蛋白磷酸酶抑制剂复合物I (100×)使用说明书
26146-Pierce
裂解/洗涤缓冲液（即 10:1 体积/质量） 。如果裂解大量细胞，可首先添加 10％终体积的 IP 裂解 /洗涤缓冲液到细胞团块中， 用移液管/移液器上下吹打细胞团块以混匀， 然后再向细胞悬浮液中 添加剩余的 IP 裂解/洗涤缓冲液。 4. 5. 将细胞裂解液在冰上孵育 5 分钟并定期混匀。〜 13000 × g 离心 10 分钟去除细胞碎片。 将上清转移到一个新的微量离心管中用于进行蛋白浓度测定和后续分析。
方案 II：裂解悬浮细胞培养物 1. 2. 3. 将细胞悬浮液在 1000 × g 下离心 5 分钟以沉淀细胞。弃掉上清。 将细胞团块用 PBS 重悬洗涤一次。1000×g 离心 5 分钟再次沉淀细胞。 将冰上预冷的 IP 裂解/洗涤缓冲液加到细胞团块中。每 50mg 湿重细胞团块加入 500 μL IP
3
掉流穿液体。 2. 用 100 μL 预冷的 IP 裂解/洗涤缓冲液洗涤树脂两次。每次洗涤后弃掉流穿液体。 3. 在纸巾上轻拍离心柱的底部以去除剩余的液体，插入底盖。 4. 将抗体/细胞裂解液样品加入含有蛋白 A/G 加强型琼脂糖的离心柱中。盖上螺旋盖温和地上 下翻转混匀或在摇床上震荡孵育 1 小时。 5. 卸下底盖，拧松螺旋帽并将离心柱置于收集管中。将柱子离心并保留流穿液体。在确定 IP 反应成功之前不要丢弃该液体。 6. 拧下螺旋帽，将柱子置于一个新的收集管中，加入 200 μL 的 IP 裂解/洗涤缓冲液并离心。 注：如果需要无去垢剂洗涤，则有另一款洗涤缓冲液（20×TBS 缓冲液）提供。使用前请 将该缓冲液稀释至 1×。 7. 用 200 μL IP 裂解/洗涤缓冲液洗涤树脂三次，并且每次洗涤后都进行离心。 8. 用 100 μL 1×条件缓冲液洗涤树脂一次。
储存：4℃储存，常温运输。
蛋白酶抑制剂
蛋白酶抑制剂引言蛋白酶抑制剂是一类用于抑制酶活性的化合物，其中蛋白酶是一种催化蛋白质水解的酶。
蛋白酶在生物体中起着重要的调控作用，参与多种生物反应的调节和控制。
然而，在某些情况下，蛋白酶的过度活化可能导致疾病的发生和发展。
因此，研发蛋白酶抑制剂成为一种重要的医药研究方向。
本文将介绍蛋白酶抑制剂的基本分类、作用机制以及在药物研发中的应用。
分类根据蛋白酶抑制剂对酶活性的抑制方式，蛋白酶抑制剂可分为两大类：1.反式抑制剂：反式抑制剂与酶结合后形成稳定的酶-抑制剂复合物，从而阻止酶催化反应的进行。
典型的例子是蛋白酶抑制剂Aprotinin，它通过与蛋白酶结合形成稳定的复合物，从而抑制蛋白酶的活性。
2.逆式抑制剂：逆式抑制剂通过与酶催化中心结合，改变酶的构象和活性。
这类抑制剂通常是模拟酶底物的分子结构，与酶催化中心发生特异性的相互作用。
逆式抑制剂的典型例子是酶的底物类似物，如硫氰酸酰胺（p-Tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone，TPCK）可以选择性地抑制胰蛋白酶的活性。
作用机制蛋白酶抑制剂能够通过不同的机制来抑制蛋白酶的活性。
以下是几种常见的作用机制：1.受体拮抗作用：某些蛋白酶抑制剂能够与蛋白酶结合并阻断其与受体的相互作用，从而抑制了受体的活化。
这种机制在很多药物设计中都有重要的应用。
2.亲和力增强：一些蛋白酶抑制剂可以增强与酶的结合亲和力，从而阻止酶底物结合，进而抑制了酶的活性。
3.酶底物竞争：逆式抑制剂通过与酶催化中心竞争底物结合位点，从而阻断底物与酶的结合，进而抑制了酶活性的发生。
4.构象改变：某些蛋白酶抑制剂能够与酶发生特异性相互作用，改变酶的构象从而影响酶的活性。
应用蛋白酶抑制剂在医药领域有着广泛的应用。
以下是一些典型的应用示例：1.抗癌药物：蛋白酶在肿瘤细胞中起着重要的作用，因此蛋白酶抑制剂被广泛用于抗癌药物的研发。
例如，蛋白酶抑制剂Paclitaxel可以通过抑制肿瘤细胞内的蛋白酶活性来抑制细胞的增殖。
磷酸化-2011-硕士-课件(1)
研究发现 －→当Ca （二价 正离子）结合到E螺旋区和F螺 旋区之间的泡区时，引起每个
IV、cGMP依赖的蛋白激酶 (cGMP dependent protein kinase,,GPK)
Ashman 等1963年从肾脏首次发现cGMP
V、DNA依赖的蛋白激酶( DNA dependent protein kinase,DNA-PK)
是一类存在于细胞核内，能被DNA激活的特异的Ser/Thr PK 引起 多种核结合蛋白磷酸化。
蛋白激酶C为 77kd , 催化区抑制调节区,当DAG结合到蛋白激酶C上，解除酶的调节 区的抑制作用，使酶发挥催化活性。
III、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶
CaM（钙调蛋白）作为细胞内Ca2+受体，由148个氨基酸碱基组成的可溶性球蛋白 结构特点： （1 ）30%的酸性氨基酸，过量羧基提供了Ca2+可逆性结合的基团。 （2）不含能使肽链定型的成分，即易氧化的半胱氨酸和羟脯氨酸，因而CaM具有 高度灵活的，可与机体蛋白相互作用的三级结构。
