褐藻胶裂解菌株筛选及优化
重组褐藻胶裂解酶酶解工艺的优化及产物分析
重组褐藻胶裂解酶酶解工艺的优化及产物分析王新侠;乔超超;倪辉;肖安风;蔡慧农;朱艳冰【摘要】为探索假交替单胞菌（ Pseudomonas syringae）重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的动态过程变化，采用DNS法和苯酚－硫酸法分别测定体系还原糖和总糖，根据二者比例，得出酶解产物随时间变化的平均聚合度，从而研究各因素对褐藻胶降解过程的影响，确定褐藻胶酶解工艺条件。
结果表明，重组褐藻胶裂解酶降解褐藻胶的适宜工艺条件为：水解温度25℃， pH 7�5，初始底物质量浓度7 g ／L，加酶量0�48 U，静置条件下酶解反应210 min。
在此工艺条件下，产生的还原糖的质量浓度达0�878 g／L，平均聚合度为3。
酶解终产物的质谱鉴定结果显示为单糖、二糖和四糖。
%The aim of the study is to determine the dynamic process and technical conditions of alginate degradation by the recombinant alginate lyase from Pseudomonas syringae. The contents of the reducing sugar and the total polysaccharide were determined by 3 , 5-dinitrosalicylic acid assay and phenol-sulfuric acid method, respectively. According to the ratio of reducing sugar and total sugar, the variation regularity of av⁃erage polymeric degree of the enzymatic hydrolysates were obtained. The influence factors in the enzymatic process were studied, and the optimal conditions for alginate degradation by the recombinant alginate lyase were determined. The results showed that optimalco nditions for enzymatic hydrolysis were: temperature 25 ℃, pH 7�5, initial substrate concentration 7 g/L, enzyme 0�48 U, and reaction time 210 min. Under these condition, the concentration of reducing sugar reached 0�878 g/L and the average polymetric degree fell to 3 .The enzymatic hydrolysates were identified by mass spectrometer and the final products mainly included monosaccharide, disaccharide and tetrasaccharide.【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(021)005【总页数】7页(P338-344)【关键词】褐藻胶;酶解;工艺优化;褐藻胶寡糖;聚合度【作者】王新侠;乔超超;倪辉;肖安风;蔡慧农;朱艳冰【作者单位】集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021;集美大学食品与生物工程学院，福建厦门361021; 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建厦门361021; 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室，福建厦门361021; 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建厦门361021【正文语种】中文【中图分类】S188我国海藻资源丰富。
高效产褐藻胶裂解酶菌株产酶条件优化及降解寡糖结构分析
第２期
国晶晶ꎬ等: 高效产褐藻胶裂解酶菌株产酶条件优化及降解寡糖结构分析
２５３
通过对菌株形态、 生理生化鉴定及 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因 鉴定ꎬ 并优化其产酶条件ꎬ 进行发酵罐中试发酵ꎬ 利用菌株产粗酶液制备褐藻胶低聚糖或寡糖ꎬ 并对 降解的低聚糖或寡糖进行结构分析ꎬ 以期找到高效 产褐藻胶裂解酶的微生物菌株ꎬ 为后续褐藻胶寡糖 的分离纯化和生理活性研究提供数据资料ꎮ
