 测 定 ， 以 绿 原 关 联 。在本 试验 中 ，最 初使 用 的流动 相 ： 酸进 样量 （ ｇ ）为 横 坐 标 ，峰 面 积 积 甲醇 一 水一 乙腈 一 冰 醋酸 的 比例 为 ３ ：９ ７ ： 分值 为 纵坐 标绘 图。其 回归方 程为 ： １ ２ ：３ ，在 测定 期 间 发现 在 此 流动 相下 样 Ｙ＝７ ８１ ４ ８３ ． ９ ０， Ｘ一１ ５ ３１ ６ ． ８７， ｒ ＝０ ． ９９ ９ ９， 品的分 离效 果不 理想 ，很容 易造 成绿 原酸 绿原 酸标 准 品在０ ． ２ ０ １ — ０ ． ８ ０ ７ ｇ 与峰 面积 峰拖尾 问题 ，为 此我们 对 流动相 进行 了一 有 良好 的线性 关 系。 定 的变 动 ，将 乙腈 换位 了四氢 呋喃 。在经 ２ ． ７ 精 密度 试验 过调整 后 ，样 品的分 离达 到 了理 想效 果 。 按照测 定方法 重复进 样５ 次 ，绿 原 并 为之 后 的绿原 酸含量 测定 提供 了 良好条 酸 峰 面 积 积 分 值 相 对 标 准 偏 差 ＲＳ Ｄ＝ 件 。在 对绿 原酸 进行含 量测 定 时采用 高效 １ ． ３ ３ ％。 液相 色谱 法 不 但 操 作 简 便 ，且 检 测 效 果 ２ ． ８ 重 现性 试验 好 ，能够使 绿原 酸和其 他成 分 实现基 线分 按 照测 定 方法 重 复测 定 ５ 份 样 品 ，绿 离 ，保 证 了检测 结果 的准确 性 。 原 酸含量 的相 对标 准偏 差Ｒ Ｓ Ｄ ＝ ０ ． ４ ％。 事 实 上 ，绿 原 酸 含 量 检 测 不 但 对 小 ２ ． ９ 加 样 回收率 试验 儿 清 热 口服液 的生 产 质 量 保 证 有 很 大 意 精 密量 取５ 份样 品 （ 批 号 ：１ １ ０ ６ １ ８ ） 义 ，其 在其 他请 热类 药物 的生 产 中也 往往 各０ ． ５ ｍＬ ，置 ５ ０ ｍＬ ，容 量 瓶 中 ，精 密 吸 需 要进 行要 有效 检测 。 因为绿 原酸本 身存 取 各 样 品液 ，分 别 精 密 加 入 绿 原 酸 对 照 在于金 银花 中，所 以只要 药物 成分 中有金 品２ 号溶液０ ． ９ ０ ｍＬ 、１ ． ０ ９ ｍ Ｌ、１ ． Ｏ Ｏ ｍＬ 、 银 花都 会有 绿原 酸 ，绿原 酸 的杀菌 功能较 １ ． ０ ４ ｍ Ｌ 、１ ． ０ ０ ｍＬ ，用 ５ ０ ％甲 醇定 容 至 刻 为显 著 ，在 多种 感 冒清热 药物 中发 挥积极 度 ，摇匀 即得 。按 上述 色谱 条件 测定 ，以 作用 ，为此 必须 要确 保这类 药 物 中绿原 酸 下 式 计算 回收 率 ，结 果如 表 １ 结果表明， 的含 量符合 相关 要求 。而 高效 液相 色谱 法 本 方法具 有 良好 的 回收率 。 完全 可 以作 为一 种检 测方 法应 用在 这些 药 ２ ． １ ０样 品测定 物 的绿原 酸含量 检测 中 。 精密量取样品液１ ０ Ｌ 进样 ，依照上 参 考文献 述 色谱条 件 进行含 量测 定 ，结果 见表 ２ 。 『 １ １ 崔岚 ，祝德 秋 ，王 晓 珉 ， 罗启 剑 ， 曹 结语 惠明 ． 反 相 高效 液相 色谱 法 测 定清 炎颗 粒 由本 实 验 可 以得 知 ，在 对 小 儿 清 热 中绿 原 酸的含 量 卟 中国 药房 ， ２ ０ ０ ４ （ ０ ６） ． 口服液 中 的绿原 酸含量 进行 测定 时 ，采用 『 ２ １ 赵 霞，杨 丽 ． ＨＰ Ｌ Ｃ法 测 定双 黄连 颗 粒 高效液 相色 谱法 是非 常可行 的 。而其 测定 中绿 原 酸的含 量 ［ Ｉ １ ． 中国药事 ， ２ ０ １ ２ （ ０ １ ） ． 效 果与效 率 在很 大程度 上 与流动 相有 较大
《高效液相色谱》 (2)幻灯片
键合固定相分配色谱(LSPC)
有机分子通过化学反 应键合到载体表面
分配色谱–别离原理
不同组分在两相间分配系数不同
分配色谱固定相
固定相 --- 物理吸附 （担体 + 固定液）
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基 团 离子交换基团
中分子局部进入多孔中，一般保存 小分子完全进入多孔中，长时间保存。
排阻色谱固定相
1. 软凝胶：铰链葡萄糖的多孔聚合物， 聚丙烯酰胺凝胶。（凝胶过滤色谱）
2. 半硬凝胶：聚苯乙烯珠（凝胶渗透色谱）
3. 高硬凝胶和玻璃：多孔玻璃或多孔硅球， 经化学键合处理，不随压力及溶剂改变 尺寸，（高效排阻色 谱）
离子交换色谱
分离原理
各种离子根据它们与树脂上的交换
基团的交换能力的不同而得到分离。
固定相
固定相为离子交换树脂， 流动相为无机酸或无机碱 的水溶液。
分离对象 离子或可离解的化合物
（无机离子、氨基酸、蛋白质等）
排阻色谱法
(凝胶色谱法)
分离原理
根大据分样子品不分能子进尺入寸多大孔小中分，离不被保存，随 Vm流出
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所 组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰 基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正 相HPLC。
反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱 体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相 是十八烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲 醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式。
O S SO ii HC O S lO i C H S l i3 ) ( 2 R CO H SO i Si3 ) ( 2 R CH
高效液相色谱法测定皮炎宁酊中间苯二酚和水杨酸的含量
留时间为
苯酚的保留时间为
∀信噪
比为 Β 时 苯酚的最低检出质量浓度为
Ξ 本文收稿日期
修回日期
期
郭兴杰等 高效液相色谱法测定皮炎宁酊中间苯二酚和水杨酸的含量
Ù ∀ 的分解产物因未找到对照品 无法鉴定和 计算最低检测质量浓度∀ 样品中其它成分在检测波 长下无吸收 不干扰测定 空白基质色谱图 不加 和 与基线完全重合∀
均未见有二者同时测定的液相色谱法∀ 本文应用反
相
测定了皮炎宁酊中 和 和含量 方法简
单 可靠∀ 在选择的色谱条件下 和 可与其降解
产物及杂质完全分开∀
实验部分
仪器和试药
日立 液相色谱仪 可变紫外检测器
数据处理机∀
和 对照品由沈阳市药品检验所提供 皮炎
