免疫分析方法
步骤：
A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙 烯小珠），经温育后清洗； B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则 与吸附的抗原结合，温育后清洗； C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附 的抗原抗体复合物结合，温育后清洗； D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用 光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。
1.2 免疫电泳
免疫电泳是一种将区带电泳和
双向免疫扩散相结合的免疫化
学分析技术。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板 上进行电泳，使其中的各 种成分因电泳迁移率的不 同而被分离成肉眼不可见 的区带。 停止电泳后，在与电泳方 向平行的槽内加入相应抗 血清，使抗原和抗体呈双 向扩散，已分离的各抗原 与相应抗体在琼脂中扩散 而相遇，在二者比例合适 处形成肉眼可见的沉淀弧。
（三）竞争法
酶联免疫吸附法ELISA
ELISA的基本原理和方法
ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
基本原理
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）
基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反 应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与 吸附的抗体结合，温育后清洗； C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；
D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色 的改变与所加的待检标本溶液中的抗原 量成正比。
（二）间接法
间接法是检测抗体 最常用的方法，其 原理为利用酶标记 的抗抗体以检测已 与固相结合的受检 抗体，故称为间接 法。
显色反应
橘红色 黄色 棕色 兰色 蓝绿色
测定波长
492 460 449 425 642
辣根过氧化物酶
碱性磷酸酯酶
葡萄糖氧化酶 β -Ｄ-半乳糖苷酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰 甲基伞酮疫分析方法
免疫分析技术
免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛的运 用，其中酶联免疫吸附法（ELISA）已经在食品工业中 广泛应用，它能够用于测定人们希望含有的物质，以及 不希望含有的物质。例如现在人们所关注的食品安全性 问题中一些物质的检测：杀虫剂、药物残留物、激素、 生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素， 以及一些添加剂。 免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和 低成本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用 于样品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定 样品中待测组分的含量。
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂 作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂， 它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶 促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用 不同的底物 ，将得到不同的颜色反应。
酶
底 物
邻苯二胺 四甲替联苯胺 氨基水杨酸 邻联苯甲胺 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐
实验原理
可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异性 地结合，在比例合适处，形成肉眼可见的沉淀物的一种免疫血清学技术 。 （一）单向扩散实验 一种定量实验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固 后，在琼脂层上打孔，再将抗原加入孔中，使其向四周扩散。抗原抗体 复合物形成的沉淀环直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标 准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从标准曲线中求出 。本实验主要用于检查标本中各种免疫球蛋白和血清IgG含量。 （二）双向扩散实验 抗原抗体在一定pH和离子存在的琼脂糖凝胶中相向扩散，一定时间后 ，两者相遇而形成不明显的抗原抗体聚合物并继续扩散，当扩散至两者 的适当比例时便形成大的抗原抗体复合物而出现明显沉淀，形成垂直于 扩散方向的免疫沉淀线即等价线。
黄色 红色
黄色 深蓝色 荧光 黄色
400 500
405 420 360,450 420
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
步骤： A 将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；
免疫分析技术的分类
标记免疫分析技术 酶联免疫分析 放射免疫分析 荧光免疫技术 胶体金免疫技术 化学发光免疫技术
非标记的免疫分析技术 免疫扩散
免疫电泳
1、非标记免疫分析技术 1.1免疫扩散
