皮肤癌细胞株p53基因及其表达蛋白质的分析
p53基因在乳腺癌组织中表达及其与survivin关系的探讨的开题报告
p53基因在乳腺癌组织中表达及其与survivin关系的探讨的开题报告一、研究背景乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率在全球范围内都处于较高的水平。
p53基因是一种关键的抑癌基因，它通过调控细胞的周期、凋亡、DNA修复等过程来抑制肿瘤的发生。
而Survivin是一种新近发现的抑癌基因，在凋亡、细胞周期等方面起着重要作用。
有研究表明，p53基因与Survivin之间存在相互作用，而乳腺癌中p53基因的异常表达与Survivin的异常表达密切相关。
因此，研究p53基因在乳腺癌组织中的表达及其与Survivin之间的关系，对于深入了解乳腺癌的发病机制和制定相关治疗方案具有重要意义。
二、研究目的通过对乳腺癌组织中p53基因和Survivin的表达情况进行研究，探讨p53基因在乳腺癌中的作用机制及其与Survivin之间的相互作用。
三、研究内容及方法1.样本采集与处理收集手术切除的乳腺癌组织样本50例，同时收集相应的癌旁组织作为对照。
样本经过快速冰冻保存，待实验处理。
2.RT-PCR检测p53基因和Survivin的表达使用TRIzol方法将样本组织细胞打散，并进行总RNA的提取，用RT-PCR方法检测p53基因和Survivin的表达水平。
3. Western blot分析蛋白表达使用SDS-PAGE方法分离蛋白质，并通过Western blot方法检测p53和Survivin的蛋白表达情况。
4.免疫组织化学染色对乳腺癌组织和癌旁组织进行HE染色及免疫组织化学染色，观察p53和Survivin的表达情况。
四、预期结果通过RT-PCR和Western blot等方法检测得到乳腺癌组织中p53和Survivin的表达水平，并利用免疫组织化学方法观察细胞中p53和Survivin的分布情况。
根据得到的结果，我们可以进一步分析p53基因在乳腺癌中的作用机制及其与Survivin之间的相互作用，为制定和优化乳腺癌治疗方案提供理论依据。
抑癌基因p53与p16及PCNA蛋白在皮肤增生期血管瘤中的表达及其对血管内皮细胞的干预
抑癌基因p53与p16及PCNA蛋白在皮肤增生期血管瘤中的表达及其对血管内皮细胞的干预夏扬;高颖;徐光;刘静【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2006(010)025【摘要】目的:应用免疫组化法检测抑癌基因p16,p53及DNA聚合酶δ的辅助蛋白PCNA在增生期血管瘤中的表达,及其对血管内皮细胞的影响.方法:实验选取2001-01/2005-04北京世纪坛医院病理科收集的手术切除皮肤增生期血管瘤组织标本36例作为增生期血管瘤组(患者术前均未经任何辅助性治疗),以痔静脉标本30例作为痔静脉对照组.患者均知情同意.①两组标本切片均采用DAKO Envisions 二步法进行免疫组化处理.切片以体积分数为0.03的过氧化氢消除内源性过氧化物酶,微波法抗原修复,92～95℃于pH 6.0枸盐酸缓冲液浸泡10 min;室温冷却10 min,双蒸水洗涤,pH 7.2磷酸盐缓冲液浸泡5 min;体积分数为0.1的山羊血清(磷酸盐缓冲液稀释)封闭,去血清,加入Ⅰ抗,37℃浸泡30 min;pH 7.2磷酸盐缓冲液冲洗;Envision孵育,37℃下放置30 min;二氨基联苯胺显色,苏木精复染后,脱水、透明、封固.免疫组化阴性对照以磷酸盐缓冲液代替Ⅰ抗,其他步骤维持不变,以确认试剂质量及控制染色效果.②p16,p53阳性信号为棕黄色,以内皮细胞浆和/或核染成棕黄色为阳性细胞.阴性对照除细胞核染成蓝色外,无棕黄色反应物.血管内皮细胞核内见棕黄色颗粒者为PCNA蛋白染色阳性.采用CMIAS高清晰彩色病理图像分析系统分别对两组切片p53,p16及PCNA蛋白的表达进行图像检测,测定每个视野下p16和p53阳性细胞的平均吸光度以及PCNA蛋白阳性表达指数.结果:实验选取手术切除皮肤增生期血管瘤组织标本36例,痔静脉标本30例,全部进入结果分析.①两组p53阳性表达检测及平均吸光度的比较:增生期血管瘤组内皮细胞核内有较多棕黄色颗粒,p53表达强;痔静脉对照组血管内皮细胞核内无棕黄色颗粒沉积,p53表达极弱.增生期血管瘤组p53阳性表达的平均吸光度明显强于痔静脉对照组(6.423±1.415,1.036±0.131,P＜0.05).②两组p16阳性表达检测及平均吸光度的比较:两组切片组织中除细胞核着色外,部分细胞浆有着色.p16的阳性表达在增生期血管瘤组和痔静脉对照组中基本相同,平均吸光度分别为1.241±0.373和1.206±0.267.③两组PCNA蛋白阳性表达指数的比较:PCNA蛋白阳性表达的细胞光镜下可见核内弥漫分布细小的棕黄色颗粒,这些内皮细胞围成血管腔及团块状,核椭圆,体积较大.增生期血管瘤组PCNA蛋白阳性表达指数明显高于痔静脉对照组(67.40±8.79,38.41±9.89,P＜0.01).