竹子叶绿体基因组SSR分子标记的开发及其应用
SSR分子标记
SSR分子标记的步骤 分子标记的步骤
第一步：DNA 提取：
提取DNA并用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
第二步：PCR :
PCR体系： 模板DNA 引物 氯化镁 4种dNTP混合物 PCR缓冲液 TaqDNA 聚合酶
PCR反应程序 ： 变性94 ℃ → 复性（或退火）5062℃ → 延伸72 ℃，一般30-35个循环
SSR分子标记引物设计 SSR分子标记引物设计 分子标记
一
从有关数据库（GenBank, EMBL DDBJ等）或文章中 查询
引物 设计
二
使用#39;锚定 锚定PCR 分离 分离SSR标记 锚定 标记
SSR标记原理示意图 标记原理示意图
SSR分子标记的优势 SSR分子标记的优势
SSR在真核生物基因组中分布广 SSR在真核生物基因组中分布广 多态性丰富 其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨 率高、 率高、遗传信息量大 SSR通常为共显性标记， SSR通常为共显性标记，呈孟德尔式遗传 通常为共显性标记 具有很好的稳定性和多态性 DNA用量少 DNA用量少 PCR扩增的可重复性高 PCR扩增的可重复性高
SSR分子标记 SSR分子标记
胡玉龙 M110107260
SSR分子标记
1
Байду номын сангаас
SSR标记的简介及原理
2 SSR标记的步骤及分析 3 SSR标记引物设计
SSR标记的简介
SSR （simple sequence repeat）
简单重复序列（Simple Sequence Repeat ， SSR），指的是基因组中由1-6个核苷酸组成 的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分 布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以 下。
ssr分子标记技术存在问题
ssr分子标记技术存在问题SSR（Single-Strand Conformation Polymorphism Analysis）分子标记技术是一种常用的分子生物学工具，用于检测DNA或RNA的序列变异。
然而，虽然SSR分子标记技术在许多领域都有着广泛的应用，但它也存在一些问题需要解决。
本文将探讨SSR分子标记技术存在的问题，并提出一些解决方案。
第一部分：介绍SSR分子标记技术首先，让我们简单介绍一下SSR分子标记技术。
SSR是指简单重复序列（Simple Sequence Repeats），也被称为微卫星序列，它是DNA 或RNA分子中短序列的重复单元。
SSR分子标记技术可以通过PCR扩增和凝胶电泳等方法来分析样品中这些重复序列的长度变异，从而研究基因型和表型之间的关系。
第二部分：SSR分子标记技术存在的问题然而，尽管SSR分子标记技术在基因型鉴定、种群遗传结构分析和品种选育等方面表现出了良好的应用前景，但它也存在以下几个问题：1. 数据分析复杂：SSR分子标记技术获得的数据通常需要进行复杂的分析，包括基因频率、遗传多样性等统计学参数的计算。
这对于非专业人士来说可能是一个挑战。
2. 缺乏标准化操作流程：不同实验室或研究机构之间使用的SSR分子标记技术操作流程可能存在差异，导致结果的可比性不高。
3. 多态性程度低：由于SSR分子标记技术只能分析简单重复序列，因此它对于复杂基因组的分析有一定局限性。
在某些物种中，SSR位点的多态性程度较低，导致分辨率不高。
第三部分：解决方案尽管SSR分子标记技术存在问题，但我们可以通过以下途径来解决这些问题：1. 开发简化的数据分析工具：研究人员可以开发易于使用且功能强大的数据分析工具，以简化SSR分子标记技术数据的处理过程，并提供可视化和统计学参数计算等功能。
2. 建立标准化的操作流程：国际间的合作可以制定和推广SSR分子标记技术的标准化操作流程，确保不同实验室或研究机构之间获得的结果具有可比性。
常用分子标记技术原理及应用
单链制备
通过加热或化学方法 将双链DNA变性为 单链。
凝胶电泳
将单链DNA在聚丙 烯酰胺凝胶上进行电 泳，并观察迁移率变 化。
结果分析
通过比较正常和突变 DNA的迁移率，确 定是否存在基因突变。
应用实例
遗传病诊断
SSCP技术可用于检测与遗传病相关的 基因突变，如囊性纤维化、镰状细胞 贫血等。
肿瘤研究
特点
