高考生物专题复习——PCR技术.ppt
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第二章-PCR技术ppt课件
模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
（2）引物浓度
0.1-0.5 mol/L
浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性 下降。
（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反 应产量。
（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度
低浓度引物
高浓度引物
2. 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片 段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析 ,如探索邻接已知 DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长 cDNA的 克隆,扩增基因的插入DNA；建立基因组步移文 库。
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
• 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了 聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用 E-coli DNA 聚合酶进行 PCR ，由于该酶 不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
第1轮结束 第2轮开始
• PCR反应条件 72℃ 95℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq • PCR过程 • PCR的特点
Taq
TaqLeabharlann PCR的基本原理第2轮结束
• PCR反应条件 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
高中生物精品资源高三一轮复习生物：PCR技术及其应用课件
选择的引物组合是 Ⅱ和Ⅲ 。
4 PCR技术的应用
4.在已有基因上增加片段
用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ， 其连接部位如左下图所示，x为不能与模板链引物结合部位互补配对的
序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段应是右下图中的 d 。
4 PCR技术的应用
5.应用PCR技术进行基因敲除或增加基因
由图可知突变基因新增的酶切
位点位于 310 bp的DNA片段中。
4 PCR技术的应用
1.以DNA扩增为基础的应用
（2）协助诊断
肾上腺-脑白质营养不良是一种伴X染色体的 隐性遗传病（用d表示），图为某患者家系图。
（3）已知女性细胞所含两条X染色体 中的一条总是保持固缩状态而失活， 推测失活染色体上的基因无法表达的 原因是 固缩状态无法正常解旋转录 。
4 PCR技术的应用
2.PCR是Sanger测序法的重要环节
第四步：DNA扩增时，一旦ddNTP与模 板链结合，子链延伸就停止了。将产 物进行电泳，由远及近即可读序。
4 PCR技术的应用
3.应用特定引物，进行基因定位 科学家把一段T-DNA插入到A基因中，从而诱发突变，
获得a基因，用PCR法确定T-DNA插入位置时，应从图中
分别提取四名女性的mRNA作为 模板， 逆转录 后进行PCR，计算产 物量的比例，结果如表1。
4 PCR技术的应用
1.以DNA扩增为基础的应用
（2）协助诊断 综合图表，推断II-3、II-4发病的原因是来自 父方（父方/母方）的X染色体
失活概率较高，以 Xd 基因表达为主。
4 PCR技术的应用
2.PCR是Sanger测序法的重要环节
2 PCR反应三步走
4 PCR技术的应用
4.在已有基因上增加片段
用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增，设计了引物Ⅰ、Ⅱ， 其连接部位如左下图所示，x为不能与模板链引物结合部位互补配对的
序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段应是右下图中的 d 。
4 PCR技术的应用
5.应用PCR技术进行基因敲除或增加基因
由图可知突变基因新增的酶切
位点位于 310 bp的DNA片段中。
4 PCR技术的应用
1.以DNA扩增为基础的应用
（2）协助诊断
肾上腺-脑白质营养不良是一种伴X染色体的 隐性遗传病（用d表示），图为某患者家系图。
（3）已知女性细胞所含两条X染色体 中的一条总是保持固缩状态而失活， 推测失活染色体上的基因无法表达的 原因是 固缩状态无法正常解旋转录 。
4 PCR技术的应用
2.PCR是Sanger测序法的重要环节
第四步：DNA扩增时，一旦ddNTP与模 板链结合，子链延伸就停止了。将产 物进行电泳，由远及近即可读序。
4 PCR技术的应用
3.应用特定引物，进行基因定位 科学家把一段T-DNA插入到A基因中，从而诱发突变，
获得a基因，用PCR法确定T-DNA插入位置时，应从图中
分别提取四名女性的mRNA作为 模板， 逆转录 后进行PCR，计算产 物量的比例，结果如表1。
4 PCR技术的应用
1.以DNA扩增为基础的应用
（2）协助诊断 综合图表，推断II-3、II-4发病的原因是来自 父方（父方/母方）的X染色体
失活概率较高，以 Xd 基因表达为主。
4 PCR技术的应用
2.PCR是Sanger测序法的重要环节
2 PCR反应三步走
pcr培训ppt课件