（3）与蛋白/肽底物竞争抑制剂 Walsh：是较为特异的APK抑制剂。同肽底物竞争
（三）蛋白磷酸酯酶（protein phosphatase 。） 70年代末PTPase活性首次被发现，已知对Ser/Thr激酶的磷酸酯酶有 PP1,PP2A,PP2B,PP2C,PPx等分布涉及各组织以至细胞器，定位各有有 侧重，均有亚型 PP1(位于胞浆为为PP11 糖原分子为PP1G,位于肌丝为PP1M,核为PP1N) PP2A主要存在胞浆，少数在线粒体和核 PP2B与膜连接有关（调节亚单位 氨基末端甘氨酸残基豆蔻化） PP2C只要存在于胞浆 PPC存在于细胞膜 PPx存在于线粒体
β-Glycerophosphate (sodium salt hydrate)_蛋白磷酸酶抑制剂_13408-09-8_Apexbio
donor in bone cell mineralization studies [1][3]. In MC3T3-E1, ROS 17/2.8, and chick osteoblast-like cells, β-Glycerophosphate did not affect the rate of anaerobic glycolysis, but increased the medium Pi levels, suggesting that β-Glycerophosphate was hydrolyzed by bone cells. The local increase in medium Pi concentration promoted rapid mineral deposition [1]. In human bone marrow stromal cells (HBMSC) and human osteoblasts (HOB), BMP-2 resulted in mineralization of their matrix in the presence of beta-glycerophosphate and ascorbic acid [3]. β-Glycerophosphate (10 mM) also accelerated calcification of cultured vascular smooth muscle cells through an alkaline phosphatase-related mechanism [4]. 参考文献:
产品描述:
β-Glycerophosphate (sodium salt hydrate) is a potent protein phosphatase inhibitor [1]. Protein phosphatase is an enzyme that removes a phosphate group from the phosphorylated amino acid residue of its target protein. Protein phosphorylation is one of the most common protein posttranslational modifications. β-Glycerophosphate is a potent protein phosphatase inhibitor that acts as a phosphate group
蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明
蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明转自:http://www.bioas/html/980.html在与蛋白相关的检测中，最关键的一步便是蛋白质的提取。
在提取的过程中，我们要经常加入以防止。
另外在磷酸化蛋白的研究过程中，也是必不可少的。
本文详细总结了常用的P MSF、 Leupep tin亮肽素、Aproti nin抑肽酶、Pepsta tin胃、EDTA-Na2等以及NaF氟化钠、Na3VO4原矾酸钠、Beta-glycer ophos phate甘油磷酸钠、Na2P2O4焦磷酸钠等的溶液配制、贮存液与工作液浓度及保存条件。
一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。
溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。
分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1m MLeupep tin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。
溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定，分成小份，冷冻在 -20℃至少6个月。
分子量：C20H38N6O4×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4x 1/2 H2SO4× H2O:493.6使用：贮存浓度1m g/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。
Aproti nin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。
蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明
蛋白质提取过程中常用的蛋白酶和磷酸酶抑制剂详细使用说明一、蛋白酶抑制剂PMSF：特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶，也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。
溶解性：溶于异丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。
在水溶液中不稳定。
在100%异丙醇，25℃时稳定至少9个月。
分子量：174.2使用：贮存浓度200mM，工作浓度1mMLeupeptin 亮肽素特性：抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤溶酶和组织蛋白酶B。
溶解性：高度溶于水（1mg/ml）。
4℃一周稳定，分成小份，冷冻在-20℃至少6个月。
分子量：C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6 C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.5 ug/ml (1mM)。
Aprotinin抑肽酶特性：丝氨酸蛋白酶抑制剂，抑制纤维蛋白溶酶、激肽释放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。
不抑制凝血酶或因子X。
溶解性：易溶于水（10mg/ml）或缓冲液（例如0.1M tris，pH8.0）。
pH约7~8的溶液在4℃可保存1周，分装保存在-20℃可至少保存6个月。
避免反复冻融, pH>12.8的碱性环境可使其灭活。
分子量：6,512使用：贮存浓度1mg/ml，工作浓度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。
Pepstatin胃蛋白酶抑制剂特性：抑制天冬氨酸（酸）蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶D、凝乳酶、许多微生物酸性蛋白酶溶解性：溶于甲醇约1mg/ml；可溶于乙醇，过夜溶解可达到1 mg/ml；在6当量乙酸中溶解度为300ug/ml。
4℃稳定一周，分装储存于-20℃时可保存1个月。
分子量：685.9使用：贮存浓度1mg/ml，使用浓度0.7 μg/ml(1 μM)。
EDTA-Na2特性：金属蛋白酶抑制剂溶解性：溶于水至0.5M，在pH8-9的条件下，4℃稳定至少6个月分子量：372.24使用：工作浓度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM)，不需现用现配，在溶液pH值调至8~9时再加入。
免疫沉淀(Immunoprecipitation)实验操作方法
免疫沉淀（Immunoprecipitation）实验操作方法实验原理：免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质如protein A/G特异性地结合到免疫球蛋白（抗体）FC片段的现象而开发出来的特异分离富集抗原的方法。
目前多用预先结合固化在Agarose beads上的protein A/G（Agrose-proteinA/G），使之与抗体结合，再通过抗体特异性结合抗原而形成Agrose-proteinA/G 、抗体、抗原复合物，利用Agarose beads的重量，通过离心即可特异分离富集目的抗原。
实验步骤：1.处理细胞：依据实验目的，设计实验，处理好细胞模型。
一般3×106细胞/处理(即六孔板一个孔，约200ug总蛋白)。
2.配IP 裂解液：200ul/孔（6孔板），并加入蛋白酶抑制剂，如果蛋白磷酸化水平影响实验结果则应加入磷酸酶抑制剂。
注意抑制剂的要现加现用。
3.收集细胞：冰上操作，裂解细胞前用1×PBS（4度）洗1遍，每孔加入200ul IP裂解液，冰上静置5分钟后刮下细胞并收集至EP管中。
4.超声：强度37％，5秒×4次（程序07）。
目的是使细胞裂解更完全并打断基因组DNA,但可能会影响蛋白质之间的相互作用，进行共免疫沉淀实验时要注意这一点。
