超高效液相色谱串联质谱法同时测定沼液中9种_受体激动剂残留量_杨挺 - 副本

相关系数 r
0.9992 0.9991 0.9995 0.9994 0.9997 0.9996 0.9995 0.9990 0.9994
对 9 种药物在沼液空白样品中进行了 3 个水平 添加回收率实验， 每个浓度重复 6 次， 实验结果见 表 3。 从表 3 可见， 沼液中 9 种药物的添加回收率 为 75.2％～99.2％， 批内 RSD 为 1.8％～8.3％， 批间 RSD 为 2.1 ％～8.9％， 可见该方法具有较好的准确性 和重现性。 按信噪比 S/N=3/1 计算该方法对 9 种药 物的检测限均低于 0.1 ng g－1， 具有较好的灵敏度。
移 取 试 样 至 经 5 mL 甲 醇 和 5 mL 水 活 化 的 MCX 柱 （60 mg， 3 mL） 上， 待全部样液过柱后， 依次用 3 mL 水、 3 mL 2％的甲酸水、 3 mL 甲醇淋 洗 ， 抽 干 小 柱 ， 然 后 用 5 mL 5％的 氨 水 甲 醇 溶 液 洗 脱 。 洗 脱 液 置 于 40℃水 浴 中 氮 气 吹 干 ， 用 500 μL 甲醇－0.1％甲酸／水 （5+95） 溶解， 过 0.22 μm 滤膜后， 进行 LC－MS/MS 分析。
表 1 9 种 β－受体激动剂的定性、 定量离子对， 锥孔电压 及碰撞能量
药物
定性离子对
定量离子对
锥孔 碰撞 电压 能量
303.90＞134.91
28
非诺特罗
303.90＞106.91 32
303.90＞106.91
18
302.30＞107.20
30
莱克多巴胺
302.30>164.10 22
302.30＞164.10
检验检测
超高效液相色谱串联质谱法同时测定 沼液中 9 种 β-受体激动剂残留量*
杨 挺 赵 健 朱 勇 陈 国 吴银良 皇甫伟国
（农业部农产品质量安全监督检验测试中心 （宁波）， 宁波 315040）
摘 要： 本文应用固相萃取及超高效液相色谱－串联质谱技术， 建立了沼液中特步他林、 西马特罗、 沙丁胺醇、 非诺特 罗、 氯丙那林、 莱克多巴胺、 克仑特罗、 妥布特罗和喷布特罗等 9 种 β－受体激动剂残留的检测方法。 样品经酶解、 提取后， 用 MCX 固相萃取小柱净化。 采用 0.1％甲酸水溶液与甲醇作为流动相进行梯度洗脱， 经 BHE C18 色谱柱分离， 通过多反应监 测模式进行测定。 9 种 β－受体激动剂在 0.5～20 ng mL－1 的范围内线性关系良好， 相关系数 （r） 均 大 于 0.999。 沼 液 中 添 加 回 收 率 为 75.2％～99.2％， 批 内 RSD 为 1.8％～8.3％， 批 间 RSD 为 2.1 ％～8.9％， 检 测 限 均 为 0.1 ng g－1。 该 方 法 能 简 单 、 快速、 准确测定沼液中的 9 种 β- 受体激动剂。
228.03＞153.87
16
妥布特罗
228.03＞153.87 22
228.03＞171.88
12
226.03＞124.85
24
特布他林
226.03＞151.92 24
226.03＞151.92
16
220.10＞142.86
24
西马特罗
220.10＞142.86 18
220.10＞159.92
16
16
292.30＞236.02
28
喷布特罗
292.30＞236.02 22
292.30＞201.00
16
276.90＞203.00
28
克仑特罗
276.90＞203.00 22
276.90＞131.70
16
240.20＞148.20
18
沙丁胺醇
240.20＞148.2 20
240.20＞222.20
14
质 谱 条 件 ： ESI 源 正 离 子 模 式 电 离 ； 监 测 模 式 ： 多 反 应 监 测 （MRM）； 毛 细 管 电 压 ： 3.5 kV； RF 透镜电压： 0.5 V； 离子源温度： 150 ℃； 脱溶 剂气温度： 500 ℃； 锥孔气流速： 50 L/h； 脱溶 剂 气流速： 1 000 L/h； 倍增 器 电 压 ： 650 V； 二 级 碰 撞气： 氩气； 其他条件详见表 1。
（四 ） 线 性 实 验 准 确 称 取 各 10.0 mg 的 9 种 标准品于相应的 100 mL 容量瓶中， 用甲醇溶解并 定容至 刻 度 ， 即 得 均 为 100 μg mL－1 标 准 储 备 液 。 准确吸 取 各 标 准 储 备 液 1 mL 于 相 应 的 100 mL 容 量瓶中， 用甲醇定容至刻度， 即得均为 1.0 μg mL－1 标准中间液。 分别准确移取各标准中间液适量， 用 甲醇－0.1％甲酸／水 （5+95） 溶 液 配 制 浓 度 为 0.5、 1.0、 5.0、 10 和 20 ng mL－1 的系列标准工作溶液。
标准曲线
y = 3318.1x － 43.424 y = 13192x －3881 y = 35774x + 26215 y = 15058x + 8636.8 y = 21743x + 25553 y = 43473x + 6582.3 y = 12881x －3154.9 y = 8155.2x－225.6 y = 34092x + 1231.8