抗原及相应的抗体分子在凝胶中扩散相遇，达到 合适浓度比例时形成抗原抗体复合体沉淀的技术。可 以检测特定的抗原或抗体。 抗原与抗体成分的一种定性与半定量分析方法， 通常采用半固态透明琼脂凝胶作为支持介质。置于孔 中的抗原和抗体相向扩散，在两者浓度比例适当处相 遇后如能结合形成复合物则形成沉淀线。分为单向扩 散（single immunodiffusion）、放射状扩散（ radial immunodiffusion）和双向扩散（double immunodiffusion）等。
根据沉淀弧的数量、位置和形状与已知标准抗原进行比较， 可分析、鉴定样品中所含的抗原成分及其性质。
2、免疫标记技术
采用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原 -抗体反应， 通过对免疫复合物中的标记物的测定，达 到对免疫反应进行监测的目的。
2.1酶联免疫法
• 免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶 的高效催化作用原理有机地结合起来。它 具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点， 并克服上述两种方法的缺点。 • 酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长， 免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验， 可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定 量测定，所得结果比较客观。
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是一种基于化学发光原理的免疫分析技术，它结合了免疫学和化学发光技术的优势，具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用前景。
本文将从化学发光原理、免疫分析方法和应用领域等方面对化学发光免疫分析原理进行介绍。
化学发光原理。
化学发光是指在化学反应中产生的光。
化学发光反应的基本原理是两种或两种以上的物质在一定条件下发生反应，通过激发态的分子或离子产生的能量转移到基态的分子或离子上，从而产生光。
化学发光反应是一种放热反应，通常需要一种催化剂来促进反应的进行。
在化学发光免疫分析中，化学发光物质通常被标记在抗体或抗原上，当靶分子与标记的抗体或抗原结合时，激发化学发光反应，产生光信号。
免疫分析方法。
化学发光免疫分析是一种基于免疫学原理的分析方法，它利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过检测免疫复合物的形成来定量或半定量地测定样品中的靶分子。
在化学发光免疫分析中，通常使用化学发光仪器来检测化学发光信号的强度，进而确定样品中靶分子的浓度。
与传统的免疫分析方法相比，化学发光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速等优点，因此在临床诊断、药物检测、环境监测等领域得到了广泛的应用。
应用领域。
化学发光免疫分析技术在临床诊断、药物检测、环境监测等领域有着广泛的应用。
在临床诊断中，化学发光免疫分析可以用于检测肿瘤标志物、感染性疾病标志物、内分泌激素等，具有高灵敏度和高特异性，可以帮助医生进行早期诊断和疾病监测。
在药物检测中，化学发光免疫分析可以用于药物代谢产物的检测和药物浓度的监测，有助于指导临床用药。
在环境监测中，化学发光免疫分析可以用于检测水质、空气质量、土壤污染等，具有快速、准确的优势。
总结。
化学发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强的免疫分析技术，具有广泛的应用前景。
通过对化学发光原理、免疫分析方法和应用领域的介绍，我们可以更好地理解化学发光免疫分析的原理和特点，为其在临床诊断、药物检测、环境监测等领域的应用提供理论基础和技术支持。
检验科免疫组化常见检测与分析方法
检验科免疫组化常见检测与分析方法免疫组化技术是一种利用免疫学原理，通过检测和定位特定蛋白质在组织或细胞中的表达水平和位置的方法。
在医学检验科中，免疫组化技术被广泛应用于疾病的诊断、治疗及预后评估。
本文将介绍一些常见的免疫组化检测与分析方法。
一、免疫组化染色法免疫组化染色法是免疫组化技术中最常用的方法之一。
它通过采用免疫荧光、酶标记、金标记或放射性标记等技术，将特定抗原与特异性抗体结合，并通过染色或荧光的方式来显示其位置和表达水平。
免疫组化染色法广泛应用于各种疾病的诊断，如肿瘤标记物的检测、感染性疾病的诊断等。
二、免疫组织化学法免疫组织化学法是一种在组织切片上进行免疫组化染色的方法。
它通过对切片进行蛋白质抗原的恢复处理和抗体的特异性结合，来检测和显示抗原在组织中的位置和表达水平。
免疫组织化学法主要应用于病理学领域，帮助医生确定疾病的类型和分级。
三、免疫荧光法免疫荧光法是利用特异性抗体与抗原结合后，在显微镜下观察抗原在组织或细胞中的分布情况和表达水平的技术。
免疫荧光法具有高灵敏度和高特异性的优点，被广泛应用于自身免疫性疾病、感染性疾病等的诊断。
四、免疫电镜法免疫电镜法是一种在电镜下观察和检测抗体与抗原结合的方法。
它通过在样品上标记抗体或抗原，然后利用电镜来观察并获得高分辨率的图像。
免疫电镜法主要用于对超微结构进行研究和观察，是研究细胞和组织的重要手段。
五、免疫组化信号放大技术免疫组化信号放大技术是一种能够放大免疫染色信号并提高染色效果的方法。
常见的免疫组化信号放大技术包括多聚酶法、银增强法、酶蛋白复合物法等。
这些技术在免疫组化检测中可以提高检测的灵敏度和准确性。
免疫组化技术因其高度敏感、高特异性和定量分析的优势，成为了疾病诊断与治疗中不可或缺的重要方法。
随着技术的发展和创新，免疫组化技术将在临床医学中发挥越来越重要的作用。
综上所述，本文介绍了免疫组化检测与分析的常见方法，包括免疫组化染色法、免疫组织化学法、免疫荧光法、免疫电镜法以及免疫组化信号放大技术。
酶联免疫分析法
②用已知抗体检测未知抗原； ③定性或定量检测体内多种大分子物质； ④用已知抗体检测某些药物、激素等多种半抗原物质。
第一节 酶联免疫分析概述
