免疫分析方法20070321
免疫分析法ppt
酶联免疫分析法——应用2
2、放射免疫分析法(RIA)
• 简介
1959 年美国的 Yalow 和 Berson 首先使用放射性核 素标记胰岛素从而创立了放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA)。
• 定义:把放射性核素测定与抗原、抗体间的免疫
化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种 超微量物质的测定方法。
兴奋剂检测的主要方法有气相色谱、高
效液相色谱、气相色谱－质谱联用、液相 色谱－质谱联用、免疫分析法、流动注射 电化学发光、高效毛细管电泳、毛细管电 泳－离子阱质谱等方法。
二、免疫分析法
免疫分析法是利用抗原与抗体的特异 性免疫反应来实现对禁用药物的检测的 方法。
特点：快速、高灵敏度、高特异性。 应用：主要被应用于类固醇类兴奋剂 和激素类兴奋剂的检测。
免疫分析法ppt
兴奋剂的检测方法
之免疫分析法
一、兴奋剂的概念 二、免疫分析法
（1）酶联免疫分析法 （2）放射64年，国际运动医学会的国际兴奋剂 会议将兴奋剂的概念定义为: 参加竞赛的 运动员使用任何异体物质，或以不正常的 量和不正常的进入机体的途径使用生理物 质，试图人为地以不正当方式提高其竞赛 成绩的行为。
抽干。
4、结果
γ一记数 仪记数， 并自动计 算尿中MA
浓度 (ng·ml-1)
3、化学发光免疫分析法（CLIA）
1977年Halman将化学反应系统与免疫系统相 结合，创建了化学发光免疫测定法(CLIA )，以检 测抗原或抗体。CLIA是建立放射免疫分析技术 (RIA)基础上的免疫分析技术，既有免疫反应的 特异性，更兼有发光反应的高敏感。
1、酶联免疫分析法(ELISA)
酶联免疫分析法——原理
临床分析中的免疫分析技术
临床分析中的免疫分析技术免疫分析技术在临床分析中的应用随着医学研究的不断深入和发展，免疫分析技术在临床分析中扮演着重要的角色。
它以其快速、敏感、准确的特点，成为了检测和诊断疾病的首选方法。
本文将从免疫分析技术的原理、类型、应用等方面进行分析与探讨。
一、免疫分析技术的原理免疫分析技术是一种利用抗原与抗体之间特异性相互作用的方法。
该原理基于人体免疫系统通过产生抗体来抵御感染。
在免疫分析中，我们利用抗原与抗体之间的结合反应，来检测和测定抗原或抗体的存在和浓度。
免疫分析技术可分为免疫层析、免疫电泳、免疫放射法、免疫染色法等。
二、常见的免疫分析技术1. 免疫层析法免疫层析法是一种便捷且应用广泛的免疫分析技术。
它基于在试纸或膜上，通过抗原与抗体的结合反应，在样本中快速检测出目标物质的存在与否。
免疫层析法在妇产科、感染病等领域有着重要的应用。
2. 免疫电泳法免疫电泳法是一种将样品中的抗原或抗体进行电泳分离和检测的方法。
其原理是根据抗原与抗体的电泳迁移速度和特定的电泳条件，来实现对抗原或抗体的分离和定量。
这种技术在肿瘤标志物检测、自身免疫性疾病诊断等方面具有重要应用。
3. 免疫放射法免疫放射法利用放射性同位素标记的抗体来检测样本中的抗原或抗体。
该方法具有高度的敏感性和准确性，能够对微量物质进行测定。
免疫放射法在临床检验中常用于激素测定、临床药物监测等方面。
4. 免疫染色法免疫染色法是一种利用抗体与标记物质相结合来检测样本中目标抗原的方法。
它通过特定的检测试剂和染色方法，将抗原与标记物质染色，然后观察和分析染色的程度和区域，以确定抗原的存在和分布。
免疫染色法在病理学、免疫组化等领域有着广泛的应用。
三、免疫分析技术的临床应用1. 疾病的早期诊断免疫分析技术在疾病的早期诊断中起着至关重要的作用。
通过检测血清中的特定抗体或抗原，可以帮助医生尽早发现疾病的存在，并采取相应的治疗措施。
例如，在乳腺癌筛查中，通过测定血清中的肿瘤标志物CA15-3，可以帮助医生尽早发现患者的异常情况。
