水貂肠炎病毒VP2基因的原核表达及鉴定

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山东地区水貂肠炎病毒VP2基因的克隆和测序分析

山东地区水貂肠炎病毒VP2基因的克隆和测序分析陈童;杨瑞梅;单虎【摘要】本研究对潍坊、烟台、威海和青岛地区的疑似水貂病毒性肠炎病毒(MEV)粪便样品进行检测,并在9份样品QD1309、QDI407、WH1407、WH1408、WH1508、WH1509、WF1310、WF1408、YT1408中扩增出VP2基因,和GenBank上已经公布的4株MEV参考株的VP2基因进行序列分析,结果显示,13份MEV VP2基因的核苷酸和氨基酸均有较高的同源性,分别为97.5％～99.8％和96.9％～99.7％.系统发育进化树表明,QD1309、YT1408、MEV-Beregovoj-Bincentr(MEV-BB)、MEV-e属于同一个组群,不同毒株主要在第5、62、87、101、232、236、279、300、534位氨基酸发生了替换.本研究对水貂细小病毒流行株的主要衣壳蛋白VP2的编码蛋白进行遗传变异分析,为更好地预防和控制貂源细小病毒提供基础.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2016(052)012【总页数】4页(P28-30,34)【关键词】水貂肠炎病毒;VP2基因;遗传变异分析【作者】陈童;杨瑞梅;单虎【作者单位】青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109;青岛农业大学山东省预防兽医学重点实验室,山东青岛266109【正文语种】中文【中图分类】Q78水貂病毒性肠炎病毒(mink enteritis virus，MEV)引起的主要临床症状是剧烈腹泻，肠道出血，肠内容物呈煤焦油状。

MEV为单股负链DNA病毒，属于细小病毒科细小病毒属，基因组全长约为5 kb，其基因组含有2个开放阅读框，其中一个调控病毒复制的非结构蛋白NS1和NS2，另一个组呈衣壳结构蛋白VP1和VP2 [1]。

VP2蛋白是细小病毒的主要衣壳蛋白，其对病毒的宿主范围、组织嗜性、抗原性、血凝性等起重要作用。

水貂阿留申病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备

，
（￡ｕｏｆＰｏｕｌｔｒｙ，ＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｆＡｏｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ￣ＲｅｓｅａｒｃｈＣｅ￣ｅｒｆｏＳｐｅｃｉａｌＥｃｏｎｏｍｉｃＡｎｉｍａｌ，Ｊｉｎａｎ２５００２３，Ｃｈｉｎａ）
ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｙＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＡｌｅｕｔｉａｎＭｉｎｋＤｉｓｅａｓｅＰａｒｖｏｖｉｒｕｓＶＰ２Ｐｒｏｔｅｉｎ
ＪｉａｎｇＹｉｆｅｉ，ＹｕＫｅｘｉａｎｇ，ＬｉｎＳｈｕｑｉａｎ，ＺｈａｎｇＳｉｒｓｐｌｅｅｎｃｅｌｌｓｗｅｒｅｆｕｓｅｄｗｉｔｈｍｙｅｌｏｍａｃｅｌｌｓ．Ｔｈｒｅｅｈｙｂｒｉｄｏｍａｃｅｌｌｌｉｎｅｓｏｆ１Ｆ４Ｆ７Ｄ９，３Ｅ９Ｇ３ＩＭａｎｄ４Ｂ８Ｂ３Ｆ８ｗｅｒｅｇａｉｎｅｄａｎｄｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｍｉｃｅｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｉｎｄｉｒｅｃｔＥＳＩＬＡｓｈｏｗｅｄｈａｔｔｈｅｔｔｉｔｅｒｓｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｉｎ３ｍｏｕｓｅａｓｃｉｔｅｓｗｅｒｅｌｌａａｂｏｖｅ１０．ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｌｅｕｔｉａｎｍｉｎｋｄｉｓｅａｓｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ；ＶＰ２ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ；ＭｏｎｏｃｌｏｎＭａｎｔｉｂｏｄｙ