第 ３４ 卷第 ２ 期 ２０ １ ９ 年 ４ 月
大连海洋大学学报 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＤＡＬＩＡＮ ＯＣＥＡＮ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｖｏｌ.３４ Ｎｏ.２ Ａｐｒ . ２ ０ １ ９
ＤＯＩ:１０.１６５３５ / ｊ.ｃｎｋｉ.ｄｌｈｙｘｂ.２０１９.０２.０１５
文章编号:２０９５ － １３８８( ２０１９) ０２ － ０２５２ － ０８
收稿日期: ２０１８－０６－０９ 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (３１４７１６１０) ꎻ 国家重点研发计划 (２０１８ＹＦＤ０９０１１０４) ꎻ 现代农业产业技术体系专项 ( ＣＡＲＳ－５０) 作者简介: 国晶晶 (１９９３—) ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎮ Ｅ－ｍａｉｌ: ４７８７７１１８７＠ ｑｑ������ ｃｏｍ 通信作者: 汪秋宽 (１９６２—) ꎬ 女ꎬ 教授ꎮ Ｅ－ｍａｉｌ: ｗｑｋ３２０＠ ｄｌｏｕ������ ｅｄｕ������ ｃｎ
海星 Ａｓｔｅｒｏｉｄｅａ ｓｐ������ 作为海洋无脊 椎 动 物ꎬ 隶 属于棘皮动物门ꎬ 主要食用海参、 牡蛎等以海藻等 作为主要食物的海洋动物ꎬ 其体内可以存在与消化 酶共同参与褐藻胶消化及吸收的微生物菌群ꎮ 目 前ꎬ 从海星内脏中筛选得到产褐藻胶裂解酶的菌株 鲜有报道ꎮ 本研究中ꎬ 主要以褐藻胶作为唯一碳 源ꎬ 在海星内脏中筛选出一株产褐藻胶裂解酶菌株ꎬ
动物组织检测褐藻胶裂解酶方法
动物组织检测褐藻胶裂解酶方法说到褐藻胶裂解酶，很多人可能会一脸懵，心想：这是什么神奇的东西，听起来好像是从外星球来的。
不过，说白了，褐藻胶裂解酶其实就是大自然的一个小秘密，它能把某些大分子物质“打碎”，让它们变得更小、更易于利用。
它的主要作用是分解褐藻中的褐藻胶，这种物质广泛存在于海藻中，尤其是在一些海带、裙带菜这样的海藻里。
听起来是不是有点像科幻片里那种超能物质？但它的应用非常实际，尤其是在生物学和环境科学的领域，简直是“神器”啊！这项技术最早是为了帮助分解海藻中的复杂糖类物质，让它们更容易被微生物或其他生物体吸收。
想象一下，海洋中的这些海藻，长得又大又强壮，内部那些繁复的化学结构不容易被自然界里的其他生物消化。
如果我们能找到一种办法，把它们分解成简单的糖类，那多好！褐藻胶裂解酶就是这么一个“拆解专家”，它能把那些复杂的糖链分解成小块，供微生物和动物们使用。
有了这个酶，咱们就能更好地理解海藻中的化学成分，也可以更高效地利用这些资源。
比如，褐藻胶裂解酶被用在食品加工中，用来提高某些产品的口感和品质；也能用在医药领域，帮助提取海藻中的有效成分，甚至有研究发现，它对环境污染治理也有一定的作用。
嘿，说到这，你是不是开始觉得这东西不简单了？但是，话说回来，做这项实验也不是那么容易的。
你得知道怎么从动物组织里提取出这种酶。
普通的实验室操作已经不能满足要求了，需要更精细的技术手段。
通常，研究人员会从一些动物体内，特别是海洋动物或者某些能吃海藻的陆生动物体内，提取出含有这种酶的组织。
想象一下，得从这些动物的肠道或者消化系统里找出酶，那可不是件轻松的事，像找针一样！不过，科学家们常常有办法把这些复杂的步骤搞得井井有条，就像解锁一道难题，总能找到一条路。
提取出来的酶要经过一些特殊的处理，才能保证它的活性。
就像我们做饭一样，调味料少了不行，火候掌握不好也不行。
酶也是有“脾气”的，它们在特定的温度、酸碱度条件下才能发挥作用。
高效褐藻胶降解菌的筛选与产酶条件优化
1115北京市科技专项(Z161100005016034)资助收稿日期: 2016-05-12; 修回日期: 2016-05-31; 网络出版日期: 2017-10-24北京大学学报(自然科学版) 第53卷 第6期 2017年11月Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Pekinensis, Vol. 53, No. 6 (Nov. 2017) doi: 10.13209/j.0479-8023.2017.122高效褐藻胶降解菌的筛选与产酶条件优化李婷婷1,2 陈倩2 石萍1 耿旭3,†1. 深圳市重金属污染控制与资源化重点实验室, 北京大学深圳研究生院环境与能源学院, 深圳 518055;2. 北京市新型污水深度处理工程技术研究中心, 北京大学环境工程系, 北京 100871;3. 中美食品安全联合研究中心, 西北农林科技大学, 杨凌 712100;† 通信作者, E-mail: sgeng@摘要 以海藻酸钠为唯一碳源, 从天然腐烂海带中筛选得到一株高效褐藻胶降解菌株53#, 经形态学观察和16S rRNA 鉴定, 确定为类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans 。
采用正交试验方法, 以pH 、温度、NaCl 浓度和海藻酸钠初始浓度为影响因素, 对该菌株的产酶条件进行优化, 得到53#菌的最佳产酶条件: pH=8, 25℃, NaCl 浓度15 g/L, 海藻酸钠初始浓度15 g/L 。