实验操作人员应接受专业培训，熟悉安全操作规程，避免在实验过程 中受伤或感染。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
07
总结与展望
Pcr技术的总结
PCR技术的原理
PCR是一种在生物实验室中广泛应用的分子生物学技术，其基本原理是通过特定的DNA 聚合酶，在DNA双链之间进行热循环，从而实现DNA的快速扩增。
PCR技术的应用领域
PCR技术在许多领域都有广泛的应用，包括遗传学、医学、生物技术和农业等。通过PCR 技术，科学家们可以快速、准确地检测和鉴定DNA序列，这对于遗传疾病的诊断、生物 多样性的研究和基因工程等领域具有重要意义。
安全问题
生物安全
PCR实验涉及的生物材料可能具有传染性，因此需要采取适当的生物 安全措施，如穿戴个人防护装备、实验室内消毒等。
废物处理
实验产生的废物应按照相关规定进行妥善处理，避免对环境和人类健 康造成危害。
防止污染
PCR实验过程中应采取措施防止污染，如设置阴性对照、定期检测实 验室环境等。
人员安全
PCR技术的优缺点
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和操作简便等优点，但也存在一些局限性，如对模板 DNA的纯度要求高、易受污染等。因此，在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的 PCR方法。
Pcr技术的发展趋势
要点一
提高灵敏度和特异性
随着基因组学和分子生物学研究的深 入，对PCR技术的灵敏度和特异性提 出了更高的要求。因此，未来的PCR 技术需要进一步提高其灵敏度和特异 性，以满足更广泛的研究和应用需求 。
05
Pcr技术的拓展应用
基因克隆与表达
基因克隆
通过PCR技术，科学家可以快速、准 确地获取特定基因片段，为基因克隆 提供基础。
基因表达
利用PCR技术，可以检测基因在不同 条件下的表达水平，有助于理解基因 功能和调控机制。
PCR详细讲解PPT课件
2021/3/7
CHENLI
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
引物与非特异序列的同源性不超过70% 或有连续8个互补碱基。
NCBI Primer BLAST
29
引物设计的基本原则
3、引物长度一般为18-30个碱基之间。
引物长度与反应的特异性和解链温度成
正相关。
过短：扩增特异性下降 过长：引物自身形成二级结构，以及引物二 聚体。
2021/3/7
CHENLI
30
引物设计的基本原则
4、G+C含量一般为40%-60%
引物的碱基组成也会对引物的解链温度 产生影响。
2021/3/7
CHENLI
68
退火温度与时间取决于引物的 碱基组成、长度和浓度。退火温度 可以通过计算推断，通常采用温度 梯度PCR的方法进行摸索。
PC1-P20 退火温度摸索
45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M
CHENLI
8
低温退火
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CHENLI
9
中温延伸
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CHENLI
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CHENLI
11
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CHENLI
12
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CHENLI
13
• 理论：2n递增（n为循环次数）， 如果扩增30循环，目标DNA可增加 230也就是109倍。
pcr技术PPT课件
课题2
多聚酶链式反应（PCR)扩增 DNA片段
温故知新1
• 组成DNA分子的基本单位是什么? • 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? • DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
弹体
三种炸药：
普通炸药
小 型
普通炸药
爆炸
铀235 外壳
原
子 Ｕ235 裂变
弹
氘、氚、重 氢化钾等
氘、氚 聚变
引爆装置
2 1
H
3 1
H
4 2
He
01 n
氢弹爆炸形成的磨姑云
三、受控热核反应——核聚变的利用
可控热核反应将为人类提供巨大的能源,和平利用聚变产生的 核量是非常吸引人的重大课题，我国的可控核聚变装置“中国 环流器1号”已取得不少研究成果.
2、铀核的裂变
（1）发现
1939年12月，德国物理学家哈恩和他的助手 斯特拉斯曼发现，用中子轰击铀核时，铀核发 生了裂变。
（2）裂变产物 多种多样
235 92
U+
1 0
n
→15464
Ba
+
89 36
Kr
+310
n
235 92
U+
1 0
n
→15461Ba
+
92 36
Kr
+310
n
请计算铀裂变时释放的能量 已知铀核裂变的反应：
热核反应和裂变反应相比较，具有许多优越性。
多聚酶链式反应（PCR)扩增 DNA片段
温故知新1
• 组成DNA分子的基本单位是什么? • 这些基本单位是如何连接成DNA分子的? • DNA分子结构有什么特点？
脱 氧 磷酸
脱氧
核 苷
核糖 脱氧核苷
腺嘌呤（A） 嘌呤
酸
含氮
鸟嘌呤（G）
碱基 嘧啶 胞嘧啶（C）
胸腺嘧啶（T）
5 4
3
1 2
OH HO P O
弹体
三种炸药：
普通炸药
小 型
普通炸药
爆炸
铀235 外壳
原
子 Ｕ235 裂变
弹
氘、氚、重 氢化钾等
氘、氚 聚变
引爆装置
2 1
H
3 1
H
4 2
He
01 n
氢弹爆炸形成的磨姑云
三、受控热核反应——核聚变的利用
可控热核反应将为人类提供巨大的能源,和平利用聚变产生的 核量是非常吸引人的重大课题，我国的可控核聚变装置“中国 环流器1号”已取得不少研究成果.