水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

动物医学进展，２０１５，３６（４）：１５－１８
Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
水貂阿留申病病毒ＶＰ２截短基因的原核表达
李晶，时坤，曾范利，宋继伟，杜锐。
ＬＩＵＳｉ — ｙｕａｎ，ＷＡＮＧＬｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｎ — ｎａ，ＧＡＯＹｕ — ｑｉａｏ，ＺＨＡＯＢａｏ — ｈｕａ
（ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＨｅｂｅｉＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓ＾缸＾口ｎｇ，Ｈｅｂｅｉ，０５００２４，Ｃｈｉｎａ）
水貂阿留申病（Ａｌｅｕｔｉａｎｄｉｓｅａｓｅｏｆｍｉｎｋ，ＡＤ）是由水貂阿留申病病毒（Ａｌｅｕｔｉａｎｍｉｎｋｄｉｓｅａｓｅｖｉ一
ｒｕｓ，ＡＤＶ）引起的一种慢性病毒性传染病，可引发机
（１．吉林农业大学动物科技学院，吉林长春１３０１１８；２．吉林市人民医院，吉林吉林１３２００１；３．教育部动物生产及产品质量安全重点实验室，吉林省药用动物二级实验室，吉林长春１３０１１８）
腹泻的研究［Ｊ］．农业技术与装备，２０１１（Ｉ１）：６４ — ６５．［１５］崔娟娟，郝秀静，张斯民，等．猪肺炎支原体的免疫原蛋白及疫苗的研究进展［Ｊ］．家畜生态学报，２０１３，３４（３）：８２ — ８７．

水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达

水貂阿留申病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达梁冬莹;华育平;曾祥伟【期刊名称】《东北林业大学学报》【年(卷),期】2007(035)006【摘要】根据GenBank中已发表的水貂阿留申病毒(ADV)VP2基因核苷酸序列分别设计合成两对引物,用PCR方法扩增ADV国内分离株VP2基因中主要抗原表位区的两个片段,分别将其克隆到原核表达载体pMAL-c2的多克隆位点中.经酶切、PCR扩增和测序分析证实其已正确插入到表达载体中,且阅读框是正确的,构建原核表达载体pMAL-VPa和pMAL-VPb.阳性重组质粒转化宿主菌TB1,用IPTG进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE检测和免疫印迹分析.结果表明两段蛋白均获得了表达,表达产物的分子质量分别约为63、65kD,与理论推测的分子质量一致;并在终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导下,4 h时其表达量达到高峰;Western blot分析表明表达蛋白能被兔抗MBP抗体所识别,具有一定的抗原性.【总页数】3页(P39-41)【作者】梁冬莹;华育平;曾祥伟【作者单位】东北林业大学,哈尔滨,150040;东北林业大学,哈尔滨,150040;东北林业大学,哈尔滨,150040【正文语种】中文【中图分类】S851.6【相关文献】1.虎源猫泛白细胞减少症病毒VP2基因主要抗原表位区的原核表达和蛋白纯化 [J], 田丽红;华育平2.水貂阿留申病毒VP2蛋白主要抗原表位基因原核表达及其检测应用 [J], 曾祥伟;华育平;梁冬莹3.水貂阿留申病毒部分VP2基因的原核表达及免疫学分析 [J], 刘立兵;冯海峰;石坤;李健明;甘露;刘东旭;杜锐4.犬细小病毒VP2基因编码主要抗原表位区的核酸免疫及其免疫原性研究 [J], 吴植;曹斌;贺生中;戴建华;吴迪5.水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及初步应用 [J], 徐磊;闫喜军;张蕾;柴秀丽;赵建军;张海玲;高晗;白雪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