结论:抑癌基因p53在增生期血管瘤组织中呈高表达,能够促进血管内皮细胞的增殖,但p16的表达与血管内皮细胞增殖的关系不明显.此外PCNA蛋白可作为增生期血管瘤的可靠标志物.【总页数】3页(P99-101)【作者】夏扬;高颖;徐光;刘静【作者单位】北京世纪坛医院,整形外科,北京市,100038;北京世纪坛医院,病理科,北京市,100038;北京世纪坛医院,整形外科,北京市,100038;北京世纪坛医院,整形外科,北京市,100038【正文语种】中文【中图分类】R329.412【相关文献】1.癌基因c-erbB2、c-myc和抑癌基因p16、p53在口腔鳞癌中的蛋白表达及其协同作用 [J], 刘乃国;张卫群;吴淑华;单长民;吕增华;曹同涛2.膀胱移行细胞癌中P53、P16蛋白和PCNA的表达和临床意义 [J], 蒋雷鸣;姚铁钧;杨燕伟;申鹏飞3.婴幼儿退化期及增生期皮肤血管瘤组织中PTEN、Rb 蛋白表达变化及意义 [J], 于浩4.p53,p16,PCNA蛋白在食管癌中的表达及其临床意义 [J], 谢金龙;莫放林;严振球5.所谓肺硬化性血管瘤组织中p53和PCNA蛋白表达及意义 [J], 齐凤杰;张秀伟;王恩华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
p53基因突变产物在宫颈癌中的表达
p53基因突变产物在宫颈癌中的表达摘要：p53基因是人们发现至今与人体相关性最高的基因，其位于17号染色体的短臂上，具有诱导细胞凋亡，防止细胞癌变的作用，同时又参与细胞的修复过程。
p53基因若发生突变，则会失去抑瘤的能力，与此同时也会由抑癌基因转化为癌基因。
本文就p53基因突变产物在宫颈癌发病中的意义进行如下综述，希望为临床的治疗提供参考价值。
关键词：p53基因；突变产物；宫颈癌Abstract: p53 gene is the gene that has the highest correlationwith human body. It is located on the short arm of chromosome 17,which can induce apoptosis and prevent cell cancer, and alsoparticipate in the process of cell repair. If the p53 gene is mutated, it will lose the ability to suppress tumor, and at the same time, itwill be transformed from a tumor suppressor gene to a cancer gene. In this paper, the significance of p53 gene mutation products in the pathogenesis of cervical cancer is summarized as follows, hoping to provide reference value for clinical treatment.Key words: p53 gene; Mutant products; Cervical cancer在女性的生殖器官中子宫颈癌属于最常发生的恶性肿瘤，其发病机制尚不明了，但是从流行病学的方面研究，发现子宫颈癌的发生与地理环境、不当的性行为、吸烟、子宫糜烂、抑癌基因的失活等方面有着密切的联系【1】。
CyclinE和P27、P53在皮肤癌中的表达及相关性
CyclinE和P27、P53在皮肤癌中的表达及相关性曹婉维;刘少璇;郭永谊;王晓鸿【摘要】目的探讨细胞周期蛋白E(CyclinE)和P27、P53在皮肤癌中的表达及相关性.方法应用免疫组化法检测30例皮肤癌组织中CyclinE和P27、P53的表达情况.分析三者与皮肤癌Broders标准分级之间的关系,以及CyclinE与P27、P53的相关性.结果皮肤癌组织CyclinE 、P27表达与对照组比较显著升高(χ2=12.05;χ2=25.15,P＜0.05).在各级鳞癌组织间比较,CyclinE和P53表达差异明显(χ2=9.84;χ2=8.85,P＜0.05);P27在鳞癌组织中的阳性率较对照组低(χ2=3.98,P＜0.05),P27在鳞癌组织各级间比较,差异无统计学意义(χ2=1.16,P＞0.05).结论 CyclinE、P27、P53在皮肤鳞癌中有异常表达,在皮肤鳞癌中的发生发展中可能起一定作用.【期刊名称】《中国实用医药》【年(卷),期】2011(006)004【总页数】2页(P3-4)【关键词】细胞周期蛋白E;P27;P53;皮肤癌【作者】曹婉维;刘少璇;郭永谊;王晓鸿【作者单位】519000,中山大学附属第五医院病理科;519000,中山大学附属第五医院病理科;519000,中山大学附属第五医院检验科;519000,中山大学附属第五医院病理科【正文语种】中文皮肤鳞状细胞癌(skin squamous cell carcinoma,SCC)是从正常皮肤的基底细胞发生的恶性肿瘤,其发生是多基因多步骤积累损害的结果,其中基因的异常表达起着非常重要的作用[1]。