高分辨率、高灵敏度、可重复性和可 靠性，能够检测出微小的基因组差异 ，广泛应用于遗传育种、生物多样性 保护、人类医学等领域。
分子标记技术的应用领域
遗传育种
通过分子标记技术对动植物进行遗传资源鉴定、品种纯度 鉴定、遗传连锁分析和基因定位等，提高育种效率和品质。
生物多样性保护
利用分子标记技术对物种进行遗传结构和亲缘关系分析， 评估物种的遗传多样性和濒危程度，为保护生物多样性提 供科学依据。
人类医学
分子标记技术在人类医学中用于疾病诊断、药物研发、个 体化医疗等方面，有助于提高疾病的预防、诊断和治疗水 平。
常用分子标记技术简介
RFLP（限制性片段长度多态性）
SSR（简单序列重复）
利用限制性内切酶对DNA进行切割，产生 不同长度的片段，通过电泳和染色检测多 态性。
利用串联重复的DNA序列多态性进行标记 ，通过PCR扩增和电泳检测多态性。
分子标记辅助育种
利用AFLP技术标记控制重要性状 的基因，辅助育种者快速筛选具 有优良性状的个体。
植物分子生态学研
究
利用AFLP技术分析植物种群遗传 结构、物种演化和生态适应性等 方面的研究。
04
SSR技术
原理
简单序列重复标记（SSR）是一种基于PCR的分子标记技 术，利用微卫星序列的重复单元进行扩增，通过检测等位 基因的长度多态性来识别基因组中的变异。
ssr分子标记技术存在的问题
ssr分子标记技术存在的问题SSR分子标记技术是一种广泛应用于植物遗传研究中的分子标记技术。
它具有高度多态性、遗传稳定性和易于扩增等优点，因此被广泛应用于植物遗传多样性和基因定位等领域。
然而，SSR分子标记技术在应用过程中也存在一些问题，主要包括以下几个方面。
一、样品处理问题SSR分子标记技术需要从植物组织中提取DNA，因此样品处理是影响技术稳定性和可重复性的重要因素。
样品处理不当会导致DNA质量下降，从而影响PCR扩增效果和分析结果。
因此，在样品处理过程中需要注意细节，如避免样品受到污染、避免DNA降解等。
二、PCR扩增问题SSR分子标记技术需要通过PCR扩增来扩增目标序列，因此PCR扩增是影响技术稳定性和可重复性的另一个重要因素。
PCR扩增过程中需要考虑多种因素，如反应体系、扩增条件、引物设计等。
如果PCR扩增条件不合适，会导致扩增效率低下、扩增产物不清晰等问题，从而影响分析结果。
三、数据分析问题SSR分子标记技术需要通过数据分析来解读分析结果，因此数据分析是影响技术稳定性和可重复性的另一个重要因素。
数据分析需要考虑多种因素，如数据质量、数据处理方法、数据统计方法等。
如果数据分析不当，会导致分析结果不准确、分析效率低下等问题，从而影响研究结论的可靠性。
四、标记选择问题SSR分子标记技术需要选择合适的标记来进行研究，因此标记选择是影响技术稳定性和可重复性的另一个重要因素。
标记选择需要考虑多种因素，如标记多态性、标记分布、标记稳定性等。
如果标记选择不当，会导致研究结果不准确、研究效率低下等问题，从而影响研究结论的可靠性。
综上所述，SSR分子标记技术在应用过程中存在一些问题，需要在样品处理、PCR扩增、数据分析和标记选择等方面加以注意。
只有在技术操作规范、数据分析准确、标记选择合理的情况下，才能保证SSR 分子标记技术的稳定性和可重复性，从而为植物遗传研究提供可靠的分子标记技术支持。
分子标记技术及其在作物育种中的应用
分子标记技术及其在作物育种中的应用王斌【摘要】简述了几种常用分子标记的原理和特点,以及它们在构建遗传图谱、遗传多样性分析、基因定位等方面的应用,同时介绍了近等基因系及数量性状位点在作物育种中的应用。
【期刊名称】《农业科技通讯》【年(卷),期】2012(000)006【总页数】4页(P126-129)【关键词】分子标记;RFLP;RAPD;AFLP;SSR;近等基因系;数量性状位点【作者】王斌【作者单位】甘肃省农业科学院,兰州730070【正文语种】中文【中图分类】S33伴随着遗传学的发展，遗传标记(geneticmarker)经历了形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记4个阶段，其中DNA分子标记诞生于20世纪80年代中期[1]，与其他遗传标记相比，它具有如下优点：（1）直接以DNA的形式表现，在生物各个组织，各个发育时期都可以检测到，不受季节、环境的限制；（2）数量多，遍及整个基因组；（3）多态性高，并且自然存在许多的等位变异，不需专门创造特殊的变异材料；（4）与不良性状无必然连锁，不影响目标性状的表达；（5）表现为共显性，能区分杂合型、纯合型基因型，能提供完整的遗传信息；（6）能在早代进行选择，加速育种进程[2－3]。
