好氧反硝化细菌培养基配制
好氧反硝化细菌的筛选及培养条件的初步研究
３ １０ ； ． 江 师范 大 学 行 知 学 院 ， 江金 华 ２０ ４ ３ 浙 浙
摘 要： 通过涂布平板 分离 法从 养殖水体 污泥 中共 分离 到 １ ２株好氧反硝化细菌 ， 通过反硝化 能力 的测定 ， 中筛选 出 从 １ 株具有较强反硝化作用 能力 的菌株 （ ２ ， 以此 为研究对象 ， 行最适培养基 、 Ｄ ）并 进 生长温度及菌体浓度 的测定。结果表明菌 株Ｄ ２的最适培养基为硝酸盐培养基 ， 最适生长温度为 ３ ｃ ７。左右 ， 在最适培养条件下最高生长浓度为 ４２ ｌＳ Ｌ ．ｘ Ｏ／ 。 ｍ
．
ｇ ｏ ｔ ｅ ｅ ａ ｕ ｅ ｆ ｒ ａ ｒ ｂ ｃ ｄ ｎ ｔ ｆ ｉｇ ｂ ｃｅ ｉ ．Ｄ２’ ｘ ｍｕ ｃ ｎ ｅ ｔａｉ ｎ ｕ ｄ ｒ ｏ ｔ ｌ ｇ ｏ ｔ ｒ ｗ ｈ ｔ ｍｐ ｒ ｔ ｒ ｏ ｅ ｏ ｉ ｅ ｉ ｉ ｎ ａ ｔ ｒ Ｄ２ ｒｙ ａ ｓ ｍａ ｉ ｍ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｎ ｅ ｐ ｉ ｒ ｗ ｈ ｏ ｍａ
ｔ ｅ ｔａ ｎ ｈ ｓｒ ｉ Ｄ２’ Ｔ ｅ ｒｓ ｌ ｈ ｗ ｔａ ｉ ａｅ ｉ ｈ ｓ ｓ ｉ ｂｅ ｍｅ ｉｍ．ａ ｄ ３ ℃ ｉ ｈ ｓ ｓ ｉ ｂ ｅ Ｓ ｈ ｅｕｔ ｓ ｏ ｈ ｔｎｔ ｔ ｓ ｔｅ ｍｏ ｔ ｕ ｔ ｌ ｄｕ ｓ ｒ ａ ｎ ７ ｓ ｔｅ ｍｏ ｔ ｕｔ ｌ ａ
ｂ ｄ ｓ ｇ ｔｅ ｓｒａ ｌｔ ｍｅ ｏ ．Ｏ ｅ ｏｙ ｕｉ ｈ ｐｅ ｄ ｐａｅ ｔ ｄ ｆｔ ｍ，ｏ ｅ ｓ ａ （ ２ ｉ ｔ ｎ ｅｔｄ ｎｔｆ ａ ｏ ａ ａｉ ａ ｎ ｈ ｈ ｎ ｔ ｉ Ｄ ）ｗ ｔ ｓ ｏｇ ｓ ｅ ｉ ｉｅｔ ｎ ｃｐ ｃ ｙ ｗ ｓ ｒｎ ｈ ｒ ｒ ｉ ｉ ｔ
第２ ７卷 第 ４期
好氧反硝化细菌培养基配制
好氧反硝化细菌培养基配制以及实验方法一、好氧反硝化培养基（液体）醋酸钠/ 0.5 g ; KNO3 / 0.1 g ; K2HPO4 / 0.01g ;MgCl2/ 0. 02 g ;CaCl2/ 0. 01g ; H2O/ 1 000 ml ;p H 7～7. 5.好氧反硝化培养基（固体）醋酸钠/ 0.5g ; KNO3/ 0.05g ; Na2HPO4 .7H2O/ 0. 5 g ;NaNO2/0.01g;MgSO4·7H2O/ 0. 1 g ;琼脂18 g ;p H 7～7. 5.富集分离：取样品泥样置于上述液体培养基中，经过每天24小时曝气富集10天。
之后，取1毫升底泥与10毫升去离子水混合，之后进行107倍稀释，在上述固体培养基上进行平板划线分离。
细菌初筛：将分离得到的细菌接种到上述液体培养基中，然后在30摄氏度环境下进行24小时的摇瓶培养，用紫外分光光度法检测硝态氮含量，重复2次，取降低最多的样品继续进行平板划线，再重复上述操作，得到单一菌落。
（验证所得菌落是否单一：将所得菌落接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，进行无菌培养，检测菌落是否单一。
）细菌复筛：将初筛得到的单一菌落，进行实际污水测试，测试其实际降解硝态氮的能力。
二、BTB 初筛培养基：琼脂20 g、KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.5 g、CaCl2·7H2O 0.2 g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g、溴百里酚蓝(BTB)(1%乙醇溶液)1 mL，用1 mol/L 的NaOH 调节pH 至7.0～7.3，121 ℃灭菌20 minLB 液体培养基(/L)：KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g，121 ℃灭菌20 minDM 反硝化培养基(/L)：KNO3 0.72 g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠2.8 g，121 ℃灭菌20 min采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1 mL 均匀涂布于BTB 培养基表面，置入恒温培养箱，30 ℃下培养2～3 d 后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株。
