两虫检测方法说明
出口蔬菜中杀虫双残留量检验方法
出口蔬菜中杀虫双残留量检验方法1.适用范围本方法适用于出口青菜中杀虫双残留量的检验。
2.原理概要用稀盐酸溶液提取试样中的杀虫双，在碱性条件下，以硫化钠作催化剂，使杀虫双转化为沙蚕毒素，然后用乙酸乙酯提取，液一液分配净化以后，用配有电子俘获检测器的气相色谱仪进行测定，外标法定量。
3.主要试剂和仪器3.1.主要试剂无水硫酸钠：分析纯，经650℃灼烧4h以上，置于干燥器内备用；乙酸乙酯：分析纯，经全玻璃系统重蒸馏；助滤剂：硅藻土(celite)545；盐酸：分析纯，配成0.1mol/L，2mol/L水溶液；氢氧化钠：分析纯，配成2mol/L，10mol/L水溶液；硫化钠：分析纯，配成0.2mol/L水溶液；杀虫双标准品：纯度≥99%；杀虫双标准溶液：准确称取杀虫双标准品，以蒸馏水配成0.1mg/mL的标准贮备液，用时根据需要用蒸馏水稀释至适当浓度的标准工作溶液。
3.2.仪器气相色谱仪：配备电子俘获检测器；微量注射器：1μL、10μL；高速组织捣碎机：配有捣碎杯；全玻璃系统蒸馏装置；分液漏斗：50mL、125mL；平底漏斗：9cm(内径)；抽滤瓶：500mL；刻度试管：具磨口塞，10mL。
4.试样的抽取与制备4.1.检验批以不超过1000件为一检验批。
同一检验批的商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、规格和等级等。
4.2.抽样数量批量，件最低抽样数，件1～25 126～100 5101～250 10251～1000 154.3.抽样方法按规定的抽样件数随机抽取，逐件开启。
每件至少取500g作为原始样品，其总量不少于2kg，放入洁净容器内，加封，标明标记，及时送交实验室。
4.4.试样制备从原始样品中取可食部分，用四分法缩分出不少于500g样品放入组织捣碎机中捣碎、混匀，均分成两份试样，装入洁净容器中，加封，标明标记。
4.5.试样保存将试样于－18℃以下冷冻保存。
注：在抽样及制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
饮用水水质标准中增加“两虫”检测的意义
论饮用水水质标准中增加“两虫”检测的意义摘要贾第鞭毛虫与隐孢子虫（简称“两虫”）是两种严重危害饮用水水质安全的病原微生物。
“两虫”具有个体微小，致病量低、感染途径和方式简单,流行分布广泛的特点。
人感染后出现呕吐、腹泻等症状，绝大多数抗生素无效，治疗依赖于人体自身的抵抗力。
目前水源性感染是其最大的感染源。
城市供水系统中的“两虫”直接威胁饮用水安全,并同时对城市水环境带来生态和健康风险。
在饮用水水质标准中增加“两虫”项目，可有效控制“两虫”病的传播，保障饮用水饮用水安全。
关键词贾第鞭毛虫；隐孢子虫；饮用水水质标准由供水系统污染所引起的水传播疾病时有暴发，对人类的健康构成直接威胁，不但对社会造成了巨大的经济损失，而且容易造成人们对供水系统安全性的质疑及恐慌。
而贾第鞭毛虫和隐孢子虫被认为是世界上最主要的导致人体腹泻的水源性原生动物寄生虫。
近年来，以饮用水为媒介引起的隐孢子虫病和贾第鞭毛虫病不断暴发，对饮用水安全构成严重威胁，对城市水环境带来生态和健康风险，已引起了包括我国在内的世界各国的关注。
美国疾病预防控制中心于1996年、2002年分别将隐孢子虫感染和贾第鞭毛虫感染列入国家必须申报的传染病名单。
我国也在2006年将“两虫”检测加入饮用水水质标准，规定每10L小于1个孢囊或卵囊[1]。
随着城市化进程的发展，城乡生活垃圾、生活污水和养殖业污水排放量迅速增加，部分人、畜、禽粪尿污染环境和水源，“两虫”感染介水传播的危险性亦随之增加。
因此积极开展净水工艺的改进及隐孢子虫和贾第鞭毛虫的控制技术，对于疾病控制的流行和发展、保证饮食安全、保障人民的健康等都具有重要的意义。