分子标记的这些优点，在作物遗传育种的研究与应用中得到了广泛的体现，相对于传统的遗传育种研究中的形态性状评价具有无可比拟的优越性。
1.1 RFLP标记RFLP（Restriction fragment length polymorphisms）即限制性片段长度多态性，是指用限制性内切酶酶切不同个体的基因组DNA后，含有与探针序列同源的酶切片段在长度上的差异。
RFLP标记对DNA需要量较大（5～10μg），所需仪器设备较多，检测步骤多，技术较复杂，周期长，成本高，使其应用受到了一定程度的限制。
RFLP标记被广泛用于植物遗传连锁图谱的构建、遗传关系分析、数量遗传研究、与重要农艺性状紧密连锁的分子标记筛选等方面。
利用分子标记辅助育种
利用分子标记辅助育种一、分子标记辅助育种概述分子标记辅助育种是现代生物技术与传统育种方法相结合的一种高效育种技术。
它利用分子标记与目标基因紧密连锁的特性，在作物育种过程中对目标基因进行追踪和选择，从而显著提高育种效率和准确性。
随着分子生物学技术的不断发展，分子标记辅助育种已成为作物遗传改良的重要手段，在农业生产中发挥着越来越重要的作用。
二、分子标记辅助育种的关键技术1. 分子标记类型- SSR标记（简单重复序列标记）：SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好等优点。
其核心是由1 - 6个核苷酸组成的简单重复序列，广泛分布于基因组中。
通过设计特异性引物对SSR区域进行扩增，根据扩增产物的长度多态性来检测个体间的差异。
例如，在水稻育种中，利用SSR 标记可以有效区分不同品种的水稻，为品种鉴定和纯度检测提供了可靠的方法。
- SNP标记（单核苷酸多态性标记）：SNP标记是基因组中单个核苷酸的变异，是最常见的遗传变异类型。
它具有数量多、分布广泛、检测通量高的特点。
SNP标记的检测方法包括基于PCR的方法、芯片技术和新一代测序技术等。
在玉米育种中，SNP标记已被广泛应用于全基因组关联分析（GWAS），用于挖掘与重要农艺性状相关的基因位点，为分子标记辅助选择提供了丰富的标记资源。
- AFLP标记（扩增片段长度多态性标记）：AFLP标记结合了RFLP（限制性片段长度多态性）和PCR技术的优点，具有较高的多态性检测效率。
其原理是通过对基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后连接特定的接头，再进行选择性扩增。
扩增产物通过电泳分离，根据片段长度多态性来分析遗传差异。
在小麦育种中，AFLP标记可用于构建遗传连锁图谱，定位控制小麦抗病性、品质等性状的基因。
2. 目标基因定位与克隆- 连锁分析：连锁分析是通过研究标记与目标基因在染色体上的连锁关系来定位目标基因的方法。
当标记与目标基因紧密连锁时，它们在遗传过程中倾向于一起传递。
SSR分子标记在作物种质资源鉴定中的应用
SSR分子标记在作物种质资源鉴定中的应用山东农业科学2012，44（10）：11 18Shandong Agricultural Sciences收稿日期：2012－04－27基金项目：国家自然科学基金项目（30971546）；山东省科技发展计划项目（2012GNC1101）作者简介：王燕龙（1988－），女，在读硕士研究生，研究方向：分子遗传学。
E －mail ：wangyanlong0000@/doc/ac92eece8bd63186b cebbc66.html *通讯作者：单雷，博士，研究员，研究方向：植物分子生物学。
E －mail ：shlei1025@/doc/ac92eece8bd63186bcebbc66. htmlSSR 分子标记在作物种质资源鉴定中的应用王燕龙1，2，姜言生3，曲志才1，单雷2*（1.曲阜师范大学生命科学学院，山东曲阜273165；2.山东省农业科学院高新技术研究中心/山东省作物与畜禽遗传改良重点实验室，山东济南250100；3.潍坊市农业科学院，山东潍坊261031）摘要：介绍了SSR 分子标记的特点及其在作物种质资源鉴定中的应用，主要包括亲缘关系鉴定、品种鉴定、真实性鉴定及纯度鉴定；提出了改进方法，并对其应用前景作了展望。
