蛋白质的等电点测定和沉淀反应
蛋白沉淀反应
20mL
₪器材
水浴锅 温度计 200mL锥形瓶 100mL容量瓶 吸管 试管及试管架 乳钵
ʺ 实验操作
₪酪蛋白等电点的测定
& 取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各 试剂，然后混匀。
试管号 蒸馏水 0.01 mol/L醋酸 0. 1 mol/L醋酸 1. 0 mol/L醋酸 pH 混浊程度
& mol/L、 0.10 mol/L、 0.01 mol/L醋酸溶液
&蛋白质溶液
5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清 ：水 =1:9）
& 醋酸—醋酸钠的缓冲溶液 3%硝酸银溶液 5%三氯乙酸溶液 95%乙醇 饱和硫酸铵溶液 硫酸铵结晶粉末 盐酸溶液 氢氧化钠溶液 碳酸钠溶液 甲基红溶液
100mL 10mL 50mL 250mL 250mL
(mL)
(mL)
(mL)
(mL)
1
8.4
0.6Biblioteka 28.7—
3
8.0
—
4
7.4
—
—
—
5.9
0.3
—
1.0
—
—
& 4支试管中各加4% 酪蛋白醋酸钠溶液1mL并马上摇匀。观察 其混浊程度。静置10min后，再观察其混浊度。最混浊的一管pH 即为酪蛋白的等电点。
₪蛋白质的沉淀及变性
▐ 蛋白质的可逆沉淀 盐析: 无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）能析出蛋白质。
最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。
最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。
▐ 蛋白质的不可逆沉淀
01 mol/L醋酸 0.
Ø 试管号 如蛋白有溶液沉淀0. 产生。倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉
蛋白质的两性性质及等电点的测定
蛋白质的两性性质及等电点的测定1 实验目的1.1 了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
1.2 掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
2 实验原理蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。
因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：阳离子两性离子阴离子pH < pI pH = pI pH > pI电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。
3 主要仪器与试剂3.1 器材试管架；试管1.5×15cm（×8）；移液管1mL（×4），2mL（×4），10mL（×2）；胶头滴管（×2）。
3.2 试剂1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875mL，加水至50mL。
0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。
0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。
0.2mol/L NaOH：称取NaOH2.000g，加水至50mL，配成1mol/L NaOH。
然后量取1mol/L NaOH 10mL，加水至50mL, 配成0.2mol/L NaOH。
0.2mol/L HCl：吸取37.2%（比重1.19）HCl 4.17mL，加水至50mL，配成1mol/L HCl。
然后吸取1mol/L HCl 10mL，加水至50mL，配成0.2mol/L HCl。
0.01%溴甲酚绿指示剂：称取溴甲酚绿0.005g，加0.29mL 1mol/L NaOH，然后加水至50mL。
实验一 蛋白质的颜色反应和沉淀反应.DOC附图
实验一蛋白质的颜色反应和沉淀反应一、实验目的（1）掌握鉴定蛋白质的原理和方法（2）熟悉蛋白质的沉淀反应；进一步掌握蛋白质的有关性质二、实验原理（1）蛋白质颜色反应原理：蛋白质分子中的某些或某种基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，是一些常用蛋白质定量测定的依据；但颜色反应不是蛋白质的专一反应；1、米伦反应原理：米伦试剂是硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物。
他能与苯酚及某些二羟基苯衍生物起颜色反应。
组成蛋白质的氨基酸中只有酪氨酸含苯酚基团，因此该反应为蛋白质中酪氨酸存在的依据。
2、双缩脲反应原理：尿素被加热，则两分子的尿素放出一分子氨而形成双缩脲。
双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成紫色的化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故也能进行此反应。