宁酊为市售品 其它试剂均为分析纯∀
色谱条件
间苯二酚
∀
苯酚 苯酚是中国药典规定的 和 原料药中需要
检查的杂质∀ 采用 ς 甲醇 Β ς 水
Β 作流
动相 因 和 分离度太小 故无法将其与上述杂质
分开∀ 增加流动相中水的体积分数 二者分离度变
大 但 的色谱峰拖尾明显∀ 所以 我们在流动相中
加入少量的乙酸 可使两种主要成分和杂质得到很
好的分离 见图 ∀ 由图 可见 的分解产物保
Λ 记录峰面积∀线性关系见表 ∀结果表明 在
∗ Ù和 在 ∗
Ù 范围内
线性关系良好∀ 信噪比为 Β 时 两组分的最低检
出质量浓度均为 Ù ∀
表 线性关系
Τ αβλε 组分
间苯二酚 Χ
Λινεαρ ρελατιονσηι 回归方程
≅
≅
ρ Α
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3) 溶剂准备：脱气
目 的
3、HPLC中的基本概念和术语
色谱图和峰参数
色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到 的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。 基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后， 检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时 过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如 电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物 或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。
色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的 曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲 线（高斯Gauss曲线）。 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基 线的两个交点间的距离。 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的 峰宽。 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动 相（溶剂）通过色谱柱的时间。 保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在 柱后出现浓度极大值的时间。
注意：1：每张滤膜只能用一次。
பைடு நூலகம்
2：水相和有机相不要搞混。
2．流动相的配制
流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组 分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 流动相的黏度要尽量小 分离效果好 柱压低，延长液体泵的使用寿命
(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)
30%
梯度洗脱是 HPLC 的常用手段
梯度洗脱装置 流动相中含有两种或两种以上不同极性的 溶剂，在洗脱过程中连续或间断的改变流动相
的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分
都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分
离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改
善检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序 升温技术。
-NH2、 -CN
其它 (手性柱， 离子交换柱): 10%
柱温箱
控制温度，保证分析结果重
现性
升高温度，降低了流动相的
黏度，降低柱压，保证色谱 系统的稳定性
升温对于反相 HPLC分离强疏水肽的影响 (B27)
室温 300C 400C
液相色谱柱: C18 色谱柱尺寸: 4.6 x 250 mm 5µ m
二、上机操作前，我们 需要准备好什么？
如：样品怎么处理？ 流动相怎么选？ 仪器参数怎么设置？
1．样品的前处理
最好使用流动相溶解样品。 使用预处理除去样品中的强极性或与柱填 料产生不可逆吸附的杂质。 使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
样品准备
过滤样品，确保样品中不含固体颗粒
用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品
检测器简介（五）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组 成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型 化合物。
◆ 示差折光指数检测器（RID） 原理：监测参比池和测量池中溶液 的折射率之差来测量试样浓度的检 测器。 特点：通用性检测器，温变化要保 持在±0.001℃、灵敏度低（10-6g）
滤膜类型：
聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何 可溶物。
醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶 液，推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用 于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样 品和有机溶剂。
高效液相色谱 （HPLC）
主讲：郝凤霞
能源化工重点实验室
目录
基础理论 上机操作前的准备工作 Agillent 1100 的操作 常见故障排除 HPLC在科研中的应用
一、基础理论
1、色谱柱的分离原理
溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作 用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的 大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同， 从而先后从固定相中流出。