关键词：SSR 标记；作物；指纹图谱；种质鉴定中图分类号：Q599；S338文献标识号：A文章编号：1001－4942（2012）10－0011－08Application of SSR Markers in Crop Germplasm Identification Wang YanLong 1，2，Jiang YanSheng 3，Qu ZhiCai 1，Shan Lei 2*（1．College of Life Science ，Qufu Normal University ，Qufu 273165，China ；2．Hi －Tech Research Center ，Shandong Academy of Agricultural Sciences /Key Laboratory for Genetic Improvement of Crop ，Animal and Poultry of Shandong Province ，Jinan 250100，China ；3．Weifang Academy of Agricultural Sciences ，Weifang 261031，China ）Abstract The characterizations of SSR markers were introduced and its application in crop germplasm i-dentification was also reviewed ，which included the relation evaluation of different germplasms ，variety identi-fication ，authenticity and purity identification of varieties．In addition ，the improving methods for SSR were put forward and its application prospect was discussed in this paper．Key wordsSSR analysis ；Crop ；Fingerprinting map ；Germplasm identification种质资源鉴定是作物育种的重要基础，国内外已从形态学、细胞学以及生理生化等方面进行了大量的研究。
分子标记SSR标记
微星标记的方法，包括:
• •
• •
（1）运用RAM P和RA PD技术分离单位点微卫星标记 RAM P 利用5’含有四个锚定碱基的微卫星引物结合不同的RA PD引物在基因组DNA 中扩增，获得片段包括两头带反向微卫星序列的扩增片段(为USSR产物)、随机扩增的 片段(RA P产物)、随机引物与微卫星基因座间的片段(SSR产物).用标记的5‘锚定引物扩 增或经Southern 后在用标记的微卫星探针与之杂交后，再经过自显影，可以得到只含 微卫星标记的指纹图谱.在RAM P和RAPD技术的基础上，人们运用RAM P技术和RA PD技术扩增基因组DNA，得到扩增产物，然后用标记的微卫星的探针与PCR产物 Southern杂交或用标记微卫星锚定引物，在PCR扩增后胶上直接观测，选择阳性条带 克隆}22 i、或者首先克隆所有的PCR产物，制成微列阵，然后筛选克隆。 ( 2)利用1SSR技术分离单基因座微卫星序列 1SSR是1994报道的一种方法.这种方法是用3’或5’端带有1一4个锚定碱基的微卫星引 物，来扩增基因组获得在两端带有相反排列的微卫星序列的DNA片段，经电泳后，显 示复杂的指纹图谱.用1SSR引物在基因组DNA中扩增，获得1SSR DNA片段，然后克 隆，经测序后，根据微卫星序列间的DNA序列设计两个巢式引物.然后运用巢式引物序列，再设计微卫星位点另一端的引物。
SAM PL技术分离SSR标记
SAMP是Witsenboer等1997创立的一种分离微卫星标记的技术.它 同AFLP一样具有择性碱基的AFLP引物接头的连接和预扩增的过程. 但是在第二步选择性扩增时，运用的是一个末端带有3个选物和5'锚定 微卫星引物的组合进行PCR扩增，通过电泳获得多位点的微卫星图， 通过不同的A FLP引物和5'锚定引物的组合，可以揭示基因组DNA的 所有微卫星位点的多态性. • 然而用这种方法获得的大多是显性标记，共显性标记占少数，因 此有必要把具有重要信息的位点转化为带有有用信息的微卫星标记， 基于这种想法H ayden Sharp( 2001)发表了一种改良SAM PL程序， 获得SAM PL图谱，在分了标记连锁图上定位SAIVI(se-ectively anplified m icn>satellite)位点选择有兴趣的SAP位点，然后有选择的 克隆、测序，根据这个微卫星序列一侧设计一个特异性引物，用与F fisher( 1996)相同的方法来获得单位点的共显性的微卫星标记.