一株水貂阿留申病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析

生物工程（连）限公司；蛋白酶、ＭＥ购自大有胰ＤＭ
Ｉｖｔｇｎ公司；ａＮ聚合酶、ＮＰＤ２００ｎｉｏｅｒＴｑＤＡｄＴ、Ｉ０
ＤＡＭａｋｒ感受态大肠杆菌Ｄ－ｃ小量胶回收试Ｎｒｅ、Ｉ￣Ｉ、Ｓ
Ｅ— ｉ：ｈｎｙｌｇｙｈｏｃｎ．ｎｍａｌｚａｇｎｎ＠ａｏ．ｏ１ｃ。
１试验材料
病料山东威海养殖户送检的疑似ＡＶ感染致Ｄ死的水貂样本，采集其实质器官，一０℃保存。置于２试剂和细胞蛋白酶Ｋ、ＭＤ８Ｔ载体购自宝Ｐ１一
ｔｅＶ２ｇｎｅｕｎｅｅｏｅａｄａｔｒｓｐｒｔｎｗｕｄｂｅｕｎｅ．ＴｅｒｓｔｅｅｃｍｐｒｄｗｔｔｅＤＶＶＰｈＰｅｅｓｑｅｃｓｂｆｒｎｆｅａａｉｏｌｅｓｑｅｃｄｅｏｈｅｕｓｗｒｏａｅｉｏｈｒＡ２ｌｈ
ｇｎｅｕｎｅｂａｎｄｆｏｔｅＧｅＢｎ．ＡｓｒｉｆＡＤｅｅｓｑｅｃｓｏｔｅｒｍｈｎａｋｔａｎｏＶ。ｗｉｈｃｕｄｇｏｏｍａｌｎＣＲＦｃＨｎｍｅＶ．ｉｈｃｏｒｗｎｒｌｉｌｙＫｅｓ（ａｄＡＤＺ１．ｗｓｏｔｉｅ．ＡｍｉｏａｉｅｕｎｅａａｙｉｉｄｃｔｓｔａｅＶＰｒｔｉｅｕｎｅｏｅＡＤＶ．ＹＬｔａｎｈｓＹＬ）ａｂａｎｄｎｃｄｓｑｅｃｎｌｓｓｎｉａｅｈｔｔ２ｐｏｅｎｓｑｅｃｆｈｈｔＺ１ｓｒｉａ

水貂阿留申病诊断技术的进展

水貂阿留申病诊断技术的进展李俚; 胡哲; 孙金辉; 关东嵩; 方孟颀; 王晓钧; 路义鑫【期刊名称】《《中国兽医杂志》》【年(卷),期】2018(054)011【总页数】3页(P58-60)【作者】李俚; 胡哲; 孙金辉; 关东嵩; 方孟颀; 王晓钧; 路义鑫【作者单位】东北农业大学动物医学学院黑龙江哈尔滨150030; 哈尔滨海关黑龙江哈尔滨150028; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室黑龙江哈尔滨150069; 大庆海关黑龙江大庆163311【正文语种】中文【中图分类】S858.92水貂阿留申病(AMD)是由水貂阿留申病毒(AMDV)引起的一种能够引起自身免疫紊乱的慢性进行性传染病。

引起该病的病毒可感染各个年龄段的水貂,依据感染毒株类型的不同,病症呈多样性。

对新生仔貂而言,AMDV 引起的死亡率几乎可达到100%;而对于成年水貂,该病通常引起水貂的持续感染,并表现为终生病毒血症、高蛋白血症、动脉血管炎和由病毒-抗体复合体诱导的肾小球肾炎及肝炎等。

临床上还没有能够防治AMD 的有效疫苗和药物,因此目前防控该病的手段主要为水貂新引入前的检疫、场址的彻底消毒,以及感染貂群中病畜的扑杀。

大多数情况下,水貂感染AMD 后没有典型的临床症状,确诊主要依赖于实验室的检测。

本文对近年来国内外AMD 的主要诊断方法及特点进行综述,以期为新水貂引入前的检疫、环境消毒效果的评价及感染貂场AMD 的防控提供方法依据。

1 AMDV 的血清学检测方法1.1 碘凝集试验(IAT) IAT 是1962 年由Henson等[1]最先用于鉴别AMD 的血清学方法。

因该方法成本低廉、操作简单,所以很容易被推广。

但水貂感染AMDV后产生的丙种球蛋白水平通常需要1个月的时间才能被检测到,因此IAT 不适用于AMD初期感染的检测。

另外,IAT 为非特异性试验,对能够产生高丙种球蛋白血症的其他慢性疾病,如结核病和肾病等同样可以发生反应,所以单纯使用该法无法达到根除AMD 的目的,目前IAT 已很少被规模化的水貂养殖场采用。