免疫分析法
内外标记免疫分析技术研究现状标记免疫分析是一大类超灵敏度，高特异性检测技术的总称，因其具有许多独特优点，已广泛应用于基础医学和临床各领域。
它们的基本原理相同，仅依标记物的不同而最终测量所发出的信号而异。
虽然文献报告的方法已有10余种，但有推广应用价值或已被广泛应用的主要有：放射免疫分析（RIA）、酶免疫分析（EIA）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）和化学发光免疫分析（CLIA）等。
以下仅就这四种分析技术研究现状和前景作简要介绍。
放射免疫分析一、试管固相法［1］当前RIA发展的方向是以试管固相作为取代常规液相法的换代技术。
试管固相法在抗原、抗体免疫反应完成后不必加分离剂和低温离心程序，只需测量管的放射性便可得出待测物浓度，操作简便快速，适合大量临床样品的检测。
尤其以洗涤代替分离和离心，降低了非特异性结合，提高了方法精密度和准确性。
固相抗原或抗体的包被，常规物理吸附法，所包被蛋白质的量小，均一性差，仅适合双位点夹心法。
1990年Causse等［2］提出以顺丁烯二酸酐-苯乙烯共聚体处理聚苯乙烯管进行活化，以共价键结合包被，提高了包被的牢固性、均一性和蛋白质的量。
但因工艺流程复杂，难以推广。
我们在实验研究中发现，向试管内加一种双功能基团偶联剂处理试管，类似共价键结合包被，获得满意结果。
最近国外厂家已研制出氨基活化和琥珀酰亚胺酯活化，以共价键取代物理吸附，从根本上解决了固相抗体或抗原的质量问题，完全满足不同反应模式的要求。
试管固相RIA，其反应模式也相应地进行了改进，目前应用的有下列数种。
1.固相二抗竞争法：此模式是将二抗制成固相管作为通用分离技术，应用范围广。
测定时将125I标记抗原，待测样品和稀释第一抗体加至二抗固相管中温育，洗涤后测量放射性。
2.亲和素固相竞争法：将亲和素包被制成固相管，取第一抗体生物素化。
测定时取125I标记抗原，生物素化抗体和待测样品加至固相亲和素管中温育，洗涤后测放射性。
此固相管不仅可以通用，且灵敏度有所提高。
免疫分析法PPT课件
全抗原： 指同时具有免疫原性和抗原特异性的
物质。 作为全抗原的物质其分子量必须足够
大（分子量>1000），且要求化学结构较 复杂，如蛋白质、多肽等。
半抗原（Hapten）：指只能与特异抗体作用
但不引起机体免疫应答的物质。
人工抗原 ：药物(半抗原) 本身不具免疫原性，
只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质 或多肽)共价结合后，才具有免疫原性。这种小 分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全 抗原。人工抗原直接免疫动物可产生特异抗体。
2. 可逆性
抗原与抗体的特异性结合是由于两者 的分子结构及立体构型相互吻合，它仅发 生在分子的表面，并依靠抗原-抗体分子 间的静电力作用、疏水作用、氢键作用及 范德华引力等而存在。这种结合具有相对 稳定性，但仍为可逆反应。
3. 最适比例性
抗原抗体的结合反 应具有一定的量比关 系。只有当抗原抗体 两者的分子比例合适 时，才能发生最强的 结合反应。
抗体： (antibody ， Ab)
机体是在抗原物质的刺激下形成的一类能与 抗原特异性结合的活性球蛋白，又称免疫球蛋白 (immunoglobin ， Ig) ，由细胞合成并分泌。抗体 是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具 有各种免疫功能，主要存在于动物的血清、淋巴 液、组织液及其它外分泌液中。
免疫分析基于抗体与药物结合时所具有的 专一性和可饱和性，利用被测药物同标记药物 之间竞争抗体结合原理，建立药物浓度和响应 值（如RIA中的放射性强度）之间的函数关系， 用于体内药物分析。