1贾第鞭毛虫和隐孢子虫的危害1.1生物学性质1.1.1贾第鞭毛虫蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia Lamblia Stiles,1915）简称贾第鞭毛虫，是一种寄生于人类和动物肠道的原生动物。
在人体中时，寄生于人体小肠、胆囊，主要于十二指肠，可引起腹痛、腹泻和吸收不良等症状，为人体肠道感染的常见寄生虫之一。
两虫概述
两虫”（隐孢子虫和贾第鞭毛虫）检测系统产品简介我公司推荐使用的Envirochek “两虫”检测方法是GB5749-2006国标和GB/T5750-2006《生活饮用水标准检验方法》测定生活饮用水和水源水中“两虫”的首选方法，也是GB/T5750-2006国标规定的两虫检测的仲裁法，同时也是美国EPA1623测定两虫的标准方法，是专门检测水中“两虫”的实验方法。
（注：“EPA1623方法”是由美国国家环保局制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的标准方法。
）概括地说,该方法分为三部。
第一，对水样进行过滤,收集水中的卵囊和孢囊；第二，利用免疫磁分离来纯化过滤样品；第三，对纯化的样品通过免疫荧光显微镜法来检测“两虫”的数量详细介绍1水样过滤采用美国EPA推荐的PALL公司Envirochek-HV囊式滤器对水样进行过滤，将卵囊、孢囊及其他物质收集在过滤器上。
该过滤器可用于实验室批量水样的过滤，也可以用于野外现场水样的过滤。
Envirochek囊式滤器特点及优点：EPA 1622 & 1623方法推荐首选产品，配合“多臂”洗脱震荡器，实现多样品检测，大大节省人力和时间。
1um孔径的改良滤膜能100%截留两虫,专用于源水（>50升）与自来水（>1000升）的两虫浓缩与回收。
一次性使用的一对一设计避免了污染而造成的实验结果误差。
简单的安装与拆卸省时省物，并且可以现场采样、异地检测。
2免疫磁分离IMS{Immuo Magnetic Separation}将离心后含有卵囊和孢囊的沉淀物用纯水混匀，并向其中加入免疫磁分离试剂进行磁分离。
其原理是：利用带有特异性抗体的磁珠与样品中的目标产物特异性抗原相结合，在磁场中高效选择性分离。
3 IFA 染色 & 镜检：将卵囊和孢囊在井形载玻片上用磁荧光标记的单性抗体和DAPI溶液着色后，用正置荧光和差分干涉相衬（DIC）显微镜对着色样本进行检测。
两虫检测方法说明
两虫检测方法说明一、虫情监测虫情监测是指通过设置虫情监测网、黄板、黄棒、诱捕灯等虫情监测器具，对田间作物中的害虫进行连续观察和记录，以获取害虫的信息，及时判断害虫的种类、密度和分布情况，为制定合理防控策略提供科学依据。
1.虫情监测网虫情监测网是由特定材料制成的具有较小网眼的网，可用于捕捉田间的害虫。
将虫情监测网张贴在农田中，通过害虫在网上活动时被捕捉，即可初步了解害虫的种类和数量。
根据该方法的监测结果，可以初步判断害虫发生的严重程度。
2.黄板、黄棒黄板、黄棒是一种颜色为黄色的卡片，涂有黏脂，可以诱捕害虫。
将黄板、黄棒张贴在农田中，害虫被卡片上的黏脂粘住，可以直接观察到害虫种类和数量。
常见的害虫如福寿螺、食蚜蝇等对黄色敏感，容易被黄板、黄棒吸引。
3.诱捕灯诱捕灯是一种利用光线特性吸引害虫的方法。
将诱捕灯设置在农田附近，利用灯光吸引害虫飞往灯光的特性，通过设定特定的高度和时间，将害虫吸引至灯光附近，然后通过捕捉器具进行捕捉和监测。
这种方法适用于一些飞行能力较强的害虫，如蛾类、夜蛾等。
二、害虫指标检测害虫指标检测是指通过采集农田中的农作物和虫体样本，使用特定检测方法对害虫进行分析，并通过结果判断害虫的发生情况和危害程度。
1.虫体采集虫体采集是害虫指标检测的第一步，可以通过人工采集、摄像机摄录等方式获取农田中的害虫信息。
针对不同类型的害虫，可以选择不同的采集方式和工具，如夜蛾可以在夜间使用灯光捕捉，福寿螺可以用笼子和饲料引诱。
2.害虫种类鉴定害虫种类鉴定是通过观察和比对采集到的害虫的外形特征，确定害虫种类的方法。