细胞周期调控基因在肿瘤细胞发生与发展中起重要作用。
我们应用免疫组织化学法研究细胞周期蛋白E(CyclinE)在皮肤鳞状细胞癌(皮肤鳞癌)的表达,以及 P27、P53表达的相关性,探讨三者与皮肤鳞癌的发生、发展的关系。
1.1 一般资料选取中山大学附属第五医院 2008年 1月到2010年 1月收治,经病理组织学确诊且术后标本蜡块保存完好的皮肤鳞状细胞癌患者的组织标本蜡块 30例。
CyclinE、 p27、 p53在皮肤鳞状细胞癌中的表达及相关性
CyclinE、 p27、 p53在皮肤鳞状细胞癌中的表达及相关性张桂珍
【期刊名称】《中国现代医生》
【年(卷),期】2011(049)028
【摘要】目的探讨CyclinE、p27、p53在皮肤鳞状细胞癌中的表达及相关性.方法采用免疫组化法检测36例皮肤鳞状细胞癌组织中CyclinE、p27、p53,分析三者表达与皮肤鳞状细胞癌分化程度之间的关系及三者之间的相关性.结果 CyclinE、p53在皮肤鳞状细胞癌中表达均显著高于正常皮肤,随肿瘤分化程度降低而增强(P ＜0.05)；p27在皮肤鳞状细胞癌中表达均显著低于正常皮肤,随肿瘤分化程度降低而减弱(P＜ 0.05)；CyclinE表达与p53表达呈正相关,与p27表达呈负相关.结论CyclinE、p53在皮肤鳞状细胞癌中的表达上调,p27表达下调,三者与皮肤鳞状细胞癌分化程度存在相关性.
【总页数】3页(P112-113,153)
【作者】张桂珍
【作者单位】浙江省杭州市余杭区中医院病理科,浙江杭州311106
【正文语种】中文
【中图分类】R739.5
【相关文献】
1.P27kipl及cyclinE在乳癌中的表达及相关性研究 [J], 姜鸿南;张瑜;范江
2.肺癌中细胞周期调控因子p27和CyclinE的表达及其相关性 [J], 刘勇;路名芝;
杨海玉
3.卵巢上皮性肿瘤中P27和P53蛋白的表达及其相关性研究 [J], 高会玲;焦悦;孙树静
4.CyclinE,P27在皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义 [J], 李灵;杨红;宋林红;董丹丹;李科
5.CyclinE和P27、P53在皮肤癌中的表达及相关性 [J], 曹婉维;刘少璇;郭永谊;王晓鸿
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P53EGFR在胶质瘤组织中的表达及意义
P53EGFR在胶质瘤组织中的表达及意义胶质瘤是一种常见的恶性肿瘤，其治疗难度大且预后较差。
因此，寻找与胶质瘤发生和发展相关的肿瘤标志物和治疗靶点具有重要意义。
近年来，许多研究表明，p53蛋白和表皮生长因子受体（EGFR）在胶质瘤患者中的异常表达与胶质瘤的发生、发展和预后密切相关。
p53蛋白是细胞周期调控和细胞凋亡的关键因子，其功能异常与肿瘤的发生和发展密切相关。
研究表明，p53的突变或丧失在40%-50%的高级别胶质瘤中观察到。
丧失p53功能会导致细胞凋亡减少、DNA损伤修复受限和肿瘤细胞免疫逃逸等，从而导致肿瘤的增殖和转移。
因此，p53的功能状态被认为是胶质瘤患者预后的重要影响因素之一。
EGFR是一种膜上酪氨酸激酶受体，其功能异常涉及到多种恶性肿瘤的发生和发展。
EGFR基因扩增或突变会导致EGFR的过量表达或异常激活，进而促进肿瘤的增殖、侵袭和转移。
研究表明，EGFR扩增或突变在胶质瘤中是比较常见的遗传变异，其中2-3级别胶质瘤的EGFR扩增率可高达30%-50%。
此外，EGFR表达水平的升高还与胶质瘤的预后不良相关。
研究表明，p53和EGFR在胶质瘤中的异常表达与胶质瘤的临床特征和预后密切相关。
例如，p53突变或丧失与高级别胶质瘤的发生和预后不良相关，而EGFR扩增或表达水平升高则与胶质瘤的预后不良相关。
此外，p53和EGFR的联合异常表达与胶质瘤的侵袭和转移相关。
在治疗方面，p53和EGFR也被认为是胶质瘤治疗的潜在靶点。
例如，许多研究表明，使用p53基因治疗技术可以抑制肿瘤的增殖和恶性转化，从而提高胶质瘤患者的生存率。
此外，一些临床研究也表明，抑制EGFR的活性可以有效抑制胶质瘤的增殖和侵袭，从而提高患者的预后。
因此，p53和EGFR的异常表达和功能状态对于胶质瘤的诊断和治疗具有很大的临床意义。
综上所述，p53和EGFR在胶质瘤中的异常表达与胶质瘤的发生、发展和预后密切相关。
因此，进一步研究p53和EGFR的功能机制和调控途径，以及寻找相关的诊断和治疗方法，将有助于提高胶质瘤患者的治疗效果和生存率。
分子分型p53标志物
分子分型p53标志物
p53是一种重要的肿瘤抑制基因，它编码的蛋白质在细胞中起着重要的调控作用。
p53标志物通常是指与p53基因或蛋白相关的分子或分型。
从分子角度来看，p53标志物可以包括p53基因的突变状态、p53蛋白的表达水平、p53蛋白的翻译后修饰状态等。