SSR分子标记技术在生物遗传学领域的应用
SSR分子标记技术在生物遗传学领域的应用杨文柱;焦燕【摘要】SSR(simple sequence repeats)分子标记技术作为一种新世纪遗传学研究工具,已被广泛应用于生物遗传多样性、遗传图谱构建、基因定位、分子标记辅助育种、种质真伪和纯度鉴定等研究中,成为生物资源利用、开发和保护常用的方法和技术.%As a genetic research tool in the new century, SSR molecular markers technique has been widely adopted in the research on diversity of biogenetics, construction of the genetic linkage map, location of genes, molecular mark-assisted selection and purity controlling of cultivars, it has been commonly used for the utilization, development and protection of biological resources.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)002【总页数】3页(P640-642)【关键词】SSR;分子标记;生物遗传学;应用【作者】杨文柱;焦燕【作者单位】内蒙古农业大学农学院,内蒙古呼和浩特010019;内蒙古师范大学化学与环境科学学院,内蒙古呼和浩特010022【正文语种】中文【中图分类】Q756简单重复序列(simple sequence repeats，SSRs)又称短串联重复序列(short tandem repeats，STRs)或微卫星DNA(Microsatellite DNA)，主要由串联重复单元组成，每个单元长度一般在1～6 bp之间。
SSR分子标记的研究进展
４３０
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
杭 州 师 范 大 学 学 报 （自 然 科 学 版 ）
２０１９ 年
１ ＳＳＲ 分子标记的开发
１．１ 传统 犛犛犚 标记的开发方法 Ｓ化 学 发 光 物 质 标
记的与 ＳＳＲ 互补的微卫星序列探针与中各个克隆的 ＤＮＡ 杂交，筛选基因组文库，对阳性克隆进行测 序，然后根据测序结果设计ＳＳＲ 引物［５］．这种方法简单、易掌握，是最经典的获取ＳＳＲ 标记的方法．目前已 获得的 ＳＳＲ 标记中，有３／４以上都是通过此方法得到的．Ｋｒｅｓｏｖｉｃｈ等 筛 单 重 复 序 列，并 且 以 每 １００ｋｂ ＤＮＡ 大 约 一 个 ＳＳＲ 的 频 率 出 现． ＳｚｅｗｃＭｃＦａｄｄｅｎ 等 ［７］对 甘 蓝 型 油 菜 基 因 组 文 库 的 大 约 １４０ 个 克 隆 进 行 测 序 ，设 计 的 ２１ 对 引 物 中 有 １７ 对 引物能在芸薹（ＡＡ）、甘蓝（ＣＣ）及 甘 蓝 型 油 菜 （ＡＡＣＣ）材 料 中 扩 增 出 产 物，其 中 １３ 对 引 物 具 多 态 性．但 １９９８年，ＴｏｋｕｋｏＵｊｉｎｏ等 在 ［８］ 研究东南亚 热 带 雨 林 树 种 龙 脑 香 科 植 物 Ｓｈｏｒｅａｃｕｒｔｉｓｉｉ的 时 候获得了４个阳性克隆，最后只 得到 一个 ＳＳＲ 引物．由 此 可 见，传 统 开 发 ＳＳＲ 标 记 方 法 虽 然 简 单 易 行，但 针 对 不 同 的 微 卫 星 序 列 需 要 多 次 筛 选 文 库 ，耗 时 又 费 力 ，而 且 阳 性 克 隆 的 得 率 很 低 ，极 大 地 降 低 了 成 功 获 得 引 物 的 机 率 ． １．２ 利用富集技术筛选犛犛犚 标记