5.离心细胞裂解液：4度10000rpm 10 分钟。
6.Agrose-proteinA/G清洗：一般1ug抗体对应15ul Agrose-proteinA/G（不同公司产品可能不同，注意结合说明书及实验结果考虑），预清洗细胞裂解液的Agrose-proteinA/G用量与结合抗体的用量一致。
取相应量的Agrose-proteinA/G到EP管中（剪枪头）并用500ul1×PBS（4度）洗两遍，5000rpm×2分钟，吸掉上清备用。
7.细胞裂解液预清洗：为去除非特异作用，细胞裂解液先用Agrose-proteinA/G预清洗。
S100蛋白(S100)作业指导书
检验科免疫室分析项目作业指导书第页，共页版本：A/0生效日期：2008-02-01 36b)>95%健康成人范围的样本量c)没有疾病，不患肿瘤可能为颅脑损伤的成年患者表现为轻微颅脑外伤（格拉斯哥昏迷计分GCS：13-15分）和至少有一种症状的患者3小时内进行Elecsys S100测定。
外伤后6小时内必须进行CCT（头颅计算机X线断层摄影术）检查。
以健康个体的95%值作为分界点，CCT作为参照，用Elecsys S100测定可获得如下结果：NPV（阴性预测值）99.7%，PPV（阳性预测值）11%，灵敏度98.8%，和特异度32.9%（95%可信区间：NPV99.1-100%，PPV8.8-13.3%,灵敏度96.5-100%，特异度30-35.9%）。
d)0.098μg/L每个实验室必须调查各自患者群体的参考范围变异性，必要时根据具体情况制订自己的参考范围。
9.分析性能分析仪的代表性试验数据如下。
各实验室由于具体情况不同，所得出的数据可能会稍有差异。
精密度根据NCCLS（全国临床实验室规范化操作委员会）制订的改良试验计划(EP5-A)，应用Elecsys试剂盒、人血液标本和质控液验证ElecsysS100试剂盒检测重复性。
每日测6 次共10 日（n＝60）；在E170 分析仪上的组间精密度（n＝21），得结果如下：分析灵敏度（低浓度检测限制）< 0.005 µg/L检验科免疫室分析项目作业指导书第页，共页版本：A/0生效日期：2008-02-01 46检测限制定义为可以区别零浓度定标液的最低可测浓度值，计算公式为定标液最小浓度＋2SD（标准差）（系统定标，定标液最小浓度＋2SD，组间精密度范围之内，标本数21）。
方法比较将Elecsys S100 现在的试剂盒Elecsys S100（产品目录号03051986（y））与Liamat Sangtec100 (x1)和 Liaison Sangtec100 (x2)进行比较，得到以下线性关系(pmol/L)。
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使 用 说 明 书
◆蛋白磷酸酶抑制剂复合物I (100×)
◆目录号1913
◆使用手册
◆实验室使用，仅用于体外
蛋白磷酸酶抑制剂复合物I (100×)
目录号：1913
目录编号包装单位
191301 1 ml
191302 1 ml× 5
适用范围：
抑制蛋白丝/苏氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶
产品储存：
－20℃保存，一年有效。
产品介绍：
组织/细胞裂解时会释放出大量内源性蛋白磷酸酶，以各种方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，导致不同于正常生理状态的差异。
因此，裂解后的Western blotting，免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、和蛋白激酶活性测定等实验常规要加入外源性蛋白磷酸酶抑制剂，抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，维持蛋白质的磷酸化状态。
本公司研制的蛋白磷酸酶抑制剂复合物以国际上主流配方改进而成，主要成份为5种独立的蛋白磷酸酶抑制剂（钒酸钠、氟化钠、钼酸钠、酒石酸钠、咪唑），每一种抑制剂可特异性抑制某一种或几种蛋白磷酸酶活性。
该复合物优化的组成使其可以强烈抑制几乎所有重要的蛋白磷酸酶活性，包括蛋白丝/苏氨酸磷酸酶、蛋白酪氨酸磷酸酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶以及ATP酶等。
该复合物为100倍浓缩溶液，可直接加入任何组织类型和细胞的裂解产物中，均能有效抑制磷酸化蛋白质的去磷酸化，从而维护蛋白质的磷酸化状态。
适用于Western blot和免疫共沉淀检测磷酸化蛋白质、蛋白激酶活性测定等。
操作步骤：
临用前室温溶解磷酸酶抑制剂复合物I (100×)，混匀，按照1：100比例加入到组织细胞裂解物中。
提示：
⇨避免反复冻融，第一次使用后，可按照每次使用量分装冻存。
临用前加入，终浓度为1×，蛋白磷酸酶含量特别丰富的组织，可以用2-3×。
完。