p53基因的突变状态是肿瘤学研究中常用的标志物之一，因为p53基因的突变与多种肿瘤的发生密切相关，而p53蛋白的表达水平和修饰状态也可以作为肿瘤的诊断和预后标志物。
从分型角度来看，p53标志物可以根据其在肿瘤中的表达模式进行分类。
比如，p53可以根据其核内或核外的定位来进行分型，也可以根据其在肿瘤组织中的表达强度和范围来进行分型。
这些分子分型的研究有助于更好地理解p53在肿瘤发生发展中的作用，为肿瘤的诊断和治疗提供更精准的信息。
除了分子分型，p53标志物还可以从临床角度来进行研究。
比如，p53蛋白的表达水平与肿瘤的预后和治疗反应密切相关，因此p53标志物在临床诊断和治疗中具有重要意义。
此外，针对p53的药物治疗也是当前肿瘤研究的热点之一，p53标志物的研究有助于筛选出更有效的靶向药物，为肿瘤的个体化治疗提供依据。
总之，p53标志物涉及到分子、分型和临床等多个方面，其研究对于肿瘤的诊断、治疗和预后评估具有重要意义。
希望我的回答能够全面地解答你的问题。
p53蛋白分子机制
p53蛋白分子机制
p53蛋白是细胞中一个重要的调控蛋白，它在维持细胞的正常生命周期和DNA修复中起着关键作用。
它被称为“基因的守护者”，因为它能够监测细胞中的DNA损伤，并采取必要的措施来防止这些损伤引起的潜在问题。
p53蛋白的分子机制与其在细胞中的功能密切相关。
它由一条长链组成，含有多个结构域，包括DNA结合结构域、转录活性结构域和调控结构域。
这些结构域的存在使得p53蛋白能够与其他蛋白发生相互作用，从而参与细胞的调控过程。
当细胞中的DNA受到损伤时，p53蛋白会被激活，并开始执行其调控功能。
首先，p53蛋白会结合到受损的DNA上，从而阻止其进一步受到损伤。
随后，p53蛋白会启动一系列信号传导途径，以促进DNA修复和细胞周期的调控。
p53蛋白还能够调节细胞的凋亡过程。
当细胞受到严重的DNA损伤时，p53蛋白会激活一些特定的基因，这些基因能够促进细胞凋亡。
通过引导受损细胞的自我毁灭，p53蛋白能够防止这些细胞继续分裂并产生更多的损伤。
p53蛋白还能够调节细胞的增殖和分化过程。
在细胞分裂时，p53蛋白能够监测细胞的DNA完整性，并在需要时阻止细胞继续分裂。
这样一来，p53蛋白能够防止异常细胞的产生，并维护细胞的正常功
能。
总的来说，p53蛋白的分子机制使得它能够在细胞中发挥重要的调控作用。
它通过监测细胞的DNA损伤、促进DNA修复、调节细胞凋亡和控制细胞增殖等方式，保护细胞免受损伤并维持细胞的正常功能。
正是由于p53蛋白的分子机制，细胞才能够有效地应对各种内外部的压力和挑战，从而保持其稳定和健康的状态。
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２００４年ｌ２月总第２５期 中 国 临床医药实用杂志 ＰＲＡＣＴＩＣＥ ０Ｎ ＣＨＩＮＥＳＥＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥＳ
【１１］高怀生，黄是是，张世达，等．碘壳聚糖生物敷料的制备．中国药学 杂志，１９９６；３１：２８０ 【１２］Ｓｈｉｂａｔａ Ｙ，ｅｔ ａｌ＿【Ｊ】＿Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７，６５（５）：１７３４—１７４１ 【１３］Ｒｅ ｍｉｎｔｅｒｉａ Ａ，ｅｔ ａｌ＿【Ｊ】．Ｆｅ ｍｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ＆Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９７，１９（３）：２２３－２３０． 【１４］ＫｏｓａｋａＴ，ｅｔａｌ＿【Ｊ】．Ｊｏｕｒｎ￣ｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６，５８（１ Ｏ１：９６３－９６７． 【１５］Ｎｉｓｈｉｎｕｒａ Ｋ，ｅｔ ａｌ＿【Ｊ】．Ｂｉｏｍａｌ Ｒｅｓ，１９８６，２０（９）：１３５９． 【１６］东市朗，等．【Ｊ］．化学工业，１９９１，１０：４９－５４． 【１７］郑晓广，沈新元，杨庆．甲壳胺及其衍生物在保健领域中的应用【Ｊ］． 河南师范大学学报，１９９９，２７（３）：４６．５０． 【１８］吴清基．甲壳质与壳聚糖纤维．高科技纤维与应用．１９９８，２３（２）：３－１５ 【１９］翟羽伸．甲壳资源的利用开发．化工进展．１９９２，１１（１）：１４—１８ 【２０］Ｊａｙａｓｒｅｅ Ｒ Ｓ，Ｒａｔｈｉｎａｍ Ｋ，Ｓｈａｒｍａ Ｃ Ｐ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａｒｔｉ－ｆｉｃｉａｌ ｓｋｉｎ（Ｔｅｍｐｌａｔｅ）ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌ—ｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｏｎ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓａｎｄ ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ Ａｐｐ１．