水貂肠炎病毒LN-10分离株的分离鉴定

水貂肠炎病毒LN-10分离株的分离鉴定王建科;易立;许红丽;杨莘;程悦宁;程世鹏;武华;闫喜军【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2012(034)006【摘要】To investigate the prevalence of mink enteritis virus (MEV), we isolated a virus from mink with clinical signs of enteritis. This virus was identified as MEV by electron microscope examination, serologic test, artificial infection in minks and the VP2 gene sequencing (HQ694567), designated LN-10. Furthermore, the phylogenetic analysis of the VP2 gene indicated that the MEV LN-10 VP2 gene shared higher homology with other 18 MEV strains available in GenBank. The homology of nucleotide and deduced amino acids were from 99.3% to 100% and 99% to 100%, respectively. The highest degree was 100% with ZYU strain for nucleotide homology and 100% with ZYL-1 and Manzhouli strains for deduced amino acids homology. This study provided the basis evidence for molecular epidemiology investigation and development of vaccine against viral mink enteritis.%为了解我国水貂肠炎病毒(MEV)的流行情况,本研究采用F81细胞从疑似患有肠炎的水貂粪便样品中分离出一株病毒,经形态学、血清学、动物回归试验和分子生物学鉴定,分离的病毒为MEV,命名为LN-10.对该病毒主要结构蛋白VP2基因进行克隆测序和基因进化分析表明,LN-10分离株VP2基因与GenBank中的其他18株MEV株核苷酸和氨基酸均有较高的同源性,分别为99.3％～100％和99％～100％,其中核苷酸同源性与ZYL-1株为100％,而氨基酸同源性与ZYL-I株和Manzhouli株均为100％.本研究为MEV分子流行病学调查和疫苗的研究奠定了基础.【总页数】4页(P440-443)【作者】王建科;易立;许红丽;杨莘;程悦宁;程世鹏;武华;闫喜军【作者单位】中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,吉林吉林132109;中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,吉林吉林132109;中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,吉林吉林132109;中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,吉林吉林132109;中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,吉林吉林132109;中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,吉林吉林132109;中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,吉林吉林132109;中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室,吉林吉林132109【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.一株水貂阿留申病毒的分离鉴定及VP2基因序列分析 [J], 桑宇;张段玲;钱毓斌;张彦龙2.水貂犬瘟热病毒RC01株和细小病毒RC02株的分离鉴定及攻毒保护试验 [J], 赵益超;糜飞;张伟3.一株水貂源伪狂犬病毒株的分离鉴定 [J], 李富金;王蕾;李金波;秦绪伟4.水貂肠炎细小病毒的分离鉴定及其VP2基因的序列分析 [J], 张庆明;王玉平;李莹莹;闫新武;雷连成5.水貂肠炎细小病毒分离鉴定 [J], 闫喜军;柴秀丽;吴威;王凤雪;邵西群;赵传芳;姜莉莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

水貂阿留申病毒VP2蛋白Dot—ELISA检测方法的建立

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｒａｐｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＡｌｅｕｔｉａｎｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ（ＡＤＶ），ＶＰ２ｇｅｎｅｏｆＡＤＶ
率为８４．６％，ＣＩＥＰ的阳性检出率为８０．８％，敏感性高于ＣＩＥＰ，两者符合率为９６．２％。本研究建立的Ｄｏｔ．ＥＬＩＳＡ
检测方法简便、快速、灵敏、特异、重复性好，适合基层单位用于水貂阿留申病快速诊断和疫病普查。关键词：水貂阿留申病毒；ＶＰ２基因；原核表达；Ｄｏｔ．ＥＬＩＳＡ检测
Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ＪｉｌｉｎＡｇｒｉｃｕｌｕｒｔａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３０１１８，Ｃｈｉｎａ；３．Ｌｅｖｅｌ２ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｅｄｉｃａｌＡｎｉｍａｌｏｆＪｉｌｉｎＰｒｏｖｉｎｃｅ，
ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８ — ０５８９．２０１５．０８．１２
水貂阿留申病毒ＶＰ２蛋白Ｄｏｔ — ＥＬＩＳＡ检测方法的建立