二、酶标识免疫分析法及常用标识酶 1、免疫分析法分类
第一节 酶联免疫分析概述
白都是抗体。 • 例如无免疫活性旳免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不
是抗体，尽管其构造与抗体相同。 • 抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中
也有存在。 • 抗原抗体分子之间存在着构造互补性和亲和性，使得
抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具 有高特异性（即专一性）和可逆性。
第一节 酶联免疫分析概述
• Gal催化β-D-半乳糖苷水解反应旳最适pH为7.5，转 化效率很高，且比HRP易于标识，背景值低，稳定性 好。
• Gal比活力应不少于30U/mg，5℃能保存1～2年。
第二节 酶联免疫吸附分析法
一、光度酶联免疫分析 1 、 酶 联 免 疫 吸 附 分 析 （ enzyme-linked
immunosorbent assay，ELISA）原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面； ②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； ③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同旳环
值也略高。 • ELISA载体旳形式有小试管、小珠和微量反应板。
第二节 酶联免疫吸附分析法
3、固相载体旳包被与封闭 （1）包被（coating）指将抗原或抗体连接到固相载体
上旳过程。 • 以聚苯乙烯微量反应板为例，一般先将抗原或抗体溶
于pH 9.6旳碳酸盐缓冲液（或pH 7.2旳磷酸盐缓冲 液，pH 7～8旳Tris-HCl缓冲液）中，加满反应孔， 置4℃过夜，洗涤即可。 • 包被浓度随载体和包被物旳性质可有很大旳变化，每 批材料需经过试验与酶结合物旳浓度协调选定。 • 一般蛋白质旳包被浓度为0.1～20µg/ml。
免疫分析法
免疫分析法
免疫分析法是一种生物化学分析方法，它利用免疫反应来检测和测定特定的物质。
通过使用抗体来检测某些物质，这种方法能够快速准确地测量活性物质的含量，这些活性物质可以是蛋白质、核酸、激素或抗原等。
免疫分析法的步骤如下：
1. 样品制备：将样品中所要检测的物质分离出来，并浓缩到合适的浓度。
2. 抗体制备：制备一种特异性的抗体，以便检测样品中的特定物质。
3. 结合：将抗体与样品中的特定物质结合起来，形成抗原-抗体复合物。
4. 检测：通过检测抗原-抗体复合物的数量，来估计样品中特定物质的含量。
5. 评价：评价测定得到的结果，以检查测定的准确性。
免疫学的基本原理及研究方法
免疫学的基本原理及研究方法免疫学是研究生物体免疫功能及其调控机制的学科，涉及到免疫系统的组成、发育、功能、调控等多个方面。
了解免疫学的基本原理以及研究方法对于深入探索免疫系统的功能和疾病的发生机制具有重要意义。
一、免疫学的基本原理1. 免疫系统的组成免疫系统由多种细胞和分子组成，包括免疫细胞（如淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等）、免疫器官（如脾脏、淋巴结、骨髓等）以及各种免疫分子（如抗体、细胞因子等）。
这些组成部分相互协同作用，构建起庞大而精密的免疫系统。
2. 免疫系统的发育和分化免疫系统的发育始于胚胎期，经历多个阶段的细胞分化和发育过程。
造血干细胞经过多次分化，最终形成成熟的免疫细胞。
这个过程中，通过一系列复杂的信号传导途径和调控因子的作用，调节免疫细胞的分化和发育，使其具备不同的功能特性。
3. 免疫应答的基本原理免疫应答是指机体对外界刺激物的免疫反应。
当机体受到感染或损伤时，免疫细胞和分子会被激活，产生一系列的免疫应答。
这包括先天性免疫和获得性免疫两个方面。
先天性免疫是机体固有的防御机制，通过巨噬细胞、炎症细胞等对病原体进行非特异性的清除。
获得性免疫则是机体在遭遇抗原刺激后产生的有针对性的免疫应答。
4. 免疫的调节和平衡为了维持机体的免疫平衡，免疫系统具备自我调控的机制。
这包括免疫耐受和免疫调节两种方式。
免疫耐受是指机体对自身抗原或非致病微生物耐受而不产生免疫应答，以避免自身免疫疾病的发生。
免疫调节是指免疫系统通过多种机制来调节免疫应答的强度和方向，以保持免疫平衡。
二、免疫学的研究方法1. 免疫分析方法免疫学的研究离不开免疫分析方法。
其中，流式细胞术是一种常用的方法，可用于对免疫细胞的表型特征进行定量和定性分析。
酶联免疫吸附试验（ELISA）则广泛应用于免疫分子（如抗体、细胞因子等）的检测和定量分析。
另外，免疫组化技术可以在组织或细胞水平上检测特定分子的表达情况，为研究免疫反应提供直观的证据。
免疫学检验的方法和特点
免疫学检验的方法和特点免疫学检验是一种通过检测和分析机体免疫系统相关指标来评估机体免疫功能的方法。
它可以用于疾病的诊断、预防和治疗过程中，对于研究免疫系统的功能和疾病的免疫机制也具有重要意义。
免疫学检验的方法主要包括体外诊断试验、免疫组化技术和流式细胞术等。
下面将逐一介绍这些方法的特点和应用。
1. 体外诊断试验：体外诊断试验是最常用的免疫学检验方法之一，包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫分析（RIA）、免疫印迹（Western Blot）等。
这些试验通过检测血清中的抗体或抗原来评估机体的免疫状态。
其特点是操作简单、结果准确可靠、样本来源广泛，可以用于检测多种疾病，如感染病、自身免疫病等。
体外诊断试验的优势在于可以进行大规模筛查，对于人群健康状况的监测和疾病的早期诊断具有重要意义。
2. 免疫组化技术：免疫组化技术是利用抗体与组织或细胞中特定分子的结合反应来检测和定位这些分子的方法。
常用的免疫组化技术包括免疫组织化学（IHC）和免疫荧光染色（IF）等。
这些技术可以用于检测和定位肿瘤标志物、炎症细胞因子、免疫细胞表面标志物等，对于疾病的诊断和治疗有重要的指导意义。
免疫组化技术的优势在于可以直接观察到分子的表达和分布情况，具有较高的灵敏度和特异性。
3. 流式细胞术：流式细胞术是一种通过检测和分析细胞表面标志物来鉴定和分类细胞的方法。