双缩脲反应可作为蛋白质定量测定的依据。
3、黄色反应原理：蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），于浓硝酸可反应并生成黄色物质，此物质在碱性环境下变为桔黄色的硝基苯衍生物硝醌酸等。
4、茚三酮反应原理：蛋白质与茚三酮共热，产生兰紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。
此反应为一切蛋白质及a-氨基酸所共有。
亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色，含有氨基的其他物质亦呈此反应。
（2）蛋白质沉淀反应原理：多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。
1、蛋白质的盐析作用原理：向蛋白质中加入大量的中性盐（硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等），使蛋白质胶体颗粒脱水，破坏其水化层，同时它所带有的电荷亦被中性盐上所带的相反电荷的离子所中和。
于是稳定因素被破坏，蛋白质聚集沉淀。
盐析作用一般不使蛋白质变性。
2、有机溶剂沉淀蛋白质原理：某些有机溶剂（如乙醇、甲醇、丙醇等），因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀3、重金属盐与某些有机酸沉淀蛋白质原理：重金属离子（如Pb2+、Cu2+等）与蛋白质的羧基等结合生成不溶性的金属盐类而沉淀，同时蛋白质发生变性。
生化实验二报告
实验二蛋白质的呈色反应，沉淀反应实验人：刘彦汶学号：20100331024 班级：针外2010七同组人：曲畅试验日期：2012年3月15日指导老师：路雪雅一．实验目的1．了解蛋白质的性质。
2．掌握蛋白质的鉴定方法。
3．理解蛋白质呈色反应和沉淀反应原理。
二．实验内容1．蛋白质的呈色反应。
2．蛋白质的沉淀反应。
三．实验器材水浴锅（100摄氏度），试管（若干），烧杯，一次性滴管，酒精灯，漏斗，火柴，滤纸四．实验试剂1．1：10鸡蛋白溶液 2．10%NaOH 3．1%硫酸铜 4．尿素 5．0．1%茚三酮乙醇液 6．0．25%丙氨酸溶液 7．饱和硫酸铵溶液 8．固体硫酸铵 9．0．5%NaOH 10．0．5%硫酸锌 11．10%磺基水杨酸 12．10%Hcl 13．1%HAc 14．10%HAc 15.无离子水五．实验原理及操作步骤（一）蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应是蛋白质中某些氨基酸特殊基团与一定的化学试剂作用而呈现的各种颜色反应，可作为检查蛋白质是否存在的参考。
另外，不同的蛋白质中氨基酸的种类及含量各不相同，而在某些蛋白质内还可能缺乏呈某种颜色反应的氨基酸。
因此不但不同蛋白质呈色反应的强度不同，而且某些呈色反应在某种蛋白质可能不存在。
本实验操作两种呈色反应：双缩脲反应与茚三酮反应，用以比较和鉴别不同的蛋白质。
1．双缩脲反应【实验原理】在浓碱液中，双缩脲能与硫酸铜结合生成紫色或紫红色的复合物，这一呈色反应为双缩脲反应，凡含有两个及多个肽键（酰胺键）的化合物都可能发生此反应，故蛋白质及二肽以上的物质都有此反应，但除肽键外，有些基团如—CSNH—，—C（NH2）NH—等也有双缩脲反应，因此，一切蛋白质或多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的不一定都是蛋白质或多肽。
【操作】（1）取小试管一支，加1：10鸡蛋白液2滴，10%NaOH溶液5滴及1%硫酸铜溶液2滴，混匀，可见溶液变成紫色。
（2）另取一小试管，加一小匙尿素（绿豆大小），小火加热至熔，嗅其气味为（臭鸡蛋味）。
重庆大学生物化学实验_实验七 蛋白质沉淀反应
3．向上述两试管的沉淀内各加蒸馏水5毫升，观 察沉淀能否复溶？为什么？
II. 用重金属沉淀蛋白质
原 理
？？？
•应注意 ？
在溶液的PH值大于蛋白质的等 电点时，带负电荷的蛋白质与重 金属离子（Ca2+、Hg2+、Ag1+、 Pb2+等）结合成盐而沉淀。
I．蛋白质的盐析作用
原 理
？？？
用高浓度的中性盐，使蛋白质带电荷 量减少，水化膜破坏蛋白质而从溶液中沉 淀出来。
盐析沉淀蛋白一般不引起蛋白质变性， 故常用于分离各种天然蛋白质。
操作方法
1．取一试管加入盐析用蛋白质溶液和饱和硫酸 铵溶液各5毫升，混匀后静置数分钟，球蛋白即 沉淀析出。
叶酸（VB11）和四氢叶酸(FH4)
四氢叶酸是合成酶的辅酶，其前体是叶酸(又称为蝶酰谷氨酸，属 于维生素B11,绿叶中含量丰富)。
H
N NH
H2N
H
O
N
N
CH2 NH H
C
OH H
(2-氨4-羟6-亚甲基喋呤)
(对氨基苯甲酸)
COOH CH2 CH2 NH CH COOH
(谷氨酸)
四氢叶酸的主要作用是作为一碳基团，如-CH3, -CH2-, -CHO 3%硝酸银液
结果
2
1 2
数滴
3
1 2
数滴
III．用“生物碱试剂”沉淀蛋白质
问题：1、什么叫生物碱与生物碱试剂？ 2、生物碱有什么生物学意义？ 3、为什么生物碱试剂能沉淀Pr?
