即用型细菌冻存液
菌(毒)种保存及复苏技术
菌(毒)种保存及复苏技术
· ２４３ · 〔综述〕
马洪波 冯子力 谭 华 （ 珠海出入境检验检疫局， 珠海 ５１９０１０）
摘要 微生物是重要的 生 物 资 源 ， 保 存 微 生 物 的 目 的 ， 不 仅 使 微 生 物 菌 株 保 持 着 原 有 的 生 命 力 、优 良 生 产 性 能 、 形态特征， 并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持不变， 为后人能更好地应用先进技术开发和运用微生 物， 为人类造福。为此， 对菌（ 毒） 种保存的原理以及复苏技术， 包括冷冻干燥保存法、超低温冰箱保存法、液氮保存法、 传代培养保存法、载体保存法等技术的操作步骤进行介绍， 为同行作为参考。
病 毒 是 非 细 胞 形 成 的 生 命 体 ， 仅 有 ＲＮＡ 或 ＤＮＡ 一 类 简 单 分 子 ， 有 时 甚 至 仅 有 基 因 片 段 ， 包 含 一种或多种蛋白质。一般来说， ＤＮＡ 病毒比 ＲＮＡ 病 毒更稳定， 但 ２ 种病毒都能较稳定地保存。许多病毒 可在 ４℃保存 １ 个月， 而在较低的温度下可保存 １ 年 以上而无需要特别的冷冻技术， 因病毒结构简单， 体 积小， 不含水分。
中国国境卫生检疫杂志 ２００６ 年 ８ 月第 ２９ 卷第 ４ 期 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｆｒｏｎｔｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ａｕｇ．２００６，Ｖｏｌ ２９，Ｎｏ．４
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煮沸 ２～３ 次， 每次 １０～３０ｍｉｎ， 备用。 ２．３．３ 微生物保存物的准备 在最适宜的培养条件 下将细胞培养至静止期或成熟期， 进行纯度检查后 （ 参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文 件《微生物菌种纯度检测技术规程》） ， 与保护剂混合 均匀， 分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于 １０８～１０１０ 个／ｍｌ 为宜。
实验室常用液体配制标准操作规程
常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至7.4(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至1.5％，高压蒸汽灭菌15min后使用。
3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。
4、2.5%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含0.5g卡那霉素。
取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用0.22滤膜过滤除菌后再分装。
5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。
剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备（Hanahan法）什么是感受态细胞？野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。
经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。
那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。
这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。
制备的关键因素：1.所用转化缓冲液的试剂纯度用高纯度的水和二甲亚砜（DMSO）制备感受态细胞是最重要的，包括细菌培养基在内的某些试剂会随着储存期的延长而降低效能。
无论何时，尽可能用新买的试剂和生长培养基。
2.细菌的生长状态由于未知的原因，最高的转化效率总是用从直接取自冻存于-70℃的储备菌中直接培养获得的，因此，不应该使用在实验室连续传代或存放于4℃或室温的培养物。
3.玻璃和塑料器皿的清洁微量的洗涤剂或其他化学物质会大幅的降低细胞转化效率，因此最好建立一批只用于制备感受态细胞而不用于其他目的玻璃容器，这些玻璃器皿应用手来刷洗，并且用纯水（Mini-Q 或相当的水）充满，再经高温高压消毒。
水在玻璃器皿使用前应倒掉。
注意：很多手工操作后用来消毒的塑料器皿和滤膜上是含有严重影响转化效率的洗涤剂的。
材料缓冲液和溶液二甲亚砜DMSODnD溶液（DMSO和DTT）DTT（二硫苏糖醇）1.53gDMSO 9ml1mol/L乙酸甲（PH7.5）100μl 加水补至10mlDnD溶液可用耐受有机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。
转化缓冲液标准的转化缓冲液（TFB）现用现配。