在最佳产酶条件下, 褐藻胶裂解酶最大酶活可达390.53±17.32 U/mL 。
筛选得到的类芽孢杆菌Paenibacillus agaridevorans 53#具有易于培养、产酶速度快和酶活力高等优点, 能够实现褐藻胶的高效糖化, 在褐藻生产生物乙醇领域具有潜在利用价值。
关键词 褐藻胶降解; 褐藻胶裂解酶; 类芽孢杆菌; 生物乙醇 中图分类号 X172Screening of Alginate Degrading Bacteria and Optimizationof Its Enzyme-Producing ConditionsLI Tingting 1,2, CHEN Qian 2, SHI Ping 1, GENG Shu 3,†1. Shenzhen Key Laboratory for Heavy Metal Pollution Control and Reutilization, School of Environment and Energy, Peking University Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055;2. Beijing Engineering Research Center for Advanced Wastewater Treatment, Department of Environmental Engineering , Peking University, Beijing 100871;3. Sino-US Joint Food Safety Research Center, Northwest A&F University,Yangling 712100; † Corresponding author, E-mail: sgeng@Abstract 53#, a strain of efficient alginate degrading bacteria, is isolated from rotted kelp using sodium alginate as the only carbon resource. Strain 53# is identified as Paenibacillus agaridevorans based on physiological characteristics and 16S rRNA sequencing. The optimaltion yield condition of strain 53# is identified at pH=8, T =25ºC, NaCl 15 g/L, and sodium alginate 15 g/L by orthogonal experiment and analysis, and the highest enzyme activity is 390.53±17.32 U/mL. Strain 53# has the advantages such as being cultivated easily, producing enzyme fast and having high enzyme activity. It can achieve a high efficiency for saccharification of alginate and thus has potential value to be utilized in the production of bioethanol from brown algae. Key words alginate degradation; alginate lyase; Paenibacillus ; biofuel近年来, 海洋藻类以生长速度快, 光合作用效率高, 不含难降解木质素, 不与粮食作物争夺土地和淡水资源等优点成为第三代生物能源原料[1]。
海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质
ΙΣΣΝ 2
生物化学与生物物理学报
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海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质
宋 凯 于文功 3 韩 峰 韩文君 李京宝
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Ταβλε 3 Συβστρατε σπεχιφιχιτψ οφ αλγινατε λψασε φρο µ ς ιβριο σπ . ΘΨ101
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利用自制的
和
对酶的底物特
异性进行初步研究 结果表明 ςιβριο σπ ± ≠ 产
生的褐藻胶裂解酶对两种底物具有相同的活性 表
为一个酶活
力单位 ∀
温度对酶活性的影响 酶液分别在 ε !