一、 材料与方法
（ 一 ） 仪 器 与 试 剂 Acquity UPLC XevoTM TQ MS 液相色谱串联质谱仪 （美国 Waters 公司）， 配 置 电 喷 雾 离 子 源 ； 固 相 萃 取 仪 （ 美 国 Supelco 公 司）。 非诺特罗、 莱克多巴胺、 喷布特罗、 克仑特
* 基金项目： 本文属于浙江省宁波市农业科技攻关项目 （2010C10008、 2010C10026） 的部分研究成果。 作者简介： 杨挺 （1977－ ）， 高级农艺师， 从事农兽药残留检测技术研究。 E－mail： easyyt@。
农产品质量与安全 2012 年第 3 期
45
检验检测罗、 沙丁胺醇、 Nhomakorabea布特罗、 特步他林、 西马特罗和 氯 丙 那 林 9 种 标 准 品 购 于 Dr. Ehrenstofer GmbH。 乙腈、 甲醇和乙酸铵为色谱纯。
（二 ） 色 谱－质 谱 条 件 Acquity BEH C18 色 谱 柱 （50 mm×2.1 mm， 内径 1.7 μm）。 流动相 A 为 0.1％甲 酸 水 ， B 相 为 甲 醇 。 梯 度 洗 脱 条 件 ： B 相 在 0 min 保 持 10 ％； 然 后 在 1 min 内 线 性 增 加 到 20 ％； 在 0.5 min 内线性增加至 50 ％； 在 0.5 min 内 线 性 增 加 至 80 ％ ， 保 持 3.4 min； 然 后 在 0.1 min 内降至 10％， 保持 4 min。 流速： 0.3 mL/min； 进样量： 10 μL； 柱温： 30℃。
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在 37℃下避光水浴振荡 16 h。 酶 解 后 ， 以 10 000 r/min 高 速 离 心 5 min， 转
移 上 清 液 于 另 一 50 mL 离 心 管 中 ， 用 5 mol/L 的 NaOH 溶液调 pH 至 9.8， 加入 10 mL 异丙醇－乙酸 乙酯 （6+4）， 再加入 1.5 g 的固体氯化钠饱和水相， 涡旋后振摇 10 min， 5 000 r/min 离心 5 min， 取上 清液于 50 mL 鸡 心 瓶 中 ， 再 用 10 mL 异 丙 醇－乙 酸乙酯 （6+4） 重复提取两次， 合并上清液， 50℃ 下 旋 转 蒸 干 ， 用 5 mL 2 mol/L 的 乙 酸 铵 缓 冲 液 （pH = 5.2） 溶解。
在畜牧生产中使用药物后， 药物不能被生猪完 全吸收， 有相当部分以原形或代谢物的形式随粪便 和尿液排出。 Marion Rabiet 等在污水处理厂出口检 测到痕量盐酸克仑特罗［1］， 表明盐酸克仑特罗在环 境中具有持久性。 因此， 一旦养殖场使用了 β－受 体激动剂， 必然会在沼液中残余。 我国农业部门正 大力开展猪场配套沼气池粪污处理工程， 沼液的量
极大且便于取样， 这对养殖场用药监控提供了极大 的便利。 但目前未有在沼液中检测 β－受体激动剂 的残留分析方法报道。
对 β－受体激动剂的主要分析手段有免疫法 、 ［2～4］ 气相色谱－质谱法 （GC－MS）［5］、 高效液相色谱法 （HPLC） ［6］ 及 高 效 液 相 色 谱 串 联 质 谱 法 （HPLC－ MS/MS）［7］， 其中 GC－MS 和 LC－MS/MS 为确证方 法。 本研究采用 LC－MS/MS 分析手段， 选取了盐 酸克仑特罗、 莱克多巴胺、 沙丁胺醇以及具有类似 作用的特步他林、 西马特罗、 非诺特罗、 氯丙那 林、 妥布特罗和喷布特罗为研究对象， 建立了沼液 中 9 种 β－受体激动剂残留同时分析的方法。 整个 方法具有简单、 准确、 灵敏的特点， 能满足对养殖 场日常监测的需要。
214.03＞118.41
24
氯丙那林
214.03＞153.89 22
214.03＞153.89
18
（三） 样品处理 将沼液以 5 000 r/min 离心 5 min 后， 量取 5 mL 上清液于 50 mL 离心管中， 加 入 0.5 mL 2 mol/L 的 乙 酸 铵 缓 冲 液 （pH=5.2）， 再 加 入 40 μL 的 β－盐 酸 葡 萄 糖 醛 苷 酶 ， 涡 旋 30 s，
（二） 净化条件优化 由于沼液中含有大量的 絮状物等杂质， 因此需要离心后取上清液进行下一 步试验。 9 种 β－受体激动剂药物由于苯环上的取 代基的不同分属苯胺型、 苯酚型和间苯二酚型。 苯 酚类和间苯二酚类苯环上的羟基是葡萄糖醛苷或硫 酸酯的结合位点， 这两类药物经动物代谢后， 多数 转化为羟基结合葡萄糖醛苷或硫酸酯的代谢物， 测 定这类化合物时需要将其解离转化为代谢前的化合 物。 本实验采用 β－盐酸葡萄糖醛苷酶进行酶解。 9 种 β－受体激动剂均为弱碱性物质， 因此在酶解后 选 用 MCX 固 相 萃 取 柱 进 行 富 集 和 净 化 。 MCX 柱