抗体（Ab）、标记抗原（标记药物， Ag*）和非标记抗原（非标记药物，Ag） 三种试剂是所有免疫分析必需的基本试 剂，也是任何免疫分析试剂盒应提供的 试剂。
免疫分析法
影响因素
原理与方法 灵敏度 准确度和特异性 精密度 ：免疫分析法的精密度较其生物分析
法有较大提高 ；批内变异通常为20%～25%， 因此有必要进行2次或3次检测 标准化
生物分析法和免疫分析法结合使用
3． 竞争ELISA（Competitive ELISA）用于确定抗原 特异性或待检标本中含交叉反应成分时为了提高实验 的特异性而使用的一种方法。根据标记抗原与同种未 标记待测抗原与抗体间发生竞争性结合的原理，主要 用于测定小分子抗原。
夹心ELISA
第1步，包被捕获抗体到96孔板中，BSA阻断 后加入标准品或者标本
（二）功能检测
利用一些细胞因子的功能特性，可建立相应的 活性测定方法，如干扰素的抑制病毒感染效应， 肿瘤坏死因子对L929细胞的杀伤作用等。这样 的方法敏感性高，但特异性不够，容易受一些 扰因素的影响。
免疫分析法
（1）放免实验（RIA） （2）酶联免疫吸附实验（ELISA）
mRNA的测定
（1）分子杂交实验 （2）逆转录PCR（RT-PCR）
免疫分析法
ELISA 细胞内细胞因子的流式细胞仪检测 ELISPOT
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
1． 间接ELISA（Indirect ELISA）：用于筛检抗体 （抗特定抗原成分的特异性抗体）。此法是测定抗体 最常用的方法。
2． 夹心ELISA（Sandwich ELISA）：用于检测目的 抗原的量。其优点是避免了对特异性抗体的直接标记， 但增加了操作步骤和测定时间。
用途：检测单个细胞内多个细胞因子；并可区 分表达特定细胞因子的细胞亚群。
第七章免疫分析法
一、抗原决定簇
1、概念 抗原决定簇（antigenic determinant,AD)是指抗原中决定抗原特异性的特 殊化学基团，又称为表位（epitope)。表位的性质、 数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过 AD与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋 巴细胞，引起免疫应答。
2、种类和数量 一个抗原分子可以有一种或多 种不同的AD ，一种AD决定着一种特异性，多种 AD决定着多种特异性
隐蔽性AD.分子内部
B细胞决定簇：分子表面
T细胞决定簇：分子内部
三、共同抗原和交叉反应
两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性 抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗 原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为共同抗 原。
亲缘关系很近的生物之间存在的共同抗原称为 类属抗原。
无种属关系的生物之间存在的共同抗原称为异 嗜性抗原。
2. 特点 具有高度均一性。 3. 杂交瘤细胞
骨髓瘤细胞 — 无限增殖； 免疫B细胞 — 合成、分泌特异性抗体。 4. 杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。
三、基因工程抗体
基因工程抗体是通过PCR技术获得抗体基因或抗 体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所 产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和 治疗及基础理论研究等领域。
一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他 含有共同抗原的物质发生结合反应，称为交叉 反应。