3、打开电脑，等待TAP窗口出现
4、打开1100各模块开关
指示灯状态
每个部件接通电源后 LED灯显示绿色
荧光 电化学 示差折光
检测器
通用型
蒸发光散射 质谱
药典中的液相检测器
检测器简介（一）
◆
紫外吸收检测器（UVD）
原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的 变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长 可变和光二极管阵列三种类型。
特点：选择性检测器、波长检测范围：190-800nm ； 对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）； 应用最广，对大部分有机化合物有响应； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。 定量基础：Lambert-Beer定律，A＝Kbc
进样量尽量小
样品完全溶解在流动相中
样品没有完全溶解
样品过滤头的类型：
30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两 种规格材料有，纤维素，醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理样 品体积少于50μl。 13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种 规格。 3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两 种规格。处理样品体积为7μl。
检测器简介（二）
光电二极管阵列检测器
紫外检测器的重要进展； 光电二极管阵列检测器： 1024个二极管阵列，各检测特定波 长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。
2017/11/8
检测器简介（三）
荧光检测器（fluorescence detector） （FLD） 原理：某些溶质在紫外光激发后 能发射可见光（荧光）的性质检 测。 特点：选择性检测器、灵敏度高 （10-12g）、对流量和温度敏感 性低。 对多环芳烃，维生素B、黄曲 霉素、卟啉类化合物、农药、药 物、氨基酸、甾类化合物等有响 应。
进样器 样品引入系统 色谱柱 关键部分，在这里样品实现分离 检测器 对分离后的样品进行检测 数据记录与处理装置
HPLC的系统组成
输液系统 进样系统 分离系统
数据分析 系统
检测系统
数据处理系统
Agilent 1100 高效液相色谱仪
储液瓶
真空脱气机 混合室
自动进样器
分离柱
VWD
手动进样
常用的脱气方法
氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦 脱气，效果较好，但成本高。 加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：易抽走有机相。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡1015min，此法效果最差。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术， 在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明 显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。
流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解 气体。 以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测 器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的 噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。 溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱 中固定相发生降解而改变柱的分离性能。 若用FLD，可能会造成荧光猝灭。
检测器简介（四）
◆ 蒸发光散射检测器（ELSD）
原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱 柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气） 喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸 发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载 气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取 决于溶质颗粒的大小与数量。 特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高， 是通用型检测器。
5．记录时间
第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶 液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长 时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样 品中被分析组分峰的位置、分离度及是否还 有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是 否会影响主峰的测定。
三、Agilent 1100 机器操作
1、检查流动相
Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态
流动相的洗脱方式 洗脱方式
低压梯度
等度洗脱
高压梯度
等度洗脱
输液泵
进样器 柱温箱 色谱柱 检测器
单一或混合溶剂
梯度洗脱
A 进样器 A泵
B 浓度
色谱柱
检测器
柱温箱
B
B泵
时间
等度洗脱
MeOH / H2O = 4 / 6
分析时间长
分离度差
MeOH / H2O = 8 / 2
梯度洗脱
95% MeOH 浓 度
自动进样
六通阀进样演示
分离系统－色谱柱
功能： 组分分离 目标： 分辨力强 效率高
吸附剂－－－化学键和固定相色谱柱