冻存的缓冲液（FSB）用来冻存（-70℃）感受态细胞培养基SOB琼脂板含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁和适量的抗菌素SOB培养基含20mmol/L（标准的含量为10)硫酸镁SOC培养基每次转化反应需要1ml的SOC培养基核酸和寡核苷酸质粒DNA（重组质粒）离心机和转头Sorvall GSA转头或与之相当的转头专用设备液氮预冷的聚丙烯离心管（50ml）预冷的聚丙烯离心管（17*100mm；Falcom2059）预置的40℃水浴载体和菌种冻存的做转化用的大肠杆菌（该菌种需在-70℃下保存）方法和步骤（重要：本方案中的所有步骤均应在无菌条件下进行）细胞制备1.转化缓冲液的制备若制备立即使用的感受态细胞可用FTB。
实验室常用液体配制标准操作规程
v1.0 可编辑可修改常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至％，高压蒸汽灭菌15min后使用。
3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。
4、%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。
取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。
5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。
剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。
军团菌的分离培养与鉴定福建省疾病预防控制中心
1990
Legionella gresilensis
2001
Legionella cherrii
1985
Legionella adelaidensis
1991
Legionella rowbothamii
2001
Legionella erythra
运输包装分类
学名
中文名
大量活菌操作
动物感染实验
样本 检测
非感染性材料实验
A/B
UN 编号
Legionella pneumophila
嗜肺军团菌
第三类
BSL-2
ABSL-2
BSL-2
BSL-1
B
UN 3373
样本的采集和运输
〔一〕标本的种类 〔二〕标本的运输和相关生物平安要求
标本的种类
环境水标本：空调冷却塔水、冷凝水,温泉水,淋浴水, 加湿器水； 病人组织标本:如痰,支气管灌洗液,胸水,血液等标本。 1983年新疆从一瘫患羔羊后肢中别离到军团菌。
样品浓缩
离心 过滤
接种
酸处理 热处理
水样的正压膜过滤法
安放滤膜； 过滤； 取膜； 洗膜。
水样的离心
将200ml左右样品倒入容积为300～500ml的无菌离心瓶中； 6000g离心10min，或者3000g离心30min，离心温度在15～25℃之间； 无菌操作去除上清； 用5～20ml溶液或无菌蒸馏水将沉淀重悬。
标本的运输和相关生物平安要求
在周围环境温度下运送水样标本,不必冷冻,但要防止受热和阳光,标本要尽可能快或最好在两天内送到实验室,室温下(21+3℃)贮藏在实验室或其他地方。 对于临床标本，最好立即做预期实验，如不能马上进行，应放在-20℃冻存备用。
实验室常用液体配制标准操作规程
常用液体配制标准操作规程（SOP）国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心二〇〇八年九月修订目录一、细菌培养系统（责任人：郑子峥）二、DNA操作系统（责任人：罗文新、陈瑛炜）三、蛋白质操作系统（责任人：李少伟、顾颖、潘晖榕）四、细胞培养相关（责任人：程通、张涛）五、单克隆抗体制备系统（责任人：陈毅歆、）六、EIA系统（责任人：葛胜祥、熊君辉）一、细菌培养系统1、LB培养基:每1000mL加分析纯NaCl 10g ，蛋白胨 10g，酵母粉5g，用ddH2O 配制，再用10M NaOH调pH至(1000mL一般加450ul)，高压蒸汽灭菌15min冷却后使用。
2、固体培养基:LB培养基中加入琼脂至％，高压蒸汽灭菌15min后使用。
3、10%(g/V) 氨苄青霉素钠（Ap）：注射用氨苄青霉素钠（粉末）50g溶于500ml无菌去离子水中，溶解后分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的氨苄青霉素粉末不是无菌包装的，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。
4、%(g/V)硫酸卡那霉素（Kan）注射用硫酸卡那霉素（液体）通常是2ml/支，内含卡那霉素。
取25支药剂（50ml），加入450ml无菌去离子水中，分装入4ml灭菌的EP管，全程超净工作台内操作，避免染菌，分装后－20度保存，培养细菌时做1000×使用。
注：如果购买的卡那霉素是粉末状的非无菌包装，溶解后需用滤膜过滤除菌后再分装。
5、细菌培养：配制相应抗性培养基，每试管倒入3~4ml培养基（卡那霉素抗性培养采用标记试管），无菌牙签挑取单克隆至试管中，于37℃，220rpm 培养。
剩余培养基做好抗性和日期标记，置于4℃保存。
6、化学感受态制备：1）原理:：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，这时的菌细胞称为感受态细胞（Competent cell）。
将细菌置于0℃，低渗CaCl2 溶液中时，菌细胞壁和膜的通透性增强，菌体膨胀成球型。
2015版药典菌种传代 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