可以使用显微镜、专业的鉴定手册和数据库等工具进行鉴定。
通过识别害虫种类，可以了解其生物特性和危害程度，从而制定相应的防治策略。
3.害虫密度测定害虫密度测定是通过计数单位面积内害虫的数量，以便了解害虫种群数量和密度的方法。
可以使用虫体标本、摄像机采集的图像或者特定的统计设备进行准确计数。
根据害虫密度的测定结果，可以判断害虫对农作物的威胁程度，并制定具体的防治策略。
两虫资料
1 水中“两虫”检测方法概述浓缩→ 分离/纯化→染色 →检测2 镜检——不同模式下检查“两虫”450nm-480nm 蓝色滤光片，330nm-385nm 紫外滤光片。
FITC 模式下，单克隆荧光抗体与隐孢子虫卵囊和贾第虫包囊的表面蛋白相结合，蓝色激发光下发出绿色荧光；DAPI 与卵囊/包囊内的DNA 相结合，在紫外激发光下能看到卵囊/包囊的蓝色细胞核； 微分干涉DIC 模式下，能够看到卵囊和包囊的内部结构，从而进一步确认。
贾第虫：包囊呈椭圆形，直径8-15 µm ，宽5-8 µm ，在荧光显微镜蓝光激发下包囊壁发出苹果绿荧光；在紫外激发下，包囊内出现1-4个蓝色细胞核，在1000× DIC 能看到细胞核、中轴等内部结构。
隐孢子虫：卵囊呈圆形或椭圆形，直径4-6 µm ，在荧光显微镜蓝光激发下卵囊壁发出苹果绿色荧光；在紫外激发下，卵囊内出现1-4个蓝色细胞核，在1000×DIC 能看到子孢子、残体等内部结构。
PBS 是磷酸缓冲液的简称，不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释，原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH 缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH 的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS 是首选。
PBS 也不是万能的，有的生物活性物质需要的条件比PBS 还要高，就需要在平衡缓冲液中加入更多的成分，维持最佳的条件保证生物活性物质保持其最完整的特性。
pbs 缓冲液PBS 缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，具体试剂一般也有不同的比例配方，在针对性上就有了更好的效果。
含0.05%吐温－20的pH7.4的磷酸盐缓冲液(简称为PBS －T)配制方法为：称取磷酸二氢钾(KH2PO4)，磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)，氯化钠(NaCl)，氯化钾(KCl)，吐温－20 ，加水。
北京培训中心—两虫全流程
• 可采取虹吸，弃去上清。管子上插上枪头，使得震 动最小。
如何提高回收率
谨慎清洗玻片
• 隐孢子虫和贾第虫可能在染色过程被冲走，为了避 免此情况发生，请轻轻的移走玻片上的液体。
如何提高回收率
玻片干燥过程可影响回收率 • IMS过程中的酸如果没有有效中和可以破坏贾第虫的 孢囊外表，引起贾第虫染色过程中的变化。这可以导 致镜检过程中贾第虫的漏检。快速将样品干燥以及冷 藏样品可以保证贾第虫的表面不受损坏 。 • 为了优化此步骤，确保样品一旦中和后，快速在37℃ 条件下干燥（最长干燥时间1小时），并立即染色。 • 如果IMS中和后需要延迟染色，需要快速在37℃干燥 玻片后立即放入冰箱冷藏过夜。否则，需要在标准的 家用冰箱冷藏过夜。在冷室中干燥玻片可能由于湿度 环境使得玻片不易干燥。
样品预处理——过滤
实验室过滤
样品预处理——过滤
现场过滤
样品预处理——过滤
现场过滤——两虫移动取样箱
样品预处理——过滤
现场过滤——两虫移动取样箱 滤器 滤芯 采样管 水表 保温袋 自封袋
样品预处理——过滤
现场过滤——两虫移动取样箱 • 根据客户需要合理设计的取样箱。 • 解决现场采样问题，并使得现场采样操作简便。 • 解决部分无两虫检测设备的送样问题。
