hcy生产工艺研究

同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法） 主要生产工艺及反应体系的研究资料 设计思想：同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）原理为样本中的同型半胱氨酸被转化为游离型后，通过与共价底物反应，产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH）转化为NAD+，样本中的同型半胱氨酸的浓度与NADH的变化成正比。 同型半胱氨酸测定试剂盒（酶法）主要生产工艺过程的研制及试剂盒反应体系的建立主要分为三个部分即：生产工艺(主要是试剂配方)的研制、试剂盒组成的研制、试剂盒反应体系的建立。 产品拟定标准： 准 确 度： 以本公司制备的质控品为检测样本时，测定值相对偏差R≤20%; 线 性 范 围： Hcy试剂在拟定线性范围内，回归系数r应不小于0.990;

分析灵敏度： Hcy含量为10umol/L时，测定吸光度变化率(减掉试剂空白吸 光度变化率) △A ≥0.002Abs/min 测量精密度： 用质控品重复测定10次，测试所得的结果，变异系数CV≤10% 1．主要生产工艺描述及确定依据 1.1试剂配方的确定依据 由于生化试剂的特殊性，所谓主要生产工艺参数的确定即是试剂配方的确定。试剂处方的确定依据主要来源： Pastore A，et al. Fully automated assay for total homocysteine, cysteine, cysteinylglycine, glutathione, cysteamine, and 2-mercaptopropionylalycine in plasm and urine. Clin. Chem, 1998,44(4) :825-829 1.2试剂配方的研制 根据产品的性质，将试剂设计为双试剂。其中R1主要成分为tris缓冲液，S-腺苷甲硫氨酸盐、β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性、三（2羧乙基）磷氯化氢、α- 酮戊二酸、修饰化Hcy甲基转移酶、谷氨酸脱氢酶，R2主要成分为tris缓冲液、修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶、腺苷脱氨酶。 1.2.1基础配方的研制 1.2.1.1实验方案：根据正交实验的原则，设计具体方案如下: R1试剂： ph7.5 配方一：tris缓冲液 100mmol/L

S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.2mmol/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.3mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.7mmol/L α－酮戊二酸 4.0mmol/L 修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 3.0KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 5.0KU/L

配方二：tris缓冲液 100mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.3mmol/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.1mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.6mmol/L α－酮戊二酸 5.0mmol/L 修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 4.0KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/L

配方三：tris缓冲液 100mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.1mmol/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.2mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.5mmol/L α－酮戊二酸 5.0mmol/L 修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 5.0KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/L

配方四：tris缓冲液 100mmol/L S-腺苷甲硫氨酸盐（SAM） 0.05mmol/L β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原性（NADH） 0.1mmol/L 三（2羧乙基）磷氯化氢（TCEP） 0.3mmol/L α－酮戊二酸 6.0mmol/L 修饰化Hcy甲基转移酶（HMTase） 15KU/L 谷氨酸脱氢酶（GLDH） 10.0KU/L R2试剂：ph7.5 配方一：tris缓冲液 100mmol/L 修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 2.5KU/L 腺苷脱氨酶 4.0KU/L

配方二：tris缓冲液 100mmol/L 修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 3.0KU/L 腺苷脱氨酶 5.0KU/L

配方三：tris缓冲液 100mmol/L 修饰化S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）水解酶 3.5KU/L 腺苷脱氨酶 5.5KU/L 1.2.1.2实验方法 按照以上配方分别进行试剂配制，并按产品标准的要求，用本公司生产的工作校准品和质控品按照以下方法进行检测。比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。

加入物 空白管 标准管 标本管 DH2O 13ul 标准 13ul 样本 13ul R1 240ul 240ul 240ul 混匀，37℃温育5分钟 R2 65ul 65ul 65ul 加入R2混匀，温育180秒后，连续监测2分钟的吸光度变化值(△A/min)

