流式抗体及荧光染料的选择

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可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件
下又可解离为游离抗原与抗体的特性
影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力－亲合力越高，结合
越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响－pH、离子强度
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比例性：抗原与抗体发生
可见反应需遵循一定的量比 关系
前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)：
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流式抗体的选择、荧光染料应用
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IVD
Ⅱ类体外诊断试剂
ASR
分析物特异性试剂
RUO
仅用于研究
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❖ 单克隆抗体 ❖ 混合单克隆抗体 ❖ 多克隆抗体
•荧光直标的抗体 •未标记的抗体（需要荧光标记的二抗进 行间接标记检测）
•单分子荧光素 •复合分子荧光素
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信噪比（S/N）：特异性荧光信号（signal）与非特异性荧 光信号的比值
流式抗体及荧光染料的选择
陈晓东 产品技术专员
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抗原抗体反应
2 流式抗体的选择、荧光染料应用
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抗原抗体反应
❖ 抗原抗体反应的原理 ❖ 抗原抗体反应的特点 ❖ 影响抗原抗体反应的因素
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抗原抗体反应:指抗原与相应抗体之间所发生的特异 性结合反应。
❖ 抗原与抗体的特异性结合既会在体内发生，亦可以在体外进行， 体外进行的抗原抗体反应习惯上称作血清学反应
物得特异性 ❖ 稳定性好，不易受光、温度、标本抗凝剂和固定剂的影响
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❖根据仪器选用荧光素：1.每个通道只能选择1种荧光素 2.各个通道之间的荧光素可以随意搭配
❖搭配的荧光素之间发射光谱重叠尽量小
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注意：
1.不要为了节省荧光抗体，未经过预实验就按抗体说 明书减半量甚至更多进行标记。
S/N越大，表 明阳性与对 照细胞的荧 光峰分离越 好，当S/N大 于3时属于可 接受范围
PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC>PerCP 14
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综合因素：
❖荧光标记效率：抗体上标记荧光素的数量（E/P比值）也会影 响相对荧光强度。
❖抗体检测的抗原密度：高密度的抗原几乎可以用任何荧光素 标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧 光素（如PE和APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细 胞群和何阴性细胞群的目的。
❖细胞自发荧光：检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光 波长较长的荧光染料（如APC）可以得到较好的S/N比值。
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理想荧光素
❖ 具有高的光子产量，信号强度高 ❖ 对激发光有较强的吸收，降低背景信号 ❖ 激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰 ❖ 易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记
2.不能完全凭感觉进行标记，需进行细胞计数。
3.应用FITC标记抗体时，避免使用酸性缓冲溶液，因 为FITC的荧光特性是pH依赖的。
4.荧光抗体、荧光染色的样本应避免暴露于强光下。
5.建议尽快上机检测（最好24h内）。
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陈晓东 产品技术专员
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抗原表位与抗体高变区间的互补结合
物 质 抗原表位与抗体高变区的沟槽分子表面的结合
基
抗原抗体之间的结合力
础
亲水胶体转化为疏水胶体
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❖ 抗原抗体反应的特点
特异性
可逆性
比例性
阶段性
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特异性：抗原与抗体结
合反应的专一性
分子基础:抗原表位与抗体分子 高变区之间空间构型的互补性
抗原抗体反应特异性示意图
抗原抗体比例合适
抗原抗体反应比例性示意图
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阶段性
第一阶段：特异性结合阶段，反应快，不可见
第二阶段：反应可见阶段，反应慢，出现凝集、 沉淀和细 胞溶解等现象
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❖ 影响抗原抗体反应的因素
一、反应物自身因素
抗原:理化性状、表位种类和数目 抗体:来源、特异性、亲和性、效价
二、环境因素
电解质: 生理盐水或缓冲液 酸碱度: pH6～pH9（pH7.2源自文库pH7.4） 温 度: 15℃～40℃（4℃ ），37℃最适