2015版药典菌种传代中国药典2010年版二部及菌种使用说明书导读:就爱阅读网友为您分享以下“中国药典2010年版二部及菌种使用说明书”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对的支持!依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书1.标准菌的来源标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。
黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。
中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签1CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。
2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。
接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。
在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。
在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。
新购入的0代原始菌种储存于,20?，有效期为三年。
从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。
储存于2, 8 ?，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基2改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮.液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮.营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮.3.3操作步骤:a.打开洁净工作台。
b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
菌种的传代保藏
生化反应：氧化酶试验（＋）（培养物呈粉红色渐变为 紫红色）
绿脓菌素试验（＋）（盐酸溶液呈粉红色）
铜绿假单胞菌—琼脂平板的形态
铜绿假单胞菌—鞭毛染色形态
生孢梭菌
形态特征： G＋粗大芽胞杆菌、但在陈旧培养物中菌体 革兰染色为阴性 ，芽胞正圆形或卵圆形，直径大于菌体， 位于军体中央或近端，有周身鞭毛，能运动。
wwwthemegallerycom菌种菌种培养基培养基保存条件及时间保存条件及时间大肠埃希菌大肠埃希菌营养琼脂培养基营养琼脂培养基44保存保存23个月个月金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌营养琼脂培养基营养琼脂培养基44保存保存23个月个月枯草芽孢杆枯草芽孢杆营养琼脂培养基营养琼脂培养基44保存保存36个月个月铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌营养琼脂培养基营养琼脂培养基室温室温沙门菌沙门菌营养琼脂培养基营养琼脂培养基44保存保存23个月个月硫乙醇酸盐培基硫乙醇酸盐培基446保存保存66个月以上个月以上白色念珠菌白色念珠菌改良马丁培养基改良马丁培养基44保存保存46个月个月黑曲霉黑曲霉改良马丁培养基改良马丁培养基44保存保存4个月个月wwwthemegallerycom取铜绿假单胞菌大肠埃希菌金黄色葡萄球菌沙门菌枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤培养基中生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中置3537细菌培养箱培养1824h
培养特性：为需氧或兼性厌氧，营养要求不高，在普通营 养琼脂培养基上形成较大的圆形或不规则的、表面粗糙、 可有皱褶、菌落下面可形成红色色素的灰白色菌落。在营 养肉汤培养基中形成菌膜,很少混浊或不混浊。
分离培养：营养琼脂平板 血琼脂平板
枯草芽孢杆—琼脂平板的形态
枯草芽孢杆—显微镜下菌体形态
菌种的复苏传代及保存标准程序之欧阳家百创编
菌种的复苏传代及保存标准程序欧阳家百（2021.03.07）目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。
范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。
职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。
内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。
操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经121℃30分钟高温灭菌处理。
1.菌种的复苏1.1冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0代)。
使用前需将其复苏。