3. 抗原的分类
根据抗原的性质分类：
• 完全抗原 • 半抗原
根据抗原与机体的亲缘关系分类：
• 异种抗原 • 同种异体抗原 • 自身抗原 • 异嗜性抗原
根据抗原刺激B细胞产生抗体是否需要T细胞 的辅助分类：
免疫分析方法
步骤：
A 将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙 烯小珠），经温育后清洗； B 加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则 与吸附的抗原结合，温育后清洗； C 加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附 的抗原抗体复合物结合，温育后清洗； D 加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用 光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。
1.2 免疫电泳
免疫电泳是一种将区带电泳和
双向免疫扩散相结合的免疫化
学分析技术。
实验原理
先将抗原样品在琼脂平板 上进行电泳，使其中的各 种成分因电泳迁移率的不 同而被分离成肉眼不可见 的区带。 停止电泳后，在与电泳方 向平行的槽内加入相应抗 血清，使抗原和抗体呈双 向扩散，已分离的各抗原 与相应抗体在琼脂中扩散 而相遇，在二者比例合适 处形成肉眼可见的沉淀弧。
（三）竞争法
酶联免疫吸附法ELISA
ELISA的基本原理和方法
ELISA的种类和变化 ELISA的特点 ELISA的应用实例
基本原理
ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）
基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反 应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 在这种测定方法中有3种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
B 加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与 吸附的抗体结合，温育后清洗； C 加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；
D 加入酶作用底物，产生显色反应，颜色 的改变与所加的待检标本溶液中的抗原 量成正比。
（二）间接法
间接法是检测抗体 最常用的方法，其 原理为利用酶标记 的抗抗体以检测已 与固相结合的受检 抗体，故称为间接 法。
免疫分析法
(2) 有机探针
荧光黄 常用的探针 荧光产率高，有较好的光稳定性和低的温度系 数。其缺点是斯托克斯位移较小。 在碱性的条件下，荧光黄与免疫球蛋白IgG的 自由氨基起反应. 罗丹明类化合物 广泛用来标记抗体 和荧光黄相比，其荧光产率不如荧光黄，可是 其发射波长较长，样品背景干扰较少。此外， 罗丹明类亦常作为能量转移的接受体。
(3) 金属螯合物
某些稀土金属离子会与某些配位体生成会发强荧光的配 合物。
如：Eu(Ⅲ), Tb(Ⅲ), Nd(Ⅲ)与 β-二酮衍生物 对-氨基甲酰三氟丙酮 聚氨羧酯盐 邻菲罗啉
2．荧光免疫检测法的类型
（1） 均质检测法
均质检测法不需要分离步骤，方法简便快速， 但它常受到来自背景（血清）的干扰，该法系 根据已标记抗原联接于抗体时发生已标记抗原 荧光性质的改变。通常将均质检验法分为：
酶不稳定、光度分析线性范围窄 。
竞争型酶联免疫法测定氯霉素含量示意图
四.发光免疫分析法
荧光免疫分析法 化学发光免疫分析法 以荧光物质或化学发光反应物质作为标记物。 优点： 专一性强 灵敏度高 稳定性好，可避免放射性污染 标记物不同，因而检测方法也不同