通过标记细胞表面的抗原或抗体，结合流式细胞仪的高速流式分析技术，可以对单个细胞进行高通量的检测和分析。
流式细胞术可以用于检测和鉴定免疫细胞亚群、肿瘤细胞、干细胞等，对于疾病的诊断和治疗选择有重要的指导作用。
流式细胞术的优势在于可以同时检测多个指标，对于复杂的样本分析有较高的效率和准确性。
免疫学检验的特点包括以下几个方面：1. 高度特异性：免疫学检验方法可以通过特异的抗体-抗原反应来检测和定量分析特定的分子或细胞，具有较高的特异性。
这使得免疫学检验方法在疾病的诊断和治疗中具有重要的优势，可以准确地鉴定和区分不同的疾病类型。
化学发光免疫分析方法
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。
其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。
化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。
化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。
免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。
化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。
待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。
一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。
鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。
在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。
因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。
酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。
鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。
鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。
2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。
放射免疫分析测定方法-临床免疫
放射免疫分析测定方法-临床免疫放射免疫分析测定方法：用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量。
（一）抗原抗体反应将抗原（标准品和受检标本）、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行反应一定时间，使竞争抑制反应达到平衡。
不同质量的抗体和不同含量的抗原对温育的温度和时间有不同的要求。
如受检标本抗原含量较高，抗血清的亲和常数较大，可选择较高的温度（15～37℃）进行较短时间的温育，反之应在低温（4℃）作较长时间的温育，形成的抗原抗体复合物较为牢固。
（二）B、F分离技术在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的标记抗原抗体复合物（B）不能自行沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原（F）的分离。
另外对小分子量的抗原也可采取吸附法使B与F分离。
1.第二抗体沉淀法这是RIA中最常用的一种沉淀方法。
将产生特异性抗体（第一抗体）的动物（例如兔）的IgG免疫另一种动物（例如羊），制得羊抗兔IgG血清（第二抗体）。
由于在本反应系统中采用第一、第二两种抗体，故称为双抗体法。
在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体，形成由抗原-第一抗体-第二抗体组成的双抗体复合物。
但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使之与第二抗体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。
经离心即可使含有结合态抗原（B）的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原（F）分离。
将第二抗体结合在颗粒状的固相载体之上即成为固相第二抗体。
利用固相第二抗体分离B、F，操作简便、快速。
2.聚乙二醇（PEG）沉淀法最近各种RIA反应系统逐渐采用了PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。
PEG沉淀剂的主要优点是制备方便，沉淀完全。
缺点是非常特异性结合率比用第二抗体为高，且温度高于30℃时沉淀物容易复溶。
7.免疫分析1
20
免疫应答的动力学
当抗原引入动物的有关组织时最初引起淋巴细胞的分化，
特别是在淋巴结和脾脏中的淋巴细胞。然后，一种称之为浆
细胞的抗体生成细胞便会增加。在注射入抗原和在血清中发
现抗体之间存在一个潜伏期，之后抗体的浓度增加到最大，
而后开始降低。如果抗原对动物是全新的，动物则表现出慢
的响应(初次应答)．但若动物以前遇到过这种抗原，则会出
16
五种免疫球蛋白的比较
17
抗体的制备
多克隆抗体：从特定的抗原免疫动物中提取的含有抗体的 血清称之为抗血清。在许多分析应用中并不需要把抗体从 血清中分离出来。这种抗血清会因不同动物，甚至是同种 动物的不同的个体由于遗传性的差异，而导致所得抗体并 非均一物质，特别是抗体的特异性及亲和力几乎每批产品 都不相同，通常称这类抗体为多克隆抗体。
除了上述考虑之外，任何一种分离方法都应简单、快速、 耗费低、易于自动化，并且适用于较多的分析对象。
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8.2.2 分离方法的分类
免疫分析中常用的分离方法