水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及初步应用.pdf

0引言水貂阿留申病(Aleutian disease of mink,AD)是由水貂阿留申病细小病毒(Aleutian mink disease parvovi-rus,ADV)引发的水貂的一种慢性消耗性疾病。

1946年，G ·Hartsough 在“阿留申貂”中首次观察到该病。

1956年，Hartsough 和Gorham 确定该病为阿留申病病毒所致[1]。

AD 一直是危害世界养貂业健康发展的一大隐患。

到目前为止唯一可行的防治方法就是通过多基金项目：科技部科研院所社会公益研究专项“野生动物重要传染病生态学发生，监测和控制技术”（2005DIB4J048）。

第一作者简介：徐磊，男，1983年出生，山东日照人，在读研究生，研究方向：水貂阿留申病毒分子生物学。

通信地址：130122吉林省长春市净月旅游开发区柳莺西路388号，中国农业科学院特产研究所，Tel ：*************，E-mail ：****************。

通讯作者：闫喜军，男，1970年出生，吉林省大安市人，研究员，博士，研究方向：野生经济动物传染病学。

通信地址：130122吉林省长春市净月旅游开发区柳莺西路388号，中国农业科学院特产研究所，Tel ：*************，E-mail ：*******************。

收稿日期：2009-10-20，修回日期：2010-01-04。

水貂阿留申病毒VP2基因的原核表达及初步应用徐磊，闫喜军，张蕾，柴秀丽，赵建军，张海玲，高晗，白雪（中国农业科学院特产研究所，长春130122）摘要：将水貂阿留申病毒ADV-G 株VP2基因中主要抗原表位区的2个片段，分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点中，鉴定后得到重组质粒pET-VP2a 和pET-VP2b ，将重组质粒转化到宿主菌BL21中，用IPTG 分别以不同浓度，不同诱导时间进行诱导表达，采集样品做SDS-PAGE 、Western-blot 分析，并以此蛋白作为包被抗原进行ELISA 检测。