ε ! ε ! ε ! ε ! ε ! ε ! ε 下保温
迅速冷却至 ε 紫外吸收法测定酶活性 同
时 分别测定酶液在不同温度下的活性 以确定酶
反应的最适温度 ∀
对酶活性的影响 缓冲液体系为
° 2柠 檬 酸
∗
°2
°
∗
× 2≤
∗
甘氨酸2
∗
∀酶分
别溶于上述缓冲液中 ε 保温
Ταβλε 1 Α συ µ µ αρψ οφ αλγινατε λψασε πυριφιχατιον (φρο µ 4 .0 Λ χυλτυρε)
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一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用[发明专利]
![一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/ef64c41eec630b1c59eef8c75fbfc77da2699792.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.07.09C N 103911315A (21)申请号 201410008138.6(22)申请日 2014.01.03CGMCC NO8312 2013.10.09C12N 1/20(2006.01)C12N 9/88(2006.01)C12R 1/01(2006.01)(71)申请人中国科学院天津工业生物技术研究所地址300308 天津市东丽区空港经济区中心大道西七道32号(72)发明人李德茂 陈树林 张藩 高峰(74)专利代理机构北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙) 11369代理人史霞(54)发明名称一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用(57)摘要本发明公开了一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8312，保藏日期为：2013年10月9日，所述菌株分类命名为：海洋嗜盐单胞菌SH-19(Halomonas elongata)，所述菌株的16SrDNA 的多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列。
本发明所述菌株SH-19可高效表达褐藻胶裂解酶，可应用于高效生产褐藻胶裂解酶，本发明所述菌株SH-19的发酵培养基配料简单，都是实验室中非常普遍容易获得的，发酵效果显著，使褐藻胶裂解酶的生产成本大大降低，可应用于大规模生产。
(83)生物保藏信息(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图3页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书6页序列表1页 附图3页(10)申请公布号CN 103911315 A1/1页1.一株产褐藻胶裂解酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8312，保藏日期为：2013年10月9日，所述菌株分类命名为：海洋嗜盐单胞菌SH-19(Halomonas elongata)。
提高褐藻胶裂解酶效果的方法
提高褐藻胶裂解酶效果的方法引言：褐藻胶裂解酶是一种重要的酶类，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。
为了提高褐藻胶裂解酶的效果，我们需要采取一系列措施来优化酶的活性和稳定性。
本文将介绍几种常用的方法，以提高褐藻胶裂解酶的效果。
一、优选酶源褐藻胶裂解酶可以从不同种类的褐藻中提取得到，不同种类的褐藻胶裂解酶具有不同的特性和活性。
因此，在选择酶源时，应根据实际需求选择合适的褐藻种类。
同时，还可以通过基因工程技术改造酶源，提高酶的活性和稳定性。
二、优化裂解条件裂解条件对褐藻胶裂解酶的效果有着重要影响。
常见的裂解条件包括温度、pH值、酶浓度、反应时间等。
通过调节这些条件，可以提高褐藻胶裂解酶的效果。
例如，适宜的温度和pH值可以增强酶的活性，合理的酶浓度和反应时间可以提高酶的裂解效果。
三、添加辅助剂在褐藻胶裂解酶的裂解过程中，添加适量的辅助剂可以提高酶的效果。
常用的辅助剂包括金属离子、有机溶剂、表面活性剂等。
金属离子可以作为酶的辅助因子，增强酶的催化活性；有机溶剂可以改变酶的构象，提高酶的活性和稳定性；表面活性剂可以增加褐藻胶的溶解度，促进酶的裂解作用。
四、应用联合酶法联合酶法是指将不同种类的酶一起应用于褐藻胶的裂解过程中。
通过联合酶法，可以充分利用不同酶的特性，提高褐藻胶的裂解效果。
例如，将褐藻胶裂解酶与纤维素酶联合使用，可以增强酶的裂解能力，提高褐藻胶的裂解率。
五、基因工程改造酶基因工程技术可以用于改造褐藻胶裂解酶，提高酶的活性和稳定性。
通过对酶基因进行改造，可以增强酶的催化活性、提高酶的热稳定性等。
例如，可以通过点突变、插入等手段改变酶的氨基酸序列，从而改善酶的性能。
六、应用生物反应器生物反应器是一种用于控制和优化生物过程的设备。
在褐藻胶裂解酶的生产过程中，应用生物反应器可以提供良好的生长环境和裂解条件，从而提高酶的效果。
生物反应器的设计和操作要合理，以充分发挥酶的活性和稳定性。
结论：通过优选酶源、优化裂解条件、添加辅助剂、应用联合酶法、基因工程改造酶和应用生物反应器等方法，可以有效提高褐藻胶裂解酶的效果。