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二抗
抗动物种的二抗是在20世纪70年代末80年代初开 始使用的， 二抗是专门针对-球蛋白的一种抗体， 也称为抗抗体。二抗的使用，使免疫分析得到了巨 大的进步。
12
(3)抗原的免疫原性还与免疫原的分子表层基团有关， 对蛋白质抗原。它还与氨基酸的组成相关。例如， 多聚赖氨酸无免疫原性，在其外层接上一层丙氨酸 或甘氨酸，它仍无免疫原性，但若外层接的是酪氨 酸，则它会表现出免疫原性．由此可见，带芳香环 氨基酸，或者说结构较为复杂的氨基酸对免疫原性 有重要的贡献。
择哪一种方法与抗体的用途、对抗体纯度的要求、 及抗体的种类和来源有关，如抗体可以来源于血清， 培养上清液或腹水。
(整理)免疫分析法
免疫分析法1,熟悉免疫分析法的基础知识,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法第一:概述基本原理基本条件方法分类免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法.1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA).酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等.一,基本原理(一)竞争抑制原理实质都是抗原一抗体竞争结合反应Ag*:标记抗原 Ag:未标记抗原Ab:特异抗体Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物, Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物K:平衡常数(K=K1/K2).抗原-抗体反应须满足以下条件:Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质;所加入Ag*和Ab的量应是固定的;Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点;Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中.这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础(二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线)用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率.B代表结合的标记抗原;F代表游离的标记抗原;T代表总的标记抗原.B/F-[Ag]B/(B+F)×100%-[Ag](三)抗原一抗体反应的特点1.特异性一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应.抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型.抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力.交叉反应(cross reaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合.2.可逆性抗原与抗体的特异性结合是由于两者的分子结构及立体构型相互吻合,它仅发生在分子的表面,并依靠抗原一抗体分子间的静电力作用,疏水作用,氢键作用及范德华引力等而存在.是可逆反应,改变反应条件可使结合物发生水解.3.最适比例性抗原抗体的结合反应具有一定的量比关系.只有当抗原抗体两者的分子比例合适时,才能发生最强的结合反应.以沉淀免疫反应为例二,基本条件三种基本试剂:标记抗原,未标记抗原和特异抗体(一)抗原及其制备1.全抗原与半抗原抗原(Antigen):能在机体中引起特异性免疫应答反应的物质.物质的抗原性包括免疫原性和抗原特异性.免疫原性(Immunogenicity):抗原注入动物体内后能促使动物产生特异抗体.抗原特异性(Antigenic Specifiety):抗原能与特异抗体相作用的性质.1.全抗原与半抗原全抗原:同时具有免疫原性和抗原特异性的物质.半抗原(Hapten):只能与特异抗体作用但不引起机体免疫应答的物质.人工完全抗原:药物(半抗原) 本身不具免疫原性,只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质或多肽)共价结合后,才具有免疫原性.这种小分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全抗原.2.人工抗原的制备(1) 载体(carrier)的选择:作为载体应考虑药物与载体结合后其免疫活性是否高,溶解度是否大,对化学反应合有机溶剂导致的变形作用有足够的抵抗力,价廉易得载体的本质是蛋白质-动物血清蛋白最常用.牛血清白蛋白(BSA), 兔血清白蛋白(RSA),人血清白蛋白(HSA)(2) 半抗原的选择药物本身必须具有合适的活性官能团,如-COOH,-NH2,-OH,-C=O等.(3)载体与半抗原的结合①碳二亚胺法利用碳二亚胺为缩合剂,将药物分子中的羧基与蛋白质分子中的氨基相连形成肽键②混合酸酐法③戊二醛法④琥珀酸酐法⑤重氮化的对氨基苯甲酸法3.人工抗原的鉴定鉴定的目的:测定人工抗原(药物)与蛋白质的结合比光谱分析法化学分析法放射性同位素法(1)光谱分析法结合物水解后,光谱法测定水解药物和蛋白质的含量,从而推算出它们的分子结合比. (2)化学分析法利用三硝基苯磺酸钠或二硝基酚,测定蛋白质与半抗原结合前后游离氨基数目的差别.反应出蛋白质与药物的结合程度,可求出结合物中药物的含量.(3)放射性同位素标记法在制备人工抗原时,在已知量的药物中加入定量的放射性同位素标记药物,然后通过测定结合物中的放射性强度,便可计算出加入的标记药物的总量中已与蛋白质结合的比例.4.标准抗原(Standard antigen)标准抗原:在免疫测定中用来制作标准曲线或制备标记抗原用的药物标准品,是免疫分析的定量依据.蛋白质,多肽类可使用纯度较低的产品,但一般不应低于90%,尤其是其中不能含有化学结构相类似的干扰杂质,否则会使样品的测定结果偏高.