1.1.1准备：①用具：灭菌1ml滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉汤培养基或改良马丁培养基）、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。
③消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或84消毒液等。
1.1.2操作：1.1.2.1将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。
1.1.2.2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。
1.1.2.3点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。
1.1.2.4取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1.1.2.5另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。
用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1.2.6将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在30~35℃，真菌在23~28℃）培养24h。
1.1.2.7取出培养物（第1代），仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。
如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。
1.2为保证工作用菌株的传代次数不超过5代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第1代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第2代培养物冻存保藏。
ArcticExpress(DE3)RP化学感受态使用说明
ArcticExpress(DE3)RP化学感受态ArcticExpress(DE3)RP Chemically Competent CellArcticExpress(DE3)RP化学感受态细胞基本信息：ArcticExpress(DE3)RP基因型:E. coli B F– ompT hsdS(rB– mB–) dcm+ Tetr gal λ(DE3) endA Hte [cpn10 cpn60 Gentr] [argU proL Strr]ArcticExpress(DE3)RP菌株介绍：ArcticExpress细胞可以解决细菌基因表达中常见的蛋白质不溶解障碍。
这些细胞衍生自高性能BL21-Gold感受态细胞，使异源蛋白质在大肠杆菌中高效高水平地表达。
在大肠杆菌中异源蛋白的强行高水平表达可导致大量不正确折叠蛋白质的产生，出现被称为包涵体的无活性蛋白聚集体。
而聚集蛋白可能很容易纯化，要从包涵体得到活性蛋白质通常需要蛋白特异性和劳动密集型的体外重折叠步骤，同时也不保证获产物具有生物活性。
通过ArcticExpress系列感受态细胞提供的体内方法可以提高在大肠杆菌中可溶性蛋白质的产率。
在标准培养温度下嗜温宿主大肠杆菌广泛适合于异源蛋白质的表达，然而，异源蛋白质的高水平表达可损害细胞处理该重组蛋白质的能力。
低温培养是一种用于增加可溶性蛋白的策略。
但这种方法的一个缺陷是大肠杆菌伴侣蛋白（结合蛋白质促进蛋白质稳定折叠或部分折叠）会在较低的温度下失去活性。
实验已经表明，在12℃大肠杆菌的大肠杆菌伴侣蛋白复合物的GroEL / ES仅保留约30％的重折叠的活性，而30℃才是它的最适温度。
为了克服这个障碍，ArcticExpress能干细胞经过了低温下的蛋白改造。
这些细胞可以表达对低温适应的伴侣蛋白Cpn10和Cpn60（来自于嗜冷菌，Oleispira antarctica）。
Cpn10和Cpn60伴侣蛋白相对于大肠杆菌的GroEL和GroES伴侣蛋白，分别有74％和54％的氨基酸同一性，并且在4-12℃显示出较高活性。
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即用型细菌冻存液
简介：
Leagene即用型细菌冻存液可以用于各种常见细菌的冷冻保存。通常-20℃可以保存
菌种12个月，-70或-80℃可以长期保存。Leagene自主研发的即用型细菌冻存液经高压
灭菌处理，无需把待保存的细菌沉淀用细菌冻存液重悬，直接加入后混匀即可。
组成：
自备材料：
1、 无菌离心管或冻存管
2、 移液器吸头
操作步骤(仅供参考)：
1、用LB等液体培养基培养细菌至对数生长期。
2、取无菌冻存管或离心管，按菌液:即用型细菌保存液混合，充分混匀。
3、-20℃或-80℃冷冻保存细菌。
4、冻存细菌的使用请参考DH5α菌种的使用方法。
注意事项：
1、细菌冻存液必须在超净台内使用，以避免杂菌污染。
2、细菌冻存液与细菌需混匀，否则无法起到在低温冷冻条件下对细菌的保护作用。
3、新鲜的对数期细菌冻存效果最好，但非对数期的或不是新鲜培养的细菌也可以用本细菌
冻存液冷冻保存。
4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
编号
名称
NZ0011 Storage
即用型细菌冻存液 50ml RT
使用说明书 1份