基于质谱的微生物鉴定

参考文献
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［２］ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ ＭＳ． Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｃ， Ｌａｙ Ｊ ， Ｅｄｓ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ２００５．
图１ 完整的杆状菌孢子的正离子基质辅助激光解吸附离子 化飞行时间（Ｍ Ａ Ｌ Ｄ Ｉ Ｔ Ｏ Ｆ ）质谱图。将从孢子悬浮水溶 液中沉淀到的大约 ３ × １０５ 个完整孢子和 ＭＡＬＤＩ 的基质混合 （少于 １ μ Ｌ）。利用 ＭＳ 可以区分具有不同氨基酸序列的两种 微生物的生物标记物（经许可选自［３］）。这些 ＭＳ 指纹数据 可以通过实验得到（从各种条件下大量微生物的质谱图中获
（ＦＴＩＣＲ ）或者四极杆离子阱质谱实现 Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ 蛋 白质组策略［５，７］。Ｍｏｒｔｚ ｅｔ ａｌ．率先利用ＦＴＩＣＲ ＭＳ－ＭＳ通 过推断氨基酸序列和蛋白质组数据库搜索实现了对完 整蛋白的鉴定［ ７ ］ 。样品经提取、分级和处理后，采 用该方法，利用高分辨率的二级 ＦＴＩＣＲ 质谱分析，找 到了利用ＭＡＬＤＩ ＭＳ从完整的Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ Ｔ孢子中发现的 主要生物标记蛋白［１］。经过蛋白质组数据库序列相似 性搜索，这些生物标记物被确定为小的酸溶性孢子蛋 白（ＳＡＳＰ）。 利用二级质谱技术鉴定完整的蛋白生物标记物 往往需要复杂的仪器（如ＥＳＩ／ＦＴＩＣＲ）。近期二级ＴＯＦ 质谱仪器的发展（如 Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ Ⅱ ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ ［Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ， Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ］），使得通过ＭＡＬＤＩ ＭＳ 进行快速、高置信度的完整Ｂａｃｉｌｌｕｓ孢子种类鉴 定成为可能［３］。采用该方法，完整微生物产生的大 相对分子质量（＞５ ｋＤａ）的前体离子被选择进入第 一级 ＴＯＦ 分析器中，并在其无场区域经激光诱导裂 解（ＬＩＤ）产生碎片离子。碎片离子在加速后于高分 辨率的回旋分析器——第二级 ＴＯＦ／ＴＯＦ 装置中得到 检测。不同于基于 ＥＳＩ／ＦＴＩＣＲ 的 Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ 蛋白质组 学策略，采用 ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ，在分析前不 需要对蛋白标记物进行富集、纯化和分离，可直接
选自［ ３ ］ ）。
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研究报告
生命科学仪器 ２００７ 第 ５ 卷 ／ ６ 月刊
分析完整的微生物，包括纯品和混合物。对前体蛋 白离子进行ＬＩＤ可产生具有特殊序列的骨架断裂。从 主要碎片上丢失的两个中性分子（ＮＨ ／Ｈ Ｏ）都可
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以被检测到。对于相对分子质量从 ３ 到 ９ ｋＤａ 的前 体蛋白，其各自碎片离子的数目在 ３０ 到 １００ 之间 （ 取 决 于 前 体 离 子 强 度 、 激 光 流 量 、 基 质 等 ）。 在 ＬＩＤ图谱中的离子主要是在天冬氨酸或谷氨酸残基的 Ｃ 端 断 裂 产 生 的 （ 图 ３ ）。