如何提高回收率
免疫磁分离
• 对于一些水样，很大一部分的隐孢子虫和贾第虫可能会遗漏 在IMS磁珠上，在酸化过程中没有得到回收。此时进行二次 酸化可以有效提高回收率。IMS分离过程中，二次酸化分离 非常有用。 • 对于回收率比较低没有满足回收率标准的样品，可以将其 IMS过程废弃的上清液进行收集，对这些废液再次进行免疫 磁分离过程，以满足回收率。可以将废液收集到免疫磁分离 之前用的 50mL的离心管中，这可以避免错误的标记样品， 你可以分辨哪个样品具有较低的回收率然后做一个二次的免 疫磁分离。非常多的干扰免疫磁分离的物质在第一次免疫磁 分离过程中都被去除掉了，所以第二轮免疫磁分离回收率可 能会戏剧性的更高。
两虫检测方法说明
隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的方法说明一、标准接种吸取2ml吐温-20稀释液（0.001%）加入标样管中，涡旋混匀后倒入乘有约1-2L纯水的广口瓶中，（标样共接种于10L水中，剩余水应在抽滤过程中分3次倒入）向标样管中加入3ml纯水，涡旋洗涤（并将标样管倒置，使管帽也被充分洗涤），将洗涤后标样管中的液体，倒入广口瓶中，重复5次。
将广口瓶放置在磁力搅拌器上，并向其中投入磁力搅拌子。
链接蠕动泵及过滤装置，开始过滤，流速控制在1-2L/min。
（清洗容器应使用纯水，不要使用清洁剂）二、样品的淘洗和浓缩1.准备缓冲液在开始混合缓冲液前，首先确定有多少样品进行淘洗，根据样品量配制缓冲液。
需要准备400ml纯水用于淘洗设备的预冲洗，每个样品至少需要400ml 缓冲液。
PS:配置1升淘洗液：在容器中加入8g NaCl,0.2g KCl,2.9g Na2HPO4以及0.2g KH2PO4溶在0.9L的试剂级纯水中。
调PH值到7.4。
加0.1ml吐温-20溶液到容器中再搅拌10分钟。
（注意：吐温-20溶液非常粘，应该用吸液管小心移出）2.转移到缓冲液瓶中缓冲液瓶包括一个10L瓶子和一个4L的瓶子，建议10L瓶子放淘洗液，4L瓶子用来盛放纯水。
3.初始化的系统检测在样品淘洗前用纯水代替缓冲液进行操作，用于检测设备系统可否正常使用，并可对系统内部的管路进行冲洗。
a.将一个未使用过的滤芯放入滤器中（这个滤芯如果只作为初始化系统检测及清洗管路时使用，可重复使用一个月）b.完成样品淘洗过程的1-8步。
c.在淘洗结束后将离心管里的液体倒掉。
d.把滤器从淘洗设备中取下，然后把出口分流调节装置从滤器上取下。
e.用70%的酒精擦洗QC干体。
f.进行正式的样品淘洗。
4.淘洗样品a.打开两虫淘洗设备的开关（开：电源开关——空气压力阀，关：空气压力阀——电源开关）打开空气压力泵。
绿色的灯（显示电源）和红色的灯（显示设备处于准备状态）会亮。
b.把500ml锥形离心管的盖子打开，并把它放到淘洗设备里的离心管支架上。
提高饮用水“两虫”检测回收率的方法探讨——Filta-Max xpress快速法
T echno logy科技科技文苑
隐孢子虫和贾第鞭毛虫（简称“两虫”）是严重危害水质安全的病原性原生动物，由于其对于通常的氯消毒过程具有较强抗性，因此《生活饮用水卫生标准》（ＧＢ ５７４９－２００６）中首次将“两虫”检测项目列入其中。
由于方法的特殊性，标准中规定两虫检测回收率合格标准最低仅为１０％。
为掌握检测要点，切实提高检测技能，对“两虫”检测过程中的关键步骤进行分步加标回收率测试，对影响回收洗、酸化分离步骤的分步回收情况进
行测试。
①用高浊度水样（环城河水、活
性炭混悬液）代替洗脱液测定Ｈｅｔｔｉｃｈ
Ｒｏｔａｎｔａ ４６０离心机离心效果，并对离
心后抽取的上清液进行二次离心。
②
将Ｇ－Ｃ质控样直接加入到装有４５０ ｍＬ
淘洗缓冲液的离心管中进行加标回收
率的测定。
③对加标水样的过滤模块
连续淘洗两次，分别测定两次淘洗的
回收率。
④测定免疫磁分离阶段加酸