(二)特异抗体的制备及鉴定1.特异抗体(Specific Antibody)特异抗体:(高度特异性)是指抗原(免疫原)作用于机体产生免疫反应,在血清中产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白.在免疫球蛋白中,免疫球蛋白G (IgG)含量最高(约占70%),是免疫分析中最常用的抗体.2.抗体的制备单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb): 将预先免疫过的小鼠脾细胞与体外培养的骨髓瘤细胞,经细胞融合技术而得到的杂交瘤细胞.该瘤细胞通过体外培养,可大量复制,产生出特异的结构相同的均质抗体,此即单克隆抗体.多克隆抗体(Polyclonal Antibody)的制备是将抗原直接免疫动物而得到.抗体:单克隆抗体和多克隆抗体(抗血清)两大类(1)免疫原的制备免疫原(Immunogen):人工将抗原制成能刺激机体引起体液及细胞免疫反应的物质.水剂:抗原中加入一定量的无菌生理盐水所制成的免疫原.福氏完全佐剂(Freund's Complete Adjuvant):其制法是:取羊毛脂一石蜡油(1:3)混合,高压灭菌,等体积地与一定浓度的抗原混合,按3 mg/ml的量加入卡介苗,研磨或于无菌注射器中对拉,使之成为油包水的程度(放入冰水中不扩散)即可.福氏不完全佐剂在福氏完全佐剂中去掉卡介苗.(2)免疫接种动物家兔不仅对抗原的免疫反应较好,而且产生的抗体也较均一,是首选的免疫动物.羊,豚鼠微量免疫法的免疫抗原量在微克级内,常量免疫法的免疫抗原量通常在1～10 mg左右,大量免疫法的免疫抗原量在50～100 mg.(3)抗血清的获得采血时应注意无菌操作,尽可能将血放人面积较大的无菌容器中,先室温凝固30min左右,再放人30℃温箱约2h使凝固,最后放入4℃冰箱过夜.次日吸取血清,将血块用无菌的玻璃棒轻轻拨离并捣碎,在4000-10000 r/min离心20min,即得抗血清.大动物免疫羊部分采血家兔等小动物杀死动物一次性放血.3.抗体的鉴定(1)滴度(Titer)滴度又称效价或工作稀释度.滴度用免疫反应液中抗体(实指抗血清)的稀释度表示,稀释倍数越大,表示滴度越高.测定滴度可采用标记抗原法.RIA法测定抗血清的效价为例首先将抗血清用空白血清按比例稀释,然后精密吸取各稀释抗血清等量,分置若干支试管中,再于各试管中分别加入定量的放射性同位素标记药物(设放射性强度为T),温育.待反应达到平衡后,于反应液中加人分离剂(如沉淀剂),分离与抗体结合的标记药物(沉淀部分),测定各管中沉淀的放射性强度(B),并计算各管中标记药物的结合百分率(B/T%).当抗血清稀释度足够低时,其结合率趋于极值,该值称为"过量抗体结合率"(标记药物全被结合),如图中曲线的AB段,可用来衡量标记药物的质量.自AB段以后,随着抗血清稀释倍数增大,其标记药物的结合率逐渐降低,实际工作中多采用结合率为50%时(C点)的抗血清稀释度(D点).(2)活度(Avidity)活度:抗体与相应抗原的亲和力(Affinity).活度可反映出抗体分子和抗原分子之间的结合能力.活度高,表明形成抗原一抗体结合物的速度快而解离小.抗体活度高低与免疫分析方法的灵敏度密切相关,它主要表现在剂量反应曲线的斜率上,斜率越陡,表明活度越高,测定效果越好.(3)特异性(Specificity)特异性:抗原和抗体的结合能力与其它结构相类似的干扰物的结合能力的比较.如果抗体与抗原的结合能力越强,而与其它类似结构的干扰物结合能力(称为交叉反应)越弱,则说明抗体的特异性越强.三,方法分类1.按标记物的种类分(1)放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)(2)酶免疫分析(enzyme immunoassay,EIA)(3)化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay,CIZIA)(4)荧光免疫分析法(fluorescence immunoassay,FIA)荧光免疫分析法底物标记荧光免疫分析(Substrate labeled fluorescence immunoassay,SLFM)荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immunoassay,FPIA)荧光淬灭免疫分析(Fluorescent Quenching Immunoassay,FQM)荧光增强免疫分析(Fluorescent Enchancement Immunoassay,FEIA)时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)2.按是否加入分离剂分(1)均相免疫分析(Itomogeneous lmmunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反应达到平衡后,反应液中结合的标记药物与游离的标记药物之中有一种不产生信号或信号消失,因此无需将反应液分作两相,即可在均相溶液中进行测定,故称为均相免疫分析.如酶放大免疫测定技术(enzyme multiplied immunoassay technique,EMIT) .(2)非均相免疫分析(heterogeneous immunoassay)在某些免疫分析中,当抗原一抗体反应达到平衡后,只有在反应液中加入分离剂,将游离标记药物和结合标记药物分开之后,才能测出各自部分的标记药物浓度.否则,测定的是两者的总浓度.由于这种信号的测定需将反应液分成液-固两相后,才能分别测定,故称为非均相免疫分析.如放射免疫测定(Radioimmunoassay,RIA)第二放射免疫分析放射性同位素标记抗原F与B的分离技术放射免疫测定仪标准曲线的制备与样品测定步骤方法评价应用举例放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA):利用放射性同位素的测量方法与免疫反应基本原理相结合的一种同位素分析技术.特点:灵敏度高,特异性强,样品用量少,标记物容易制备以及放射性强度容易检测一,放射性同位素标记抗原在体内药物分析中,常采用放射性同位素.放射性同位素是指能自发放射出射线而变成其它元素的不稳定同位素.