［７］ Ｍｏｒｔｚ Ｅ， Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ Ｐ， Ｒｏｅｐｓｔｏｒｆｆ Ｐ， Ｋｅｌｌｅｈｅｒ Ｎ， Ｗｏｏｄ Ｔ， ＭｃＬａｆｆｅｒｔｙ Ｆ Ｗ， Ｍａｎｎ Ｍ． Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｍａｔｃｈｉｎｇ ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄａｔａ ａｇａｉｎｓｔ ｓｅ－ ｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９６， ９３： ８２６４－７．
得），或者通过生物计量学方法推出。
个微生物。目前采用质谱检测和鉴定微生物主要基于 质谱图中是否存在特异性的生物标记物的分子离子。 因此，不同微生物具有不同的质谱图，即微生物指纹 图谱（图 １ ［ ３ ］ ）。
采用新型的质谱软电离方法，如基体辅助激光 解吸电离（ＭＡＬＤＩ）和 ／ 或者电喷雾离子化（ＥＳＩ），可 获得微生物的质谱图。当微生物经过纯化、分级、富 集和色谱分离后，可将ＥＳＩ与多种质量分析器相结合， 进行大规模的不同微生物的蛋白质组学研究。相反， ＭＡＬＤＩ 对盐和其他杂质的耐受能力高，因此，在只对 样品进行简单处理的情况下，ＭＡＬＤＩ 可被用作快速检 测和鉴定完整微生物的质谱传感器平台的离子源［１］。 在 ＭＡＬＤＩ 技术中，在完整的微生物（病毒、孢子、植 物细菌等）中添加少量的酸性基质溶液有助于细胞裂 解和生物标记物的原位提取（在 ＭＡＬＤＩ 探针上）。脉 冲激光照射到固体样品 ／ 基质混合物上可产生特异性 的微生物生物标记物离子。这些离子可通过飞行时间 质谱（ＴＯＦ ＭＳ）进行进一步的分析。
作者简介：Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ａｒｅ ｗｉｔｈ Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐ， ４４５ Ｌａｋｅｓｉｄｅ Ｄｒ．， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ ９４０８８， Ｕ．Ｓ．Ａ．； ｔｅｌ．： ４０８－４８１－４５３４； ｆａｘ： ４０８－７３２－２００７； ｅ－ｍａｉｌ： Ｓｒｉｎｉｖａｓａ． Ｒａｏ＠ｄｉｏｎｅｘ．ｃｏｍ． Ｔｈｅ ａｕｔｈｏｒｓ ｗｏｕｌｄ ｌｉｋｅ ｔｏ ｔｈａｎｋ Ｄｒ． Ｍａｒｋ Ｔｒａｃｙ， Ｄｒ． Ｔｅｒｒｙ Ｓｈｅｅｈａｎ， ａｎｄ Ｄｒ． Ｊｅｆｆ Ｒｏｈｒｅｒ ｆｒｏｍ Ｄｉｏｎｅｘ Ｃｏｒｐ． ｆｏｒ ｔｈｅｉｒ ｓｕｇｇｅｓｔｉｏｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｎｕｓｃｒｉｐｔ．
［３］ Ｄｅｍｉｒｅｖ Ｐ， Ｆｅｌｄｍａｎ Ａ， Ｋｏｗａｌｓｋｉ Ｐ， Ｌｉｎ Ｊ． Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔａｃｔ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ２００５， ７７： ７４５５－６１．
［４］ Ｄｅｍｉｒｅｖ Ｐ， Ｆｅｌｄｍａｎ Ａ， Ｌｉｎ Ｊ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－ｂａｓｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ ＡＰＬ Ｔｅｃｈ Ｄｉｇｅｓｔ， ２００４， ２５： ２７－３７．
图 ２ 用于微生物鉴定的基于 ＭＡＬＤＩ ＭＳ 的 Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ（无 蛋白酶解过程）和 ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ 蛋白质组策略。
图 ３ 根据 ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ／ＴＯＦ 获得的生物标记物的分子离子质 谱图，采用 Ｔｏｐ－ｄｏｗｎ 蛋白质组策略鉴定孢子。ａ）完整的 Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ和Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ孢子二元混合物的前体离子谱图。ｂ） 分开的 ｍ／ｚ ６ ７１２ 和 ７ ３３４ 两个前体离子碎片谱图。分别来 于 Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ 和Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ 的两个 ＳＡＳＰ蛋白被认为是最可能 的前体，随机匹配的可能性仅为 １．８ × １０－３０ 和 ８．１ × １０－ １６。图中标出了产生大量碎片的部分切割位点序列（经许可