乳糖诱导大肠杆菌产褐藻胶裂解酶的条件优化
ｒ ｅ ｉ ｆ ｎ ｉ ｎ ｇ ｃ ｒ ｕ ｄ ｅ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｗｉ ｔ ｈ Ｎｉ —Ｎ Ｔ Ａ ａ ｆ ｉ ｆ ｎ ｉ ｔ ｙ ｃ ｏ ｌ ｕ ｍｎ ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｕ ｌ ｔ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｏ ｐ ｔ ｉ ｍａ ｌ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗ ａ ｓ ａ ｄ ｄ ｉ ｎ ｇ ２ ２ ｍｍｏ １ ／ Ｌ
２ ９℃ ， 诱导 ２ ２ ｈ ， 酶活可达到 ８ ． ５ ５ ２ Ｕ ／ ｍＬ 。 说 明 乳糖 可 以 作 为基 因 工程 菌的 高效 诱 导 剂 。
关键 词 ： 重组大肠杆菌 ， 褐 藻胶 裂 解 酶 ， 乳糖 ， 优 化
Ｅｘ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ｏ ｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａ ｌ ｇ ｉ ｎａ ｔ ｅ ｌ ｙ ａ ｓ ｅ ｉ ｎ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎａ ｎ ｔ Ｅｓ ｃ ｈｅ ｒ ｉ ｃ ｈ ｉ ａ ｃ ｏ ｌ ｉ ｉ ｎ ｄ ｕｃ ｅ ｄ ｂ ｙ ｌ ａ ｃ ｔ ｏ ｓ ｅ
摘 要： 本文研 究 了使用乳糖 替代 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ（ 异丙基硫代半乳糖苷 ） 诱导褐 藻胶 裂解酶在 重组大肠杆 菌 中表达 的可行性 ，
通过 摇 瓶 实验 ， 分 别 对诱 导终 浓度 、 诱导温度、 诱导时机、 诱 导 时 间等 方 面进 行 了单 因 素 实验 并 利 用 响 应 面 对 条 件 进 行 了优 化 设 计 ， 并使 用 Ｎ ｉ － Ｎ Ｔ Ａ 亲 和 柱 对 粗 酶 液进 行 了 纯化 得 到 纯 酶 。 结 果 表 明 ， 诱 导 乳 糖 终 浓度 ２ ２ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ， 诱 导 温度
ｉ ｎｄ ｕｃ ｔ ｉ ｏ ｎ． ｔ ｈ ｅ ｄｕ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｅ ｒ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｄ． Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｓ ｐ ｏ ｎ ｓ ｅ ｓ ｕｒ ｆ ａ ｃ ｅ ｗａ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｉ ｍｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｔ ｈｅ ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｎ ｄ ｔ ｏ ｆ ａ ｂ ｒ ｉ ｃ ａ ｔ ｅ ｐ ｕｒ ｅ ｅ ｎｚ ｙ ｍｅ ｄ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ Ｆ ｏ ｏ ｄ Ｉ ｎ ｄ ｕ ｓ ｔ ｒ ｙ
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褐藻胶裂解菌株筛选及优化
褐藻胶是存在于褐藻中的一类褐藻多糖,利用食用褐藻的棘皮动物内脏筛选并优化菌株培养条件,使之产生高活性的褐藻胶裂解酶,在制备褐藻寡糖等方面具有重大应用价值。
本文以褐藻酸钠为唯一碳源,从皱纹盘鲍内脏中筛选分离得到12株产褐藻胶裂解酶菌株,检测12株菌的发酵液酶活并优选酶活最高的两株菌,分别命名为M3与M7,基于16S rDNA系统发育树分析,初步确定M3、M7菌株属于假交替单胞菌(Pseudoalteromonas)属。
本文采用Plackett-Burman试验、中心复合试验设计(Central Composite Design,CCD)对M3菌株进行发酵产酶优化。
根据M3菌株单因素试验的优化结果设计Plackett-Burman试验,结果表明影响酶活的4个显著影响因素为培养温度、初始pH、褐藻胶浓度和蛋白胨浓度,以此优化结果进行中心复合试验设计(Central Composite Design,CCD),应用响应面方法进行回归分析,结果表明其最佳产酶条件为:初始pH 7.5,接种量2%,褐藻胶浓度0.5%,装液量50 mL,蛋白胨浓度0.6%,培养温度为28℃,200 r/min,酶活最高可达到1.063 U/mL。
采用正交试验方法对M7菌株产酶条件进行优化,优选菌株培养基。
M7菌株通在单因素试验的基础上利用正交试验优化菌株的产酶条件,研究结果显示菌株的最佳产酶条件为:初始pH 7.5,接种量为6%,褐藻胶浓度1.0%,装液量为10 mL,氯化钠浓度为1%,培养温度为18℃,200 r/min,酶活最高终达到1.751 U/mL。