水貂细小病毒NS1与VP2蛋白的原核表达及免疫原性分析

水貂细小病毒NS1与VP2蛋白的原核表达及免疫原性分析王洋;牛登云;刘昊;胡博;马凡舒;鲁荣光;吕爽;闫喜军【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)006【摘要】为了比较VP2和NS1两种蛋白的免疫原性,选择免疫原性较好的蛋白进行亚单位疫苗制备.本试验分别扩增了水貂细小病毒(mink enteritis virus,MEV) NS1与VP2基因,连接pET-32a表达载体并进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE 及Western blotting分析.以His-Bind亲和层析柱纯化目的蛋白,将纯化后的蛋白免疫小鼠,分析目的蛋白的免疫原性.经SDS-PAGE与Western blotting鉴定,表明NS1与VP2蛋白大小分别为83和67 ku,且均具有生物学活性;免疫小鼠后,目的蛋白NS1和VP2均可诱导小鼠产生抗MEV特异性抗体,且VP2蛋白诱导小鼠产生的抗体滴度要高于NS1蛋白.与NS1蛋白比较,VP2蛋白更适合亚单位疫苗的制备.【总页数】5页(P1630-1634)【作者】王洋;牛登云;刘昊;胡博;马凡舒;鲁荣光;吕爽;闫喜军【作者单位】中国农业科学院特产研究所,长春 130112;青岛农业大学动物科技学院,青岛 266109;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112;中国农业科学院特产研究所,长春 130112【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.2【相关文献】1.猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用 [J], 李斐;曹瑞兵;周斌;郑其升;魏建超;李鹏;任雪枫;陈溥言2.水貂阿留申病毒VP2蛋白主要抗原表位基因原核表达及其检测应用 [J], 曾祥伟;华育平;梁冬莹3.犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定 [J], 毛倩倩;卜宾;唐青海;阚云超;姚伦广;唐存多;焦铸锦;杨建伟4.新型鸭细小病毒NS1基因的原核表达及生物信息学分析 [J], 张经伟;李琦;陈宗艳;宫晓华;李国新;温建新;朱杰;李传峰;刘光清5.猪细小病毒3型VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及间接ELISA方法的建立[J], 王广操;崔鹏超;何玉;张梦岩;苑文涛;王先炜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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ｐｌｅａｅｃａｅｃｉ（ＣｏｍｒｓｈｉｒｔｎＰＲ）ａｓｙａｔｎｌｉｇｔｅｅｉｐｏａｎｏｅＶ２ｇｎ．ｈｒｍｅｔＷｌｅｔｙｎａｏｓａｆｒａａｚｐｔｅｄｍｉｆｈＰｅｅＴｅｆｇｎａｃｎｄｉｏｅｙｎｈｏｔａｓｏｎ