为了鉴定各种生物标记物，需要将 ＴＯＦ／ＴＯＦ 实 验得到的质谱图与计算机生成的蛋白质组数据库中在 设定前体离子质量范围内所有蛋白质的二级质谱图进 行对比，并对找到的匹配离子进行进一步的计算， 在数据库中找到最可能的前体蛋白。根据找到的一个 或多个特异性蛋白生物标记物，就可以鉴定出微生物 的来源。从图 ３ 可以看出，采用该方法鉴定出各自 的生物标记物 ＳＡＳＰ 后，就可以在二元混合物中鉴别 出完整的Ｂ．ｇｌｏｂｉｇｉｉ和Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ孢子［３］。
传统技术对于微生物的检测和鉴定往往很慢 （数天时间），并且灵敏度低，特异性差。很多领域，从 医学诊断到国土安全，都将得益于可进行天然以及生 物工程微生物快速、可靠检测和鉴定的新型分子水平 技术的发展。近期快速发展起来的质谱（ＭＳ）凭借其 诸多优点已成为这样一种技术［１，２］。一个微生物的质谱 鉴定实验，包括样品的采集和制备，整个过程不到 １０ｍｉｎ。此外，质谱还是一种通用技术，它可以检测到 所有类型的病原体，即病毒、植物细菌、真菌及其孢 子，寄生原生动物，并且需要样品量很少，可少于１０４
无论是ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ还是ｔｏｐ－ｄｏｗｎ策略［５］均可用来 进行微生物的质谱鉴定（图 ２）。这两种策略的区别在 于是否应用化学（如微波辅助）或酶的方法将完整的 蛋白酶解。在ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ蛋白质组学策略中，首先将蛋 白酶解成多个肽段，然后根据酶解肽段的特异性，再 辅助二级质谱技术和生物信息学，可以明确地鉴定出 蛋白。无论采用 ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐ还是 ｔｏｐ－ｄｏｗｎ蛋白质组学 策略，利用二级质谱技术鉴定出一个或多个独特的蛋 白生物标记物后，就可以鉴定出微生物。在二级质谱 （Ｍ Ｓ － Ｍ Ｓ ）实验中，前体蛋白或者肽离子经选取分离 后，与中性气体分子、电子或者光子作用后被内部激 发。随着前体离子内部能量的增加，将裂解成与前 体离子氨基酸序列相关的特异性片段。原位进行完整 的杆状菌生物标记物提取、酶解、ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ ＭＳ－ ＭＳ 的肽段分析和蛋白质组数据库查询，可准确地鉴
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研究报告
最近人们提出了一种基于生物信息学策略的微 生物质谱鉴定方法［１，４］。当对应生物体的基因序列已知 时，可根据可能表达的蛋白质序列来预测质谱图中是 否存在蛋白生物标记物。蛋白质的序列可以从互联网 上的蛋白质组数据库中获得。成功使用该生物信息学 方法的条件和要求是数据库的完整性（要包含特殊微 生物的基因序列）和真实性（可以预期 ／ 整合多种 蛋白生物标记物的翻译后修饰状态）。目前（２ ０ ０ ６ 年初），已有 ２８０ 多种基因序列已知并被公开的细菌 基因组（见 ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ）。
完整微生物的ＭＡＬＤＩ ＭＳ结果受诸多实验因素 的影响，如蛋白生物标记物的提取和溶解性、由于 培养时间和基质差异导致的生物标记物蛋白表达水平 的多样性、不同生物标记物分子的离子化效率（和 基质 ／ 生物标记物蛋白的比例有关）、激光脉冲能量 的变化以及不同仪器间检测效率的差异。为了鉴定微 生物，可将实验得到的质谱图与已被编入质谱指纹图 库中的已知微生物的指纹图谱进行比对。然而，为 了使该方法更加有效，必须把大量的微生物质谱数据 编入指纹图库中。该方法的另一个局限性就是图库中 缺乏新的、刚出现的或者高致病性的微生物谱图。