能放在离心管的中心部位，不应贴到
管壁上。
图3 蓝色滤光片图4 紫外滤光片。
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隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测的方法说明
一、标准接种
吸取2ml吐温-20稀释液（0.001%）加入标样管中，涡旋混匀后倒入乘有约1-2L纯水的广口瓶中，（标样共接种于10L水中，剩余水应在抽滤过程中分3次倒入）向标样管中加入3ml纯水，涡旋洗涤（并将标样管倒置，使管帽也被充分洗涤），将洗涤后标样管中的液体，倒入广口瓶中，重复5次。
将广口瓶放置在磁力搅拌器上，并向其中投入磁力搅拌子。
链接蠕动泵及过滤装置，开始过滤，流速控制在1-2L/min。
（清洗容器应使用纯水，不要使用清洁剂）
二、样品的淘洗和浓缩
1.准备缓冲液
在开始混合缓冲液前，首先确定有多少样品进行淘洗，根据样品量配制缓冲液。
需要准备400ml纯水用于淘洗设备的预冲洗，每个样品至少需要400ml 缓冲液。
PS:配置1升淘洗液：在容器中加入8g NaCl,0.2g KCl,2.9g Na2HPO4以及0.2g KH2PO4溶在0.9L的试剂级纯水中。
调PH值到7.4。
加0.1ml吐温-20溶液到容器中再搅拌10分钟。
（注意：吐温-20溶液非常粘，应该用吸液管小心移出）2.转移到缓冲液瓶中
缓冲液瓶包括一个10L瓶子和一个4L的瓶子，建议10L瓶子放淘洗液，4L瓶子用来盛放纯水。
3.初始化的系统检测
在样品淘洗前用纯水代替缓冲液进行操作，用于检测设备系统可否正常使用，并可对系统内部的管路进行冲洗。
a.将一个未使用过的滤芯放入滤器中（这个滤芯如果只作为初始化系统检
测及清洗管路时使用，可重复使用一个月）
b.完成样品淘洗过程的1-8步。
c.在淘洗结束后将离心管里的液体倒掉。
d.把滤器从淘洗设备中取下，然后把出口分流调节装置从滤器上取下。
e.用70%的酒精擦洗QC干体。
f.进行正式的样品淘洗。
4.淘洗样品
a.打开两虫淘洗设备的开关（开：电源开关——空气压力阀，关：空气压
力阀——电源开关）打开空气压力泵。
绿色的灯（显示电源）和红色的
灯（显示设备处于准备状态）会亮。
b.把500ml锥形离心管的盖子打开，并把它放到淘洗设备里的离心管支架
上。
c.把分流调节装置连接到滤器上的QF干体装置上。
d.滤器的上端向下，把分流调节器放在离心管上，这时会有水从分流调节
器中流到离心管中。
e.把滤器上的QC主体连接到两虫淘洗装置上的QC肢体上。
f.确保缓冲液已经放在缓冲瓶中了。
确保有插管的瓶盖盖到缓冲瓶上，且
密封环完好，并把瓶盖拧紧。
g.按控制面板上的F1键开始两虫淘洗过程。
h.淘洗过程结束后，把滤器从淘洗设备上取下，然后把出口分流调节器从
滤器上取下。
i.把滤芯从滤器中取出，并丢弃（通常经过高压处理后再弃掉）。
j.盖上离心管并从淘洗设备中取出。
k.用酒精清洗QC干体装置。
l.进行下一个样品淘洗。
m.用纯水代替缓冲液清洗残留在设备内部管路中的缓冲液。
如果超过一周不使用淘洗设备需将设备中的水排干，将瓶中的水倒掉，空抽一次。
5.离心浓缩及转移浓缩液
a.离心机应放在牢固的工作台或地板上，尽量减少晃动。
b.平衡对称的离心管，和适配器、离心桶一起平衡，重量差别不超过0.5g，
尽量减少摆动。
注意：如果离心管不被平衡则会产生额外的震动，影响
到目标物的沉淀。
c.设置离心机参数2000g，15min。
样品在离心机中自然惯性停止，不可使
用刹车系统急停。
d.用真空泵或蠕动泵吸取离心管中的上清液，在进口处装一个移液枪头（如
5ml枪头）以减少进口的真空力度。
最终留取5-8ml（可预先在管上做好
标记）。
流速控制在200±20ml/min。
注意把移液管放到液面中心，接近
液面处上吸取上清液，以减少沉淀的损失。
e.将离心管中的剩余的浓缩液在涡旋混合器上混匀20秒。