１９９５， １０（２）：１４４－１６２ 【２１］盛以虞．甲壳素及其衍生物的应用．１９８９，１３（１）：３４—３９ 【２２］王建中．微晶甲壳质的免疫作用初步研究中国海洋药物．１９８４， ｆ２）：１９—２Ｏ 【２３］Ｔａｋｅｃｈｉ Ｍ，Ｍｙａｍｏｔｏ Ｙ，Ｉｓｈｉｋａｗａ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｎｏｎ—ｄｅｃａｙ ｔｙｐｅ ｆａｓｔ ｓｅｔｔｉｎｇ ｃａｌｃｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃｅｍｅｎｔ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｔｏｓａｎ．Ｊ Ｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｍａｔｅｒ．Ｍ １９９６， ７（６）：３ １７－３２２ 【２４］Ｈｉｒａｎｏ Ｓ，ＴａｎａｋａＹ，ＨａｓｅｇａｗａＭ，ｅｔａ１．Ｅｆｆｅｃｔｏｆ ｓｕｌｆａｔｅｄｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｏｎ ｓｏｍｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃａｒ ｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９８５， １３７：２０５．２１５ 【２５］Ｈａｉｍｏｖｉｃｈ Ｂ，Ｄｉｆａｚｉｏ Ｌ，Ｋａｔｚ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ａ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｘ ｍｅｍｂｒａｍｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｎ ｅＰＴＦＥ ｖａｓｃｕｌａｒ ｇｒａｆｔｓ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ．Ａｐｐ１．Ｐｏｌｙｍ Ｓｃｉ １９９７．６３（４）：１３９３－１４００ 【２６］Ｋａｎｇ Ｄｅ Ｙａｏ，１ＶＫｉ Ｘｕａｎ Ｘｕ，Ｙｕ Ｊｉ Ｙｉｎ，ｅｔ ａ１．ＰＨ ｓｅｎｓｉ－ｔｉｖｅ ｃｈｉｔｏｓａｎ／ｇｅｌａｔｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎｅｔｗｏｒｋ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｉｍｅｔｉｄｉｎｅ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ１．１９９６，３９ ｆ４１：３３３－３３７ 【２７］李文俊，王汉夫，卢玉华等．壳聚糖·聚丙烯酸配合物半互穿聚合 物网络膜及其对Ｐ Ｈ和离子的刺激响应．高分子学报．１９９７，２（１）：１０６－１１０ 【２８］Ｌｅｅ Ｋｕｅｎ Ｙｏｎｇ，Ｗｏｎ Ｈｏ Ｐａｒｋ，Ｗａｎ Ｓｈｉｋ Ｈａ．Ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ａｌｇｉｎａｔｅ ｗｉｔｈ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｏｒ ｉｔｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ＿Ｊ．Ａｐｐ１．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．１９９７，６３（４）：４２５－４３２ 【２９］彭湘红，张俐娜，潘雪龙．壳聚糖一丝心蛋白包药微球的结构和释放 性能研究．高分子学报．２０００，８（４）：５０２—５０５ 【３０］Ｇｏｏｓｅ ｎ，Ｍａｔｔｈｅｕｓ ＦＡ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎ ａｎｄ ｃｈｉ－ｔｏｓａｎ［Ｍ］．Ｃａｎｃａｓｔｅｒ ＰＡ：Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂ，１９９７．４０７．４０９． 【３１］Ｓｉｎｇｈ ＤＫ，Ｒａｙ ＡＲ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎ，ｃｈｉｔｏｓａｎ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＪＭＳ——ＲｅｖＭａｃｒｏ－ｍｏｌＣｈｅｍＰｈｙｓ，２０００，４０（Ｉ）：７１－７７． 【３２］刘世英，吴清基．医用甲壳质与壳聚糖纤维的开发现状及前景【Ｊ］． 产业用纺织品，１９９４，（１２）：１０．１２．