墅生
ＣｉｓＪｒＷｌｉ２１３３：１—２ｈｅｕａｏｉｆ０，３（】１１ｎｅｏｌｆｄｅ２ｎｌ８１
水貂肠炎病毒Ｖ２基因的原核表达及鉴定Ｐ
钱毓斌张彦龙
（东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，１０４）５００
《分子克隆实验指南第三版》中的方法对包涵体进行洗涤。具体为将超声波裂解的沉淀重悬于９倍体积的含
０５Ｔｉｎ１０ｊ１ｍｌＬＥＴ（Ｈ８０的裂．％ｒｏＸ— ０口０ｍｏＤＡｐ．）ｔ｝／
解缓＞中，室温放置５ｍｎ ℃ １０中液ｉ，４２００ｇ离心５ｍｎｉ，
ＩＡＡｃＡｃＴＡＣＧＴ。下戈线分别为ＥｏＩＴＡｃＡＣＣＧＴＧＣＡＪｌｃＲＩ和ＸｏＩｈ限制性内切酶位点。预计扩增片段长度８６ｂ。４ｐ
１２方法．
沉淀用８Ｍ尿素重悬，４过夜以溶解包涵体。４ ℃ ℃
ＰＴ一２ｅｔｒｎａｓｒｅｔＥｃｅｃｉ．ｏｉＬ１（Ｅ）．ｅｏｂｎｔｎｐｏｉａｆｃｎｌｅｐｅｓｄａｅＥ３ａｖｃｄｔｎｆｍｄｉｏｓｈｒｈａｃｌＢ２Ｄ３ｏａｒｏｎｉＲｃｍｉｉｒｔｎＷｅｉｔｘｒｓｅｔａｏｅｓｉｅｙｆｒ
法的建立提供良好的抗原物质。
蔓延全国，给水貂养殖业造成了巨大的经济损失
。１材料与方法１１材料．
１１１菌株与血清．．
成熟的病毒粒子中含有３种多肽，Ｖ１（７５、Ｐ７．Ｋ）
Ｖ２（３５Ｐ６．Ｋ）和Ｖ３（３。其中Ｖ２蛋白是构成衣Ｐ６Ｋ）Ｐ壳蛋白的主要成分，具有免疫原性，能够诱导机体产生
ＰｒｋａｙｔｃＥｘｅｓｏｎＩｅｔｆｃｔｏｏｉｋＥｎｅｉｉｒｓＶＰ２ＧｅｏｒｏｉｐｒｓｉｎａｄｄｎｉａｉｎｆＭｎｔｒｔｓＶｉｕｉｎｅ
ＱａｕｉＺａｇＹｎｏｇｉＹｂｎｈｎａｌｎｎ
改变就会影响病毒的生物学特征
，这些特性决定了
辣根过氧化物酶（Ｒ）标记的猪抗兔ＩＨＰｇＧ二抗（自购
Ｄｋａｏ公司）
ｖ２蛋白在病毒感染过程中起着极为重要的作用。本Ｐ
通讯作者：张彦龙，Ｅ—ｍａ：ｚａｇｎｎ＠ｙｈｏｃｍ￣ｉｈｎｙ表的ＭＥＶ２基因序列ｅＢｎＶＰ
（Ｊ９１４，用ＤＡｔ软件分析了该序列的亲水性疏Ｆ５２７）ＮＳｒａ水性和抗原标签，最终设计出１对特异性引物，序列
如：上游引物：５一３：ＣＧＡＴＧＡＧＧＧＧＡＴＣＧＴＧＴ．ＧＡＴＡＡＣ：下游引物：５一３：ＣＧＴＧＧＡＡＣＣＧＣＣＣＡ
ｖｌｐｎ．ｅｏｍｅｔ
Ｋｅｒｓ：Ｍｉｋｅｔｒｔｉｓｙｗｏｄｎｎｅｉｖｒ；ＶＰｅｅ；Ｐｏａｙｔｘｒｓｉｎａｄｉｅｔｃｔｎｉｓｕ２ｇｎｒｋｒｏｉｅｐｅｓｏｎｄｎｉａｉｃｉｆｏ
ＯＥＡＭＧ生物公司。
１１３引物．．
间歇３ｓ，总工作时间２ｉ，功率４０Ｗ。４２００ｇ０ｍｎ５ ℃１０
离心１ｉ，分别收集上清和沉淀（５ｍｎ用与上清等量的ｐＨ７０ＰＳ溶解）进行ＳＳ— ＡＥ分析。．ＢＤＰＧ１２７表达产物的洗涤、溶解和纯化．．经上一步得知表达产物以包涵体方式存在。依照
ｓｎｗｓｏｅｈｇｅｔｆｃｅｃｎｔｅｃｎｉｏ．ｉａｆｈｉｈｓｉｉｎｙｉｈｏｄｔｎｏ１０ｍＭＰＧ．ａ７ｆｒ６ｈｕｓＳｏｔｅｉｆＩＴｔ ℃ ｏｏｒ．ＤＳ—Ｐ３ＡＧＥａａｙｉｓｏｅｈｔｈｎｌｓｓｈｗｄｔａｅｔ
第一作者简介：钱毓斌，男，２５岁，硕士研究生；主要从事动物疾病检验及分子病毒学研究。Ｅ—ｍｉ：ｑｂｕｍａｌ＠１６ｔｍａｌｙｈａｎｏｕ２．ｏ