A．荧光免疫分析法 Fluonescense Immuuoassay 1．荧光探针 （1） 一般要求 a 检测最常遇到的样品为血清，它有很高的荧光
c. 荧光激发转移
如荧光黄作为给予体，罗丹明作为接受体，荧 光黄的荧光与罗丹明的吸收光谱重叠，后者可 吸收前者的荧光。 例：吗啡的测定
i) 用荧光黄（F）标记抗原 罗丹明（R）标记抗体 Ag+AgF+AbR (Ag-AbR) + (AgF-
AbR) Ag的存在减少了荧光的猝灭程度
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免疫学反应原理
单扩散
琼脂糖凝胶平板→打孔→点加样本→孵育(过夜) →观察沉淀线
可以定性，也可以定量应用：检测抗原抗体。
如免疫球蛋白测定
双扩散
琼脂糖凝胶平板→打孔(两两对应)→点加样本及对应抗原或抗体→孵育(过夜) →观察沉淀线
一般用于定性，也可观察抗原抗体有无交叉反应。
如抗原抗体的鉴定
免疫沉淀
在试管中加入抗原及抗体，混匀后孵育，观察沉淀的出现
环状沉淀：毛细管内进行。
如链球菌的血清学分型
对流电泳
操作类似于双扩散。
但在两侧施加电场，以加快免疫反应的速度。
适用于抗原抗体检测。
如乙肝表面抗原的检测
火箭电泳
类似于单扩散，但外加了电场，孔内所加抗原向一特定方向迁移，且迁移沉淀线的长度与抗原的浓度成正比，故可以定量。
如甲胎蛋白的检测。
血球凝集试验
将抗体或抗原结合在动物红血球（羊、牛、兔等）上（致敏），当致敏的红血球与相应抗原或抗体相遇时，发生肉眼可见的凝集。
也可制备反向血凝或血凝抑制试验。
血球在致敏前需要进行处理（鞣化），使之不易破坏，也更容易致敏。
如乙肝表面抗原的检测：成本低廉，检测灵敏度也高。
乳胶凝集
原理同血球凝集试验，但致敏的是乳胶颗粒，且试剂更易保存。
如细菌抗原的快速检测试剂。
补体结合试验
在抗原抗体反应的体系中加入新鲜制备的补体（豚鼠）以及指示系统（红细胞），当有相应的抗原抗体存在并发生反应时，激活补体，红细胞溶解。
若加入与人体的被测抗体相竞争的抗体时，被测抗体消耗掉大量抗原，而无能与指示系统中的抗体反应的抗原剩余，补体不被激活，红血球不被溶解：补体结合抑制试验。
如抗链O检测
金标记试验
以胶体金致敏抗原，当遇相应抗体时，与之结合并吸附在支持介质上，浓集后形成可见的红色。
一般用于快速试验，卡片式的反应体系方便易用。
但敏感性和特异性不足。
也有用胶体硒的。
如表面抗原、抗HIV等
免疫斑点试验
原理与金标记法类似，但标记的是酶，在抗原抗体结合后，标记在上面的酶可催化随后加入的显色系统，以出现黑色斑点为阳性。
免疫印迹
先将微生物抗原电泳分离，再通过免疫转印技术将琼脂上的抗原转染到硝酸纤维膜上并固定（可裁成小条供多个检测用）。
测定时加入人血清，血中抗体与膜上的抗原结合，再加入标记的抗体或生物素系统，最后是显色。
与相应特异抗原结合的位置上的显色即代表了有对应该相应抗原的抗体。
特异性较高。
如：抗HIV检测
免疫比浊
原理是在一定的反应体系中，抗原抗体的反应速度与其浓度相关。
测定体系中抗原抗体反应所引起的浊度变化速率即可间接测定体系中抗原或抗体的浓度。
一般用于全自动的免疫分析仪。
如免疫球蛋白的检测。
放射免疫
一般为竞争法：以放射性元素标记抗原，与待测抗原共同竞争与同时加入的抗体的结合，待测抗原越多，与抗体结合的标记抗原越少，存留的放射性就越低。
抗原的标记：琥珀酸酐法、O-（羧甲基）羟胺法
放射性元素的选择：碘125、碘131、氢3等。
检测放射性：γ计数仪
酶免试验
方法可有三明治夹心法、竞争抑制法、间接法、捕获法。
首先用抗体或抗原包被酶标板，加入待测标本，再加入用酶标记的抗原或抗体，也可以同时加入竞争的抗原或抗体，经过孵育、洗板的过程，最后显色，显色的程度与标本中抗原或抗体的浓度成正比或反比（竞争法）。
板、抗原、抗体、酶、酶的标记、洗涤、显色