1.2.1.3实验结果 R1 R2 配方组合 线性相关系数 分析灵敏度 准确性 精密度 R1(一) R2(一) 0.9835 0.012 5.90% 5.18%

R1(二) R2(一) 0.9877 0.014 4.99% 4.95%

R1 (三)R2(一) 0.9892 0.015 4.06% 4.76%

R1(四) R2(一) 0.9916 0.013 3.45% 3.75%

R1(一)R2(二) 0.9943 0.019 2.91% 3.32%

R1(二) R2(二) 0.9960 0.025 2.86% 3.25%

R1 (三)R2(二) 0.9989 0.031 2.29% 2.21%

R1(四) R2(二) 0.9971 0.026 2.55% 3.22%

R1(一)R2(三) 0.9929 0.029 4.12% 3.84%

R1(二) R2 (三) 0.9938 0.016 4.26% 4.00%

R1 (三)R2(三) 0.9902 0.022 4.72% 4.72%

R1(四) R2(三) 0.9896 0.021 6.41% 6.04%

1.2.1.4实验结论 结果显示R1配方(三)与R2配方(二)进行组合时试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他组合，因此基础配方R1试剂均按照配方(三)、R2试剂均按配方（二）进行配制。 1.2.2试剂最适pH值的确定 1.2.2.1实验方案： 根据pH值对酶活性以及试剂反应速率的影响，R1和R2试剂设计了以下三种pH值： R1试剂 pH：7.0、7.5、8.0 R2试剂 pH: 7.0、7.5、8.0 分别按照基础配方配制三种不同pH值的R1和R2试剂，按照1.2.1.2的实验方法，比较各试剂的线性相关系数、分析灵敏度、准确性、精密度。 1.2.2.2实验结果：

R1 pH R2 pH 线性相关系数 分析灵敏度 准确性 精密度 7.0 7.0 0.9854 0.016 7.55% 6.72% 7.5 7.0 0.9917 0.013 4.10% 5.83% 1.2.2.3实验结论： 结果显示，当R1试剂的pH值为7.5和R2试剂的pH值为7.5时，试剂线性相关系数、精密度、准确性、分析灵敏度数值优于其他pH值；因此，最后确定试剂R1试剂的pH值为7.5和R2试剂的pH值为7.5。 1.2.3稳定剂 1.2.3.1实验方案 稳定剂BSA主要用于试剂的保护。在基础配方R1、R2加入不同浓度的稳定剂，其它原料按基础配方进行配制；将R1、R2置于37℃水浴箱中，按照1.2.1.2的实验方法，分别在0小时、48小时、96小时、144小时进行检测，比较各试剂的分析灵敏度的变化。 基础配方R2稳定剂的浓度分别按0g/L、0.5g/L、1.0g/L、 1.5g/L进行配制。 1.2.3.2实验结果 稳定剂浓度 分析灵敏度 0小时 48小时 96小时、 144小时 0g/L 0.030 0.026 0.022 0.018

0.5g/L 0.031 0.030 0.029 0.029 1.0g/L 0.030 0.028 0.025 0.023 1.5g/L 0.030 0.028 0.024 0.021 1.2.3.3实验结论： 结果显示当稳定剂的浓度为0.5g/L时，试剂分析灵敏度数值优于其他浓度；同时实验显示，稳定剂的浓度过高，会影响试剂的灵敏度。因此，最后确定试剂R1、R2加入稳定剂的最佳浓度为0.5g/L。

8.0 7.0 0.9873 0.024 4.19% 4.76% 7.0 7.5 0.9914 0.025 4.02% 3.73% 7.5 7.5 0.9988 0.030 2.58% 2.16% 8.0 7.5 0.9923 0.023 3.78% 4.42% 7.0 8.0 0.9903 0.024 4.13% 4.74% 7.5 8.0 0.9884 0.020 4.78% 5.04% 8.0 8.0 0.9810 0.018 6.02% 6.54%