皮肤癌细胞株ｐ５３基因及其表达蛋白质的分析 金昱 （延边大学医学院解剖学教研室１３３０００）
［摘要］目的：检测皮肤癌细胞株ｐ５３基因特性，为今后的ｐ５３基因治疗及生物治疗研究提供实验材料。方法：采用聚合酶 链反应．单链构象多态性分析，ＤＮＡ序列分析结合Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ方法，对４个皮肤癌细胞株的ｐ５３基因突变及ｐ５３基因的亚 型进行研究。鲒果：３个细胞株中检出了基因突变，即在ＫＵＭＡ３细胞株密码子１７６的砼基Ｔ被Ａ置换，密码子２８１的砼基 Ｇ被Ａ置换；在ＫＵＭＡ４细胞株密码子２４１的砼基ＣＣ被丌置换；在ＫＵＭＡ６细胞株密码子２６６的砼基Ｇ被Ｔ置换。第 ７２位密码子的多态性分析结果ＫＵＭＡ３和ＫＵＭＡ４细胞株是Ａｒｇ／Ｐｒｏ杂合型，ＫＵＭＡ５细胞株是Ａｒｇ／Ａｒｇ纯合型，ＫＵＭＡ６ 细胞株是Ｐｒｏ／Ｐｒｏ纯合型。鲒论：ＫＵＭＡ３，ＫＵＭＡ４和ＫＵＭＡ６细胞株ｐ５３基因有突变，而ＫＵＭＡ５细胞株ｐ５３基因无突 变；ＫＵＭＡ３和ＫＵＭＡ４细胞株是ｐ５３－７２Ａｒｇ／Ｐｒｏ基因型，ＫＵＭＡ５细胞株是ｐ５３·７２Ａｒｇ／Ａｒｇ基因型，ＫＵＭＡ６细胞株是 ｐ５３．７２Ｐｒｏ／Ｐｒｏ基因型。 ［关键词］皮肤癌；ｐ５３基因；单链构象多态性；ＤＮＡ序列；单核菩酸多态性
Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｉｎ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ Ｊｉｎ Ｙｕ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎａｔｏｍｙ Ｙａｎｂｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｙａｎｊｉ １ ３３０００） 【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｆｆｅｒｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，ｔｈｅ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｆｅａｔｕｒｅ ｏｆ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂｔｙｐｅ ｏｆ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ １２ 中 国临床医药实用杂志 ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＮ ＣＨＩＮＥＳＥＣＬＩＮＩＣＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥＳ ２００４年１２月总第２５期
ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ－ＳＳＣＰ ａｓｓａｙ，ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｅｓ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｓｓａｙＲｅｓｕｌｔｓ：Ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｎｏｔｅｄ ｉｎ ３ ｏｆ ４ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓＩＩｌ ｍｅ
ＫＵＭＡ３ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｃｏｄｅ １７６，ｂａｓｅ Ｔ ｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｗｉｔｈ ｂａｓｅ Ａ ａｎｄ ｉｎ ｃｏｄｅ ２８１ ｂａｓｅ Ｇ ｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｂｙ ｂａｓｅ ＡＩｎ ｔｈｅ ＫＵＭＡ４ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