2、铀核的裂变
（1）发现
1939年12月，德国物理学家哈恩和他的助手 斯特拉斯曼发现，用中子轰击铀核时，铀核发 生了裂变。
（2）裂变产物 多种多样
235 92
U+
1 0
n
→15464
Ba
+
89 36
Kr
+310
n
235 92
U+
1 0
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→15461Ba
+
92 36
Kr
+310
n
请计算铀裂变时释放的能量 已知铀核裂变的反应：
热核反应和裂变反应相比较，具有许多优越性。
高考生物总复习 第34讲 基因工程(包括pcr技术)课件
图1
图2 (1)图中EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是 GAATTC ,切割位点在
G和A 之间;SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是 CCCGGG ,切割 位点在 G和C 之间。 (2)以上实例说明限制酶具有 专一 性。
1.限制酶和DNA连接酶的关系
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。 (2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序 列或识别序列已经被修饰。 (3)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶,以获得相同的 黏性末端,但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制
酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶
(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的黏性 末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破
4.如图所示为pBR322质粒,其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环 素抗性基因)为标记基因,ori为复制原点,其他均为限制酶及其识别位点, 并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的运载 体。回答下列相关问题:
(1)制备重组质粒,需要限制酶和 DNA连接 酶。如制备重组质粒时, 使用PvuⅠ切割该质粒,则检测目的基因是否导入受体细胞,需要在培养 基中添加 四环素 。
体考查
理与技术
(5)DNA的粗提取与鉴 (3)以鸡血为实验材料进行探究实验,掌握
定
DNA粗提取和鉴定的方法。
考点一 基因工程的操作工具
总 考点二 基因工程的基本操作
图2 (1)图中EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是 GAATTC ,切割位点在
G和A 之间;SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是 CCCGGG ,切割 位点在 G和C 之间。 (2)以上实例说明限制酶具有 专一 性。
1.限制酶和DNA连接酶的关系
(1)限制酶和DNA连接酶的作用部位都是磷酸二酯键。 (2)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序 列或识别序列已经被修饰。 (3)在获取目的基因和切割载体时通常用同一种限制酶,以获得相同的 黏性末端,但如果用两种不同限制酶切割后形成的黏性末端相同,在
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制
酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶
(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。 ①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的黏性 末端。 ②质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破
4.如图所示为pBR322质粒,其中ampr(氨苄青霉素抗性基因)和tetr(四环 素抗性基因)为标记基因,ori为复制原点,其他均为限制酶及其识别位点, 并且每种限制酶都只有一个。pBR322质粒是基因工程较常用的运载 体。回答下列相关问题:
(1)制备重组质粒,需要限制酶和 DNA连接 酶。如制备重组质粒时, 使用PvuⅠ切割该质粒,则检测目的基因是否导入受体细胞,需要在培养 基中添加 四环素 。
体考查
理与技术
(5)DNA的粗提取与鉴 (3)以鸡血为实验材料进行探究实验,掌握
定
DNA粗提取和鉴定的方法。
考点一 基因工程的操作工具
总 考点二 基因工程的基本操作
PCR详细讲解 ppt课件
2
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
3
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
1、避免重复碱基，尤其是G。
2、引物退火温度在58-60℃之间。
3、G+C为30-80%。
4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个
的G或C。
5、引物的产物大小一般在80-250bp之
间；80-150 bp最为合适（可以延长至
300 bp）。 2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
38
Real-Time PCR引物设计原则
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
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引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存 在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即 使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降 低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所 以3’端最好选择T。
引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
2021/3/26
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26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
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引物设计的基本原则
PCR技术详解课件PPT
2021/3/10
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④避免引物内部出现二级结构：避免两条引物间互补，特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增 条带；
⑤引物3’端的碱基应严格要求配对：特别是最末及倒数第二 个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败；
⑥ 引物的熔解温度（Tm值），指把DNA的双螺旋结构热变性 过程中紫外吸收值达到最大值的1/2时的温度。DNA中G－ C含量越高，Tm值越高，引物对之间的Tm值相差不超过 2~3℃，经验公式Tm=2℃(A+T)+4℃(G+C)，引物的退火 温度通常低于Tm值5~10℃；
单、双链DNA均可
不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白类
对于哺乳动物基因组DNA开说，每个反应需要的模 板量是1μg，对于酵母染色体、细菌染色体和质粒 等模板的通常用量分别是10ng、1ng、1pg
2021/3/10
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4. dNTP
dNTP在温度较高时容易失活, 因此需要-20℃下冰 冻保存,以保证dNTP的质量。
链
DNA单链
与引物复性
22 DNA双螺旋
子链延伸 DNA加倍
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
/v_show/id_XNjc4Mzk2Njg0.html?qq-pf-to=pcqq.c2c#paction
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五、PCR的类型
在PCR反应中, dNTP浓度应为200 ～ 250μmol/L, 尤其重要的是4种dNTP的体积浓度要相等, 否则就 会引起错配