放射性同位素在发生核衰变时,会发射出α-射线,β-射线及γ-射线.用相关仪器检测产生的射线,即可用于于定量分析.1.放射性强度放射性强度(严格说应为放射性活度):每秒钟放射性同位素的原子核发生的衰变数(desintegration per-second,dps),其单位为贝可(Bq).1贝可相当于每秒1次核衰变,即lBq=1dps.1居里是指每秒钟放射性同位素发生3.7×1010次核衰变.2.放射性比度放射性比度或称比放射性或比活性:放射性同位素单位重量或体积中所含的放射性强度. mci × g-1或mci×ml-13.放射性化学纯度(放化纯度)放化纯度是指供使用的放射性药物中所需要的标记药物的放射性强度占总放射性强度的百分比.一般实验要求放化纯度大于90%.(二)标记抗原(Iabeled Antigen)标记抗原又称放射性标记药物,供标记的药物通常应是待测药物的纯品.标记抗原的纯度决定RIA的特异性,而标记抗原的放射性比度则决定RIA的灵敏度.因此,标记抗原是RIA测定技术中最关键的成分.1.对标记抗原的一般要求①有高的放射性比度;②标记后抗原仍具有原来的抗原性;标记物稳定性要好,不致因辐射引起化合物分解.2.标记放射性同位素的选择125I的特点是:①化学性质活泼,易于标记;②标记物在衰变中放出的γ-射线能量较高,易于测定;③标记物的放射线半衰期相对较短,须经常标记;④碘原子的半径较大,标记后可改变药物的化学结构或掩盖药物分子的特异功能基团,易使药物分子的抗原性受到影响.3H的特点是:①用3H标记后的药物可获得较高的放射性比度;②标记后的药物的抗原性不会受到影响,因为氢原子的半径较小,且3H只是与药物分子的1H发生交换,不涉及化学元素的改变③ 3H的半衰期很长,可达12～16年;④ 3H发射出的β射线能量较低,须采用价格较贵的液体闪烁计数器才能测定其放射性强度.(三)标记方法1.125I标记抗原的制备取代反应将其标记在药物或药物的衍生物上.用碘标记时一般采用氧化法,常用的氧化剂有H2O2及氯胺T等,目前应用最多的是氯胺T.氧化法是指先用氧化剂将放射性碘离子(I-)氧化成游离的放射性碘分子(I2),然后再进行标记.大分子药物可直接采用放射性碘标记.小分子物质一般先将药物制成含酪氨酸,组氨酸或含酚基的衍生物,然后再进行标记,使药物分子中的氢被带正电荷的放射性碘取代.2.3H标记抗原的制备H标记可分为定位标记和非定位标记两种方法.非定位标记通常采用气体曝射法,即将药物与氚(3H)气密封在一起,放置几天或几周,使3H与药物分子的1H发生交换定位标记采用特殊的合成路线,即先将3H引入药物分子结构中的指定位置,制成含有不饱和双键的标记药物前体,然后再对双键部位进行催化加氚.这种制备3H标记物的方法称为定位标记.二,F与B的分离技术游离的标记药物(F)和结合的标记药物(B)1,沉淀法2,吸附法3,固相法4,双抗体法(一)沉淀法用蛋白沉淀剂将抗体沉淀,从而可使与蛋白(抗体)相结合的药物也一起沉淀下来,而游离的药物由于未与蛋白结合,便留在于溶液中.常用的沉淀剂:硫酸铵,亚硫酸氢钠,乙醇,异丙醇.方法:在免疫反应达到平衡后的反应液中加入一定量的饱和硫酸铵溶液,使最终浓度为1.6-2.0mol/L (约40%-50%的饱和度),立即混匀,在4℃条件下反应20～30min后,离心,分离沉淀物,用40%的硫酸铵饱和溶液洗涤沉淀,然后测定放射性强度.优点:快速,简便,价廉.缺点:不能使F和B完全分离,沉淀物对放射性标记抗原有非特异性吸附,因而空白值较高.(二)吸附法吸附法是利用固体吸附剂能在反应液中吸附游离抗原的原理而使F与B分离.常用的吸附剂:右旋糖酐包裹的活性炭(Dextron Coated Carbon,DCC),纤维素,硅酸盐等.原理:DCC是利用活性炭的强吸附性和右旋糖酐的分子筛作用,使小分子的游离药物能通过分子筛的网眼被内层的活性碳选择性吸附,而与抗体相结合的药物由于分子体积大则不能通过网眼而被留在液相中.方法:当免疫反应达到平衡后,于反应液中加入DCC吸附剂,待吸附达平衡后,离心.离心后的结果正好与沉淀法相反,上清液中是与抗体相结合的标记药物(B),而沉淀中则是游离的标记药物(F).优点:快速,简便缺点:如药物一抗体结合物的离解常数较高时,测定结果不稳定.(三)固相法原理:通过物理涂敷或化学结合方法将抗体结合在不溶性固相载体表面,待抗原与抗体形成结合物(B)后就附在固相物上,而游离的抗原(F)则仍留在反应液中,从而实行分离.该法实质上是一种固相免疫测定法(solid-phase immunoassay),其固相本身就是一些特异的免疫吸附剂.常用的固相载体:葡聚糖凝胶,聚苯乙烯,纤维素,试管等.方法:采用试管固相法,即将抗体直接附着于试管底部的内壁上,测定时于试管中加入样品和试剂,当放射免疫反应达到平衡后,结合物就附在管壁上,游离抗原则留在液相中.通过离心或采用简单倾去法便可将两相分离.优点:简便,快速,实用.缺点:有时难以获得重复的结合率,其次是固相载体本身也有可能吸附游离标记药物,导致结果误差增大.(四)双抗体法分离原理:药物(半抗原)与抗体结合后,虽然分子量增大,但还不足以生成沉淀而处于"溶解"状态,这种抗体通常被称为第一抗体,它可通过将抗原注入家兔,豚鼠等动物体内免疫获得.然后再将第一抗体作为新的抗原注入羊,马,牛等较大动物,则可免疫获得第二抗体(抗一抗体).当往第一抗体的反应液中加入第二抗体后,第一抗体能与第二抗体结合使分子量增大,从而生成沉淀.离心后与抗体结合的标记药物(抗原-第一抗体-第二抗体结合物)处在沉淀中,而游离的标记抗原则留在上清液中.优点:分离效果好,适用范围广.缺点:抗体的制备有一定难度,且操作流程较长.三,放射免疫测定仪一类是γ计数器(γ-Counter),其所用的闪烁体是碘化钠等固态闪烁晶体,为提高其发光效率,还在晶体内加入有0.1%-0.5%的铊作为激活剂,该仪器适合测定125I,131I等同位素发射出的能量较高的β-射线.一类是液体闪烁测量仪(Liquid Scintillation Counter),由于该仪器放出的β射线能量低,射程短,不可能穿人和激发固态闪烁晶体,而只能在特定的闪烁液中进行,由β-射线激发液体闪烁剂而产生闪光现象.该仪器适合测定3H,14c等同位素发射出来的β-射线.