３期
钱毓斌等：水貂肠炎病毒Ｖ２基因的原核表达及鉴定Ｐ
１９１
１１２主要试剂．．
白具有ＭＥＶ的抗原性，可为今后抗ＭＥＶ单克隆抗体制备及相关免疫学检测方法的建立提供良好的抗原物质。关键词：水貂肠炎病毒；Ｖ２基因：原核表达与鉴定Ｐ
中图分类号：￥５．２８８９文献标识码：Ａ文章编号：１００２（０２３一ｌ８— ４００— １７２１）０１０
１２６表达产物的可溶性分析．．将诱导表达的菌液，４２００ｇ ℃１０离心１ｉ５ｍｎ收集菌体沉淀，ＰＳ洗涤３次，在冰浴上超声破碎。工作２ＳＢ，
ＤＡ凝胶回收试剂盒、各种限制性内切酶、ＴＮ４连接酶，ＤＡＭａｅ、蛋白Ｍｒｅ、ＰＤ８一Ｔ载体等均ＮｒｒｋａｒＭ１ｋ购自宝生物（连）公司；小量质粒提取试剂盒购白大
实现高效表达。诱导表达比较实验结果表明，在３￣７Ｃ，ＩＴＰＧ浓度为１０ｍ．Ｍ，诱导时间为６ｈ，诱导表达达到最大
效率。重组蛋白以包涵体形式存在，大小约为５Ｄ，应用兔抗水貂ＭＶ抗体，经Ｗｅｔｒｂｏｔｇ证该重组蛋０ＫＥｓｎ— ｌｉ验ｅｔｎ
水貂肠炎病毒（Ｖ）又名水貂细小病毒，是引起ＭＥ
水貂以剧烈腹泻为主要临床特征的急性、烈性、高致死性和高度接触性传染病的病原，该传染病称水貂传染性肠炎（ｉｋｉｅｔｕｎｅｔ）或水貂细小病毒性肠Ｍｎｎｃｏｓｅｔｉｓｆｉｒｉ炎，我国于１７９４年首次报道发生本病，此后该病逐渐
摘要：在分析水貂肠炎病毒Ｖ２基因主要抗原位点分布的基础上，设计了１对特异性引物，克隆一段长为８６ｂ，Ｐ４ｐ
编码主要抗原位点的基因片段。将该基因片段定向插入表达载体ＰＴ一２Ｅ３ａ中，转化Ｂ２（Ｅ）菌株，ＩＴＬ１Ｄ３ＰＧ诱导
ｂｉｇｉｄｃｄｗｔＰＧ．ｈｅｕｔｏｅｃｍｐｒｔｅｅｐｒｎｓｆｒｅｐｅｓｎｉｄｃｍｅｔｓｏｄｔａｅｐｏｅｎｅｐｅ・ｅｎｎｕｅｉＩＴＴｅｒｓｌｆｔｏａａｉｘｅｍｅｔｏｘｒｓｉｎｕｅｎｈｗｅｔｔｒｔｉｘｒｓｈｓｈｖｉｏｈｈ
１０离心１ｉ，取上清进行ＳＳ— ＡＥ电泳。电２００ｇ５ｍｎＤＰＧ泳结束后，借鉴康彬的方法，先用考马斯亮蓝染色２ｉ，蒸馏水＞干净，在２０ｍ的ＫＬ中浸泡０ｍｎ中洗５ＭＣ１ｉ。小心切下目的条带所在凝胶，切碎后加入少量０ｍｎＰＳ（Ｈ７０Ｂｐ．）缓冲液，４Ｃ浸泡过夜。４２００ｇ￣ ℃１０离心１ｉ，收集上清，用氯仿：甲醇＝１２的溶液析出蛋５ｍｎ：白，４ｃ２００ｇｃ１０离心１ｉ，沉淀用适当ｐ．Ｂ５ｍｎＨ７０ＰＳ溶
ｐｏｅｎｗｓａｏｔ０Ｋａｄｗｓｅｐｅｓｄｉｈｏｎｉｃｕｉｎｂｄ．ｈｅｕｔｓｅｎ—ｂｏｔｇｒｖａｅｈｈｒｔｉａｂｕＤａｘｒｓｅｎｔｅｆｒｏａｎｌｓｏｙＴｅｒｓｌｏｗｅｔｒ５ｎｍｆｏｆｌｔｎｅｅｄｔａｔｅｉｌｔｒｃｍｂｎｔｎｐｏｅｎｒａｔｄｗｅｌｗｔｎｉｅｏｉａｉｒｔｉｅｃｅｌｉａｔ —ＭＥＶｓｒｍ．ｌｒｓｌｎｉａｅｈｔｔｅｒｃｍｂｎｔｎｐｏｅｎｃｎｂａｕｂｅｏｈｅｕＡｌｅｕｔｉｄｃｔｄｔａｈｅｏｉａｉｒｔｉａｅｖｌａｌｓｏｉｒｖｄｎｓｆｌｎｉｅｒｒｐｒｔｎｏｎｉ — ｎｐｏｉｉｇａｕｅｕｔｎｆｅａａｉｆｔ — ＭＥＶｍｏｏｌｎｎｉｏｙａｄｒｌｔｄｉａｇｏｐｏａｎｃｏａａｔｄｎｅａｅｌｂｍｍｕｏｏｉａｅｅｔｎｍｅｈｄｄ・ｎｌｇｃｄｔｃｉｔｏｅ・ｌｏ