化学发光：在反应体系中的物质通过化学反应生成一种激发态的中间产物，该产物在回到基态时可放出一个光子。
检测该光子即可间接测定反应体系中的物质浓度。
一般是将可发生发光反应的物质标记在抗体上。
常用的发光物质有：鲁米诺类、咪唑类、吖啶酯类、苯酚类及芳香草酸酯类。
电化学发光：发光试剂标记物是三联吡啶钌N羟基琥珀酰胺酯（NHS），另一个试剂是三丙胺（TPA）。
在阳极表面，上述两种试剂可同时失去电子发生氧化反应，二价的NHS标记物被氧化成三价，TPA被氧化成TPA+，TPA+极易转为强还原剂的自由基，将一个电子转给三价NHS标记物质，使其变为激发态，激发态标记物可发射一个光子后回到基态。
二者然后再参与下一轮反应。
应用：NHS可与蛋白、半抗原激素、核酸等各种化合物结合，故应用广泛。
免疫荧光：荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈极不稳定的激发态，在回到基态时，可以发出比激发光波长的荧光。
荧光素：异硫氰酸荧光素FITC，四乙基罗丹明RB200，四甲基异硫氰酸罗丹明TRITC
一般用在固相的方法上，如组织染色、荧光抗体法玻片检测微生物抗原。
流式细胞仪：是将流体喷射技术、激光技术、空气技术、γ-射线能谱技术及电子计算机技术与显微荧光光度结合的一种大型精密仪器。
它能过测量在一定波长的激光激发快速流动的粒子（细胞或微粒）发出的荧光和散射光来获得粒子的一些成分及其变化情况，并可对特定的细胞群体进行筛选。
抗原的制备
天然抗原：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、细菌毒素、酶及补体等
对天然抗原需进行分离（组织匀浆、酶消化等）纯化纯化的方法有：盐析、层析等。
人工抗原：多糖、多肽、甾体类激素等，需与载体结合才具有免疫原性。
连接的方法有戊二醛法、碳二亚胺法、琥珀酰亚胺吡啶二硫酚丙酸法等。
基因工程：特定抗原片段的表达、根据核苷酸序列推导合成相应编码的多肽抗原。
抗体的制备
沉淀：盐（或无水乙醇、辛酸等）沉淀→离心→透析去盐→分装保存
层析：分子筛层析、离子交换层析、亲和层析
单克隆抗体：每个B淋巴细胞只能产生一种针对它能够识别的特异性抗原决定簇的抗体，但淋巴细胞不能在体外无限期地分裂传代。
正常细胞的DNA合成有两条途径，一条主要途径，一条旁路。
杂交瘤细胞培养液中加入了（次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷）HA T三种药物，A可拮抗叶酸（主途径），而骨髓瘤细胞是筛选过的缺乏旁路必需的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），它只有和淋巴细胞结合以后才能通过旁路合成DNA生存下去。
单独的淋巴细胞也只能存活数代。
这样，杂交以后经过数代体外培养，培养孔内生能生存下来的细胞克隆就是二者杂交的克隆。
检测这些克隆的培养上清中有无抗体即可探知杂交是否成功。
基因工程：将能编码产生抗体的基因片段植入大肠杆菌或其它载体中，经大量培养，提取所需抗体。
标记物
ABC系统：avidin-biotin-peroxidase complex （链亲和素-生物素-过氧化酶-复合物）：生物素分子量较少，很容易将抗体生物素化。
亲和素分子量较大，一个亲和素可以结合数个生物素，二者的亲和力高且特异性好，可形成一个网状的结合。
主要用来增加抗原抗体的结合及放大反应。
亲和素一般用卵白亲和素、链亲和素孵黄亲和素以及类亲和素。
SPA：葡萄球菌A蛋白，是葡萄球菌菌壁上的一种不含糖的蛋白质，能与多种哺乳动物IgG的Fc段结合，常作为第二抗体的代用品。
与SPA的亲和力顺序为猪、狗、人、猴、豚鼠、小鼠、牛。
乳胶血球酶放射性元素
抗原抗体反应体系与未反应成份的分离：
板吸附→洗涤纤维素膜→渗透洗涤磁珠结合
均相反应：已反应的抗原抗体分子的空间结构发生改变→影响活性或结合能力。