(一)测量原理液体闪烁测量仪是利用放射性同位素标记药物所发射出的β-射线能作用于闪烁液而发出荧光(闪光),该荧光与放射性药物在单位时间内的核衰变次数有关,通过检测闪烁次数便可求出待测组分含量.1.溶剂作用:溶解闪烁剂和放射性样品;同时还起着吸收和转移β-射线能量的作用.条件:溶剂分子必须具有高度共轭的双键,只要受到能量低的β-射线的辐射,其π电子就能跃迁至激发态.一类是烷基苯类,甲苯,对-二甲苯,1,2,4-三甲苯等,主要适用于脂溶性药物的测定.另一类是醚类,1,4-二氧六环,适用于水溶性药物的测定.种类2.闪烁剂作用:接受激发态溶剂分子退激时所释放的能量→激发态→基态→发射出闪烁的荧光(光子)→光电倍增管→光电转换测量系统记录.要求:性能稳定,闪烁效率(闪烁剂放出光子的能量)高,淬灭耐受性好,发光衰减时间短.常用的闪烁剂有:对联三苯(TP),2,5-二苯基恶唑(PPO),2-苯基-5-(4-联苯基)-1,3,4-恶-二唑(PBD)等.(二)仪器简介1.计数瓶计数瓶(或称闪烁杯):一个具盖的玻璃或塑料小瓶(10～20m1),用于盛装样品和闪烁液.当放射性药物分子与闪烁液接触时,溶剂吸收放射能量并转给闪烁剂,闪烁剂将吸收的能量转变为光能(荧光),荧光透过计数瓶壁,进入光电倍增管.2.光电倍增管光电倍增管:光阴极,倍增极和阳极构成.进入光电倍增管的荧光(光子)通过光阴极表面的透明面板后,直接撞击光阴极,光阴极吸收光子能量后随即发射出光电子,光电子经数个倍增极依次放大,使电子数剧增.这些电子最后被阳极收集,产生一个电压脉冲,并由记录器记录下来3.记录器用于记录单位时间内所产生的电压脉冲数,该脉冲数反映了单位时间内放射性药物的核衰变次数(闪烁次数).通常采用每分钟计数(counts per minate,cpm),作为放射性同位素药物的放射性强度.四,标准曲线的制备与样品测定步骤(一)标准曲线的绘制取标准抗原,用无放射活性的空白血清或血浆稀释成5-8个系列浓度.加入定量标记抗原,其总放射性(T)应能满足准确测量的需要.加入定量的已稀释好的特异抗体,其抗体的量应满足灵敏度的要求.将标准抗原,标记抗原,特异抗体与缓冲液混匀后,在适当条件下温育,待反应平衡后测定总计数率(T).加入分离剂,使结合部分(B)与游离部分(F)分离.测定各管结合部分或游离部分的计数率.标准曲线通常以标准抗原(待测药物标准品)的浓度为横坐标,以结合率(B%)为纵坐标作图.纵坐标B%的计算有两种方法:一种是将与抗体结合的标记药物的放射性强度(B)与加入的标记药物总放射性强度(T)比较,即B%=(B/T)×100%;另一种是用零标准管(不加药物标准品)的放射性强度B0代替T比较,即B%=(B/B0)×100%.(二)样品测定步骤下述情况样品需进行简单处理:测定方法不够灵敏,可将被测物适当浓集;测定方法不很专属,可将被测物与其它干扰物质分离;待测物以缀合物形式存在,可设法使其游离,然后进行测定.例:125I-RIA(DCC沉淀法)测定血清中地高辛浓度待测血清样品50μl→样品管中;含不同浓度地高辛标准品的血清50μl→标准曲线各管中;50μl 空白人血清→零标准管.各管中依次加入保温液100μl→抗体溶液100μl→125I标记的地高辛(溶液)100μl摇匀→在室温(15～25℃)放置30min→γ-计数器测定各管的总计数T(即加人的协I总放射性剂量)→在电磁搅拌(或手摇)下,迅速向各管内加人1ml工作液(全部加完控制在5min内),摇匀→离心10min(3000r/min)→倾去上清液→γ-计数器测定各管中沉淀的计数F(游离协I地高辛放射性强度)→计算出标准曲线各管和样品各管的结合率.五,方法评价灵敏度高,特异性强,取样量少,适用于大批量样品的测定.需用放射性同位素标记抗原,其放射性对操作人员的健康,对环境的污染都会造成危害,而且还需有专用的同位素实验室及免疫测定仪器,成本较高,因而使其普及受到限制. 六,应用示例固相放射免疫分析试剂盒测定血清中地高辛浓度的方法1.主要试剂2.测定方法3.结果计算(1)标准曲线法以地高辛标准品血清浓度为横坐标,B标/T(%)为纵坐标,在半对数坐标纸上绘出标准曲线..以地高辛标准品血清浓度为横坐标,但用(B标-BNSB)/(B0-BNSB)(%)为纵坐标作标准曲线,当测得血清样品的(B样-BNSB)/(B0-BNSB)(%)值后,也可从标准曲线上得到对应的血清药浓(2)回归方程计算法以logx为自变量(x为血清中地高辛标准品的浓度),以logitY为因变量进行直线回归第三酶免疫分析法酶标记抗原均相酶免疫分析非均相酶免疫分析方法评价应用示例酶免疫分析(Enzyme Immunoassay,EIA)是以酶作为标记物的免疫测定方法.酶免疫分析法是1971年由Engvall等人在RIA的基础上发展产生起来的一种新的免疫分析方法. 一,酶标记抗原(一)标记酶的选择特异性强,酶蛋白分子中应具有足够的活性基团,以便能与药物结合.活性要高,即当底物浓度低时,确有较高的催化反应率.酶的活性不易受样品中其它成分影响,有较好的稳定性.酶的纯度要高,且生物体液中应无标记酶,底物,抑制剂及其它干扰物质存在.酶的活性测量方法应简单,灵敏,精密和快速.酶的来源,纯化,供应等应方便,价廉.最常用的标记酶1.辣根过氧化物酶(HRP):约有50%的EIA使用此酶.2.碱性磷酸酯酶(AP):AP标记的结合物性质稳定,其活性可用分光光度计或荧光计测量.3.6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PD): 通常用于均相EIA.4.β-半乳糖苷酶(β-Gal): 适用于均相EIA和非均相EIA.5.苹果酸脱氢酶(MDH): 多用于尿样的均相EIA.(二)底物的选择①无色,无毒能溶水;②化学性质稳定,不受光照的影响;③转化率高,在酶催化下可产生大量的有色物质;④显色产物的量在一定范围内与酶的浓度或活性成正比;⑤应有终止酶反应的试剂.常用酶的底物1,辣根过氧化物酶的底物:邻苯二胺(OPD),5-氨基水杨酸(5-ASA),四甲基联苯胺及其硫酸盐(TMB/TMBS)2,碱性磷酸酶底物:对硝基酚磷酸盐溶液(p-NPP),4-甲基伞酮基-磷酸盐(4-MUP)3,β-D-半乳糖苷酶底物:邻硝基苯-β-D-半乳糖吡喃苷(o-NPG),氯酚红-β-D-半乳糖吡喃苷(CPRG),试卤灵-β-D-半乳糖吡喃苷(RG)4,葡萄糖氧化酶底物:与辣根过氧化物酶底物相同(三):酶标记药物的制备。