ｃｏｄｅ ２４１，ｂａｓｅ ＣＣ ｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｗｉｔｈ ｂａｓｅ ＴＴ．Ｉｎ廿１ｅ ＫＵＭＡ６ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｃｏｄｅ ２６６，ｂａｓｅ Ｇ ｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｗｉｔｈ ｂａｓｅ Ｔ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｐｏｌｙ—ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｏｄｅ ｏｆ ｉｎ ７２ 。ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｏｆ ＫＵＭＡ３ ａｎｄ ＫＵＭＡ４ ｗｅｒｅ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｈｏｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ ｔｙｐｅ Ａｒｇ／Ｐｒｏ，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ＫＵＭＡ５ ｗａｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ ｔｙｐｅ Ａｒｇ／Ａｒｇ ａｎｄ ｔｈｅ ＫＵＭＡ６ ｗａｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ ｔｙｐｅ Ｐｒｏ／Ｐｒｏ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｐ５３ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｏｆ ＫＵＭＡ３，ＫＵＭＡ４ ａｎｄ ＫＵＭＡ６，ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｉｄ ｎｏｔ ｎｏｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ＫＵＭＡ５．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｏｆ ＫＵＭＡ３ ａｎｄ ＫＵＭＡ４ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｅｄ ｂｅｌｏｎｇｓ ｔｏ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｐ５３－７２Ａｒｇ／Ｐｒｏ， ＫＵＭＡ５ ｗａｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｐ５３－７２Ａｒｇ／Ａｒｇ ａｎｄ ＫＵＭＡ６ ｗａｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｐ５３—７２Ｐｒｏ／Ｐｒｏ． 【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】Ｓｋｉｎ ｃａｎｃｅｒ：ｐ５３ ｇｅｎｅ：Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｐ５３基因是抑癌基因之一，位于１７号染色体的短臂 （１７ｐ１３）上由ｌ１个外显子（ｅｘｏｎ）构成。其表达的ｐ５３蛋 白质具有调节细胞周期的功能，特别是在Ｇ１ ｃｈｅｃｋ ｐｏｉｎｔ 起重要作用，ＤＮＡ受损伤时细胞内ｐ５３蛋白质被激活，使细 胞周期停留在Ｇ１期，中断ＤＮＡ的复制，修复损伤ＤＮＡ或修 复不了可引起细胞凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）“ 。于是ｐ５３基因突变 或缺失时细胞凋亡的信号传递体系出现异常，非正常细胞不 能进入程序化的死亡过程，而异常增殖 。ｐ５３基因的密码 子（ｃｏｄｏｎ）７２程现单核苷酸多态性（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ），存在两种变异形式：ＣＧＣ和ＣＣＣ，这 使其编码的氨基酸残基分别为精氨酸（ａｒｇｉｎｉｎｅ，Ａｒｇ）或脯 氨酸（ｐｒｏｌｉｎｅ，ｐｒｏ） 。最近研究表明ｐ５３基因的机能取决 于细胞内存在的ｐ５３基因的亚型（ｓｕｂｔｙｐｅ），且其中含精氨 酸的亚型比含脯氨酸的亚型抑癌作用更显著 。这说明同一 类型肿瘤也其所具有的ｐ５３基因特性不同，而对肿瘤的发生， 发展及对抗癌药的反应也有所不同。基于这些本文利用 ＰＣＲ—ＳＳＣＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＳＳＣＰ），ＤＮＡ序列分析，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析方法，调查４个 皮肤癌细胞株Ｐ５３基因特性，为今后的ｐ５３基因治疗及生物 治疗研究提供不同特性实验材料。 １、研究材料与方法 １．１研究材料本实验使用了在启明医科大学解剖学教研 室建立的４个皮肤癌细胞株ＫＵＭＡ３，ＫＵＭＡ４，ＫＵＭＡ５，ＫＵＭＡ６和 细胞株银行购入的ＨａＣａＴ（ｍｕｔａｎｔ—ｐ５３）及ＨＣＴＩ １６（ｗｉ ｌｄ—ｐ５３） 细胞株。 １．２研究方法 １．２．１细胞株培养各细胞株使用含有１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）及抗生素的Ｆ一１２培养液，在５％Ｃｏｚ，３７＊Ｃ培养箱内 进行培养。 １．２．２细胞株ＤＮＡ提取培养细胞收集到２ｍｌ试管，用ＰＢＳ 洗涤一次后，加入ＴＥ缓冲液（１ＯｍＭ Ｔｒｉｓ—ＨＣＩ，ｌｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．０）７００ｕｌ和提取液［Ｒｎａｓｅ Ａ（１０ ｍｇ／ｍ１）１０ｕｌ，１０％ＳＤＳ ３５ｕｌ，ＴＥ ５５ｕｉ］１００ｕｌ，在３７℃放置２个小时后添加 ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍ１）４０ｕｌ，过夜，第二天加等量 Ｐｈｅｎｏｌ—ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ—ｉｓｏａｍｙｌａｌｃｏｈｏｌ（２５：２４：１），提取上清 液。上清液里添加０．１倍３Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐｎ ５．５）和２ 倍１００％ｅｔｈａｎｏｌ（一２０℃）使ＤＮＡ沉淀。用７０％ｅｔｈａｎｏｌ（－２０ ℃）洗涤后，溶解在适量的ＴＥ缓冲液，保管使用。 １．２．３ ＰＣＲ—ＳＳＣＰ分析及ＤＮＡ序列分析ＰＣＲ总反应体积为 ２５ｕｉ，其中模板ＤＮＡ２００ｎｇ，０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ ４ｕｌ，１０ｘ缓冲液 ２．５ｕｌ，５０ｐＭ引物０．４ｕｌ，２５ｍＭ ＭｇＣ１ ｚ１．５ｕｌ，５Ｕ Ｔａｑ酶０．２ｕｌ。 扩增外显子５的引物为５ 一ＧＧ从ＴＴｃＴＧＴＴｃＡｃＴＴＧＴＧＣｃｃＴＧＡｃ ＴＴＴＣＡＡＣ一３ ，５ 一ＧＣ＾ｕＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＴＣＧＴＣＴＣＴＣＣＡ一３ ，产物 片段长２６４ｂｐ；扩增外显子６的引物为５ 一ＣＣＴＧＧＣＣＴＣＴＧＡＴＴ ＣＣＴＣＡＣＴＧＡＴＴＧ一３ ，５ 一ＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＡＣ从ＣＣＡＣＣＣＴＴ从Ｃ一３ ， 产物片段长２０５ｂｐ：扩增外显子７的引物为５ 一ＡＣＡＧＧＴＣＴＣ ｃｃＣＡＡＧＧＣＧＣＡｃＴＧＧ一３ ，５ ＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＡＧ一３ ， 产物片段长２２６ｂｐ，；扩增外显子８的引物为５ 一ＡＧＧＴＡＧＧＡＣＣ ＴＧＡＴＴＴＣＣＴＴＡＣＴＧＣＣ一３ ，５ 一ＧＧＡＡＴＴＣＴＧＡＧＧＣＡＴ从ＣＴＧＣＡＣＣＣ ＴＴＧＧＴＣＴ一３ ，产物片段长２４８ｂｐ。反应条件为：在ＰＴＣ一２００ 热循环仪（美国）上９５℃预变性１０ｍｉｎ，然后９４￣Ｃ变性ｌｍｉｎ， ５９．３—６３．５￣Ｃ退火ｌｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，３４个循环后于７２ ℃再延伸５ｍｉｎ。取ＰＣＲ产物９ｕｌ，经１．５％琼脂糖凝胶电泳检 测产物。将ＰＣＲ产物取１．５ｕｌ加等量变性载样液，混合后１００ ℃变性５ｍｉｎ，立即置于冰上５ｍｉｎ，上样于８％ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ 凝胶中电泳，硝酸银染色观察结果。ＳＳＣＰ分析有异常单链构 象带的ＰＣＲ产物，经自动测序仪正反向测序，与人类基因组 ｐ５３基因序列比较分析结果。 １．２．４ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析提取培养细胞的总蛋白，用 ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ公司，美国）定量后，取２０ｕｇ 蛋白质样品进行１５％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，并转至硝酸纤维膜上； 室温封闭２ｈ后，用含０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０的ＴＢＳ缓冲液（ＴＢＳ—Ｔ） 漂洗３次，每次１０ｍｉｎ；加入ｐ５３单抗（１：１０００），４￣Ｃ孵育 过夜，ＴＢＳ—Ｔ漂洗３次后加入二抗（Ｉ：１０００），３７￣Ｃ摇床温 育２ｈ，ＴＢＳ．Ｔ漂洗３次后，用ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｋｉｔ （Ａｒｎｅｒｓｈａｒｎ公司，美国）显色，分析各细胞株表达的蛋白质。 ２、结果 ２．１ ＤＮＡ序列分析结果ＳＳＣＰ分析有异常单链构象的细胞株 外显子经自动测序仪测序比较分析结果，４个细胞株中发现 ３个细胞株有基因突变，其突变情况如下：ＫｕＭＡ３外显子５