《蛋白沉淀反应》课件
01
02
03
04
蛋白质分离纯化
利用不同蛋白质在沉淀反应中 的差异，将目标蛋白质与其他
杂质分离。
蛋白质结构研究
通过观察不同条件下蛋白质的 沉淀行为，了解蛋白质的结构
与功能关系。
生物工程应用
在生物工程中，利用蛋白沉淀 反应从发酵液中分离纯化酶和
蛋白质。
临床诊断
在临床诊断中，利用蛋白沉淀 反应检测蛋白质的异常表达和
结果2
通过测定上清液和沉淀物的蛋 白质浓度，可以计算出蛋白质 的沉淀率。
结果3
通过比较不同pH值下的沉淀率 ，可以得出最佳的pH值范围。
结果4
通过比较不同盐浓度下的沉淀 率，可以得出最佳的盐浓度范
围。
03 蛋白沉淀反应的影响因素
盐浓度
盐浓度是影响蛋白沉淀反应的重要因素之一。随着盐浓度的 增加，蛋白质的溶解度逐渐降低，最终导致蛋白质从溶液中 沉淀出来。这种现象称为盐析。常用的盐析剂包括硫酸铵、 氯化钠等。
新技术的应用
01
蛋白沉淀反应技术将与生物信息 学、大数据等新技术结合，实现 更精准的蛋白质分离和纯化。
02
人工智能和机器学习将应用于蛋 白沉淀反应的优化和自动化，提 高实验效率和准确性。
新型蛋白沉淀剂的开发
新型蛋白沉淀剂将更加高效、特异和 温和，减少对蛋白质结构和功能的损 害。
开发新型蛋白沉淀剂将更加注重环保 和可持续性，减少对环境的负面影响 。
VS
在实际操作中，通常先将有机溶剂加 入到蛋白质溶液中，搅拌均匀后再缓 慢降低温度，以促进蛋白质的沉淀。 通过调节有机溶剂的浓度和温度，可 以实现对蛋白质的分离和纯化。
04 蛋白沉淀反应的优化与改 进
优化盐浓度
蛋白质两性性质及等电点的测定
注意事项
在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓
度和加入量相当准确。
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阳离子两性离子阴离子
pH<pIpH=pIpHpI 电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液 的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等， 即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质 溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同 pH 的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情
实验---蛋白质的沉淀反应与颜色反应
实验蛋白质的沉淀反应与颜色反应一、实验目的掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
熟悉蛋白质的沉淀反应，进一步熟悉蛋白质的有关反应。
二、实验原理蛋白质分子中某种或某些集团可与显色剂作用，产生颜色。
不同的蛋白质由于所含的氨基酸不完全相同，颜色反应亦不完全相同。
颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质也可产生同样的颜色反应，因此不能根据颜色反应的结果来决定被测物是否为蛋白质。
另外，颜色反应也可作为一些常用蛋白质定量测定的依据。
蛋白质是亲水性胶体，在溶液中的稳定性与质点大小、电荷、水化作用有关，但其稳定性是有条件的，相对的。
如果条件发生了变化，破坏了蛋白质的稳定性，蛋白质就会从溶液中沉淀出来。
三、实验仪器1、吸管2、滴管3、试管4、电炉5、pH试纸6、水浴锅7、移液管四、实验试剂1、卵清蛋白液：鸡蛋清用蒸馏水稀释10-20倍，3-4层纱布过滤，滤液放在冰箱里冷藏备用。
2、0.5%苯酚：1g苯酚加蒸馏水稀释至200ml。
3、Millon’s试剂：40g汞溶于60ml浓硝酸〔水浴加温助溶〕溶解后，冷却，加二倍体积的蒸馏水，混匀，取上清夜备用。
此试剂可长期保存。
4、尿素晶体5、1%CuSO4：1g CuSO4晶体溶于蒸馏水，稀释至100ml6、10%NaOH：10g NaOH溶于蒸馏水，稀释至100ml7、浓硝酸8、0.1%茚三酮溶液：茚三酮溶于95%的乙醇并稀释至100ml.9、冰醋酸10、浓硫酸11、饱和硫酸铵溶液：100ml蒸馏水中加硫酸铵至饱和。
12、硫酸铵晶体：用研钵研成碎末。
13、95%乙醇。
14、醋酸铅溶液：1g醋酸铅溶于蒸馏水并稀释至100ml15、氯化钠晶体16、10%三氯乙酸溶液：10g三氯乙酸溶于蒸馏水中并稀释至100ml17、饱和苦味酸溶液：100ml蒸馏水中加苦味酸至饱和。
18、1%醋酸溶液。
五、实验步骤蛋白质的颜色反应〔一〕米伦〔Millon’s〕反应1、苯酚实验：取0.5%苯酚溶液1ml于试管中，加Millon’s试剂，电炉小心加热观察颜色变化。
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实验3蛋白质的等电点测定和沉淀反应
、目的
1、 了解蛋白质的两性解离性质。
2、 学习测定蛋白质等电点的一种方法。
3、 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
1、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
、原理
蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在下列平衡:
COOH
Jf
P NH 2
蛋白质分子
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的PH 达到一定数值时，
蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动， 此时溶液的pH 值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有特异的等电点。
在等电点时， 蛋白质的理化性质都有变化， 可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方
法是测其溶解度最低时的溶液 pH 值。
本实验通过观察不同 pH 溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋 酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同 pH 值的缓冲液。