f.用缓冲液润洗移液枪将所有液体转移至L型试管中。
（注意：移液枪头需要用缓冲液润洗下，是为了避免移液管壁因干燥而
将两虫挂壁。
）
g.使用纯水清洗两次移液管（如剩余体积为7ml,则每次1.5ml）,并将清洗
液移入同一个L型试管中，每次冲洗后都要我选20秒再移出液体。
三、两虫的捕获
★隐孢子虫/贾第鞭毛虫磁珠分选试剂盒：10XSL TM-BufferA，10XSL TM-BufferB,Dynabeads anti-Cryptosporidium—隐孢子虫磁珠，
Dynabeads anti—贾第鞭毛虫磁珠。
a.配制1XSL TM-BufferA溶液：向900ul蒸馏水加入100ul 10XSL TM-BufferA。
b.向L型试管内加入1ml的10XSL TM-BufferA（10XSL TM-BufferA在0-4℃
储存时可能会有结晶析出，使用前将其放置在室温下充分溶解）。
c.向L型试管内加入1ml的10XSL TM-BufferB。
d.将隐孢子虫磁珠用涡旋振荡混合器混匀后量取100ul加入到L型试管内。
e.将贾第鞭毛虫磁珠用涡旋振荡混合器混匀后量取100ul加入到L型试管
内。
f.盖上L型试管盖，将其放置在DYNAL MIX混合器上，室温下混匀孵育
1小时（这期间主要是磁珠对虫卵的捕获）。
g.孵育结束后，将L型试管移至DYNAL MPC-1磁极上，试管的平坦面朝
向磁极。
h.将磁极持续呈90度角转动2分钟。
i.打开试管盖将上清液缓缓倾倒出去（注意此时磁极和L型试管不可分离）。
j.将L型试管从磁极上取下，加入1ml的1XSL TM-BufferA与试管内磁珠混匀（注意：此时不要使用涡旋混合器，为了进行充分的清洗，可以将这
1ml试剂分成2-5次加入）。
k.将所有的液体和磁珠转移至1.5ml微型离心管（即EP管）内。
l.将EP管放置在DYNAL MPC-S磁极上。
m.将磁极持续呈180度角转动1分钟。
n.打开盖子，将上清液缓慢吸出，包括盖子上的液体也一并析出（此时磁板和磁极不可分离）。
o.将磁板从DYNAL MPC磁极上取下，并向EP管内添加50ul0.1N HCl，使用涡旋混合器混匀10秒钟。
p.将EP管在室温下放置10分钟，再涡旋混合10秒钟，将EP管插回到插有磁板的MPC-S磁极上，静置10秒钟，吸取上清液。
q.准备一个载玻片，向槽内添加5ul 1N NaOH。
将上述EP管内的溶液全部转移至凹槽内。
（此时不要从磁极上取下，转移过程中不要碰贴壁的磁珠）。
r.可以在室内自然干燥，准备进行染色。
s.如有需要可另取载玻片重复进行p—s步骤1-2次，以提高回收率。
四、隐孢子虫和贾第鞭毛虫荧光染色
★染色荧光试剂盒：Easy stain单克隆荧光抗体染色剂，fixing Buffer 洗脱染色液，DAPI核染色剂，mounting mediun封固剂，阳性对照物，
单孔载玻片。
a.当样品干燥完毕，下一步使用一滴甲醇进行固定（约50ul），静置若干分
钟至完全干燥。
b.向载玻片上加一滴Easy stain将这滴液体用玻璃棒引它覆盖于整个井形凹
槽，但是千万不要碰到载玻片上的两虫。
c.把载玻片放入一个潮湿的容器内，室温至少放置40分钟（可以适当延长，
过夜也可）。
如果放入37℃培养箱则需要放置30分钟。
d.吸掉其表面的多余液体，加入50ul的fixing Buffer静置2分钟。
吸掉
多余的液体。
e.加入50ul的DAPI染色稀释液（注意需要稀释5000倍，即2ul—10ml，
现用现配），并放置1分钟。
吸掉多余水分，加1滴fixing Buffer,1分钟后再吸掉多余的水分。
（注意不要使涂片干燥）
f.加一滴mounting mediun，加上盖玻片，并用棉纸吸掉多余的液体。
在盖
玻片周围涂上透明的指甲油。
g.记录下时间和日期。
如果涂片不马上进行镜检则将其放置0-8℃的潮湿黑
暗环境中。
h.试剂盒储存在4℃的冰箱内，切勿冷冻。
五、结果判读。