向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的 pH 值即为酪蛋白的等电点。
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒， 在
一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的
因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来溶剂中， 并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白
质的盐析作用或在低温下用乙醇 （或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时， 常利用此
类反应。
（2）不可逆沉淀反应
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，
蛋白质常变性而沉淀,
不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固。
蛋白质与重金属离子或某些有机酸的
反应都属于此类。
COO'
/
P
COQ-
NH 2
阴离子
NH3
兼性离子
COOH + H* /
b ■
= p
+ 0H -
NH ；
阳离子
P H>pI
P H = pI
pH<pI
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此变
性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、材料、试剂与器具
（一）材料
新鲜鸡蛋
（二）试剂
1、0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200ml
取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40—50 C的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10mL 1mol/L 醋酸钠溶液。
把锥形瓶放到50C水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移到100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。
2、 1.00mol/L 醋酸溶液100mL
3、0.10 mol/L 醋酸溶液300mL
4、0.01 mol/L 醋酸溶液50mL
5、蛋白质溶液500mL
5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清：水=1:9）
6、pH4.7醋酸一醋酸钠的缓冲溶液100mL
7、3%硝酸银溶液10mL
8、5%三氯乙酸溶液50mL
9、95%乙醇250mL
10、饱和硫酸铵溶液250mL
11、硫酸铵结晶粉末10000mL
12、0.1mol/L 盐酸溶液300mL
13、0.1mol/L氢氧化钠溶液300mL
14、0.05mol/L 碳酸钠溶液300mL
15、甲基红溶液20mL
（三）器具
1、水浴锅
2、温度计
3、200mL锥形瓶
4、100mL容量瓶
5、吸管
6、试管及试管架
7、
乳钵
四、操作步骤
（一）酪蛋白等电点的测定
（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。
（2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL ,加一管，摇匀一管。
此时1、2、3、
4管的pH依次为5.9、5.5、4.7、3.5。
观察其混浊度。
静置10分钟后，再观察其混浊度。
最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点。
（二）蛋白质的沉淀及变性
1、蛋白质的盐析无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。
盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加蛋白质溶液5mL于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。
倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止。
此时析出沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
2、重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加3%硝酸银溶液1 —2滴，振荡试管，有沉淀产生。
放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？
3、某些有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2mL，再加入1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。
放置片刻倾出清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀
是否溶解。
4、有机溶剂沉淀蛋白质取1支试管，加入2mL蛋白质溶液，再加入2mL95%乙醇。
观察沉淀的生成（如果沉淀不明显，加点NaCI，混匀。
振摇混匀后，观察各管有何变化。
放置片刻向各管内加入水8毫升，然后在第2，3号
管中各加一滴甲基红，再分别用O.1mol/L醋酸溶液及0.05mol/L碳酸钠溶液中和之。
观察
各管颜色的变化和沉淀的生成。
每管再加O.1mol/L盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。
解
释各管发生的全部现象。
五、注意事项
等电点测定的实验要求各种试剂的浓度和加入量必须相当准确。
六、实验报告
以表格形式总结实验结果，包括观察到的现象，分析评价实验结果。
七、思考题
1、什么是蛋白质的等电点？
2、在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？。