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究
两株异养硝化—好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定和特性研究一、本文概述本文旨在探讨两株异养硝化-好氧反硝化细菌的分离、筛选、鉴定及其特性研究。
异养硝化-好氧反硝化细菌是一类特殊的微生物，能够在好氧条件下进行硝化和反硝化过程，对于氮循环和环境保护具有重要意义。
本文首先通过分离和筛选方法，从自然环境中获取两株具有异养硝化-好氧反硝化功能的细菌，并对其进行初步的生理生化特性分析。
接着，采用分子生物学手段对这两株细菌进行鉴定，明确其分类地位和系统发育关系。
在此基础上，进一步深入研究这两株细菌的生长特性、硝化反硝化性能、以及环境因子对其生长和代谢的影响。
本文的研究结果不仅有助于深入了解异养硝化-好氧反硝化细菌的生物学特性和生态学功能，同时也为该类微生物在环境修复、污水处理等领域的应用提供理论支撑和实践指导。
二、材料与方法为了分离和筛选异养硝化—好氧反硝化细菌，我们从多个不同的生态环境中采集了土壤和水样，包括污水处理厂、河流、湖泊以及农田土壤等。
为了培养和筛选目标细菌，我们使用了多种培养基，包括常规的好氧反硝化培养基和异养硝化培养基。
这些培养基根据细菌的生长特性和需求进行了优化。
实验过程中使用了多种分子生物学试剂，如PCR引物、DNA提取试剂盒等。
同时，还使用了多种仪器，如PCR仪、凝胶电泳仪、微生物培养箱等。
采用稀释涂布法将采集的样品接种到含有相应培养基的平板上，通过观察菌落的形态、大小和颜色等特征，初步筛选出具有异养硝化—好氧反硝化能力的细菌。
通过形态学观察、生理生化特性分析以及分子生物学方法（如16S rDNA序列分析）对筛选出的细菌进行鉴定。
对筛选和鉴定出的细菌进行详细的特性研究，包括生长曲线测定、异养硝化速率测定、好氧反硝化速率测定等。
还研究了环境因子（如温度、pH、碳源和氮源等）对细菌生长和硝化反硝化活性的影响。
实验数据采用统计学方法进行分析，以揭示细菌的生长规律和硝化反硝化特性。
还通过图表等形式直观地展示了实验结果。
好氧反硝化菌种DF2的分离鉴定及生理生化特性分析
进 出水 ｐ Ｈ
１５ 反硝 化菌 的脱 氮性 能考 察 ．
不 同的反硝化细菌分别具有不 同的反硝化性 能。根据前期获得的 ｌ Ｏ株反硝化细菌和筛选 ，对 获 得 的最 优 菌株进 行 了特性 考察 。碳 源 、溶 解氧 、 Ｐ（ （ 和 ｐ ｃ） Ｎ） Ｈ值是影响硝化与反硝化进程的 主要 因素，因此设计 了不 同的试验环节 ， 来确定最 佳反硝化条件。
表 １ 测定 项 目及方 法
Ｔ ｂ ｅ １ Ｄｅ ｅｍｉ ａ ｉｎ ｏ ｔ ｅｐ ｒ ｍｅｅ ｓａ ｔ ｏ ｓ ａ ｌ ｔ ｒ ｎ ｔ ｆ ｈ ａａ ｔｒ ｎｄｍｅｈ ｄ ｏ
１ 、５ 、１ 、１ 等 ６个不 同梯 度 ，在 ３ ℃的 、３ 、７ ０ ５ ０ １０ｍＬ的反 硝化 培养基 中培养培 养 ５ｄ ０ ，通过 定 时 测定 Ｏ ｏ变化 ，检测 脱氮 效果 ，分析 ＣＮ对 脱氮 Ｄ６ ｏ ／ 能力影 响 。
Ｄｏ 、Ｔ
测 定方法
过硫 酸 钾氧化 ． 紫外分 光光 度法
纳 氏试 剂分 光光度 法
紫外 分Байду номын сангаас 光度 法
Ｎ（ １萘 基）乙二胺 盐 酸盐光 度法 溶解 氧 仪
便携 式 ｐ Ｈ计
培养 ５ ， 通过定时测定 Ｏ ６ 变化 ， ｄ Ｄ０ ０ 可以反应菌株 适 宜 的生长 温度 。 １ ． 溶解 氧对反 硝化 细 菌生 长及 脱 氮能 力影 响 ．５ ５ 通 过设 置静 止厌 氧密封 、 静止 封 口、 ｍ ｎ １０ ・ｉ ２ｒ 震荡及 １０ ・ ｎ 震荡 ４ ６ ｍｉ ｒ 种不 同的溶解氧条件 ，在 ３ ０℃ 的 １０ ０ ｍＬ的反硝 化培 养基 中培养 培养 ５ ， 检 ｄ 测脱氮效果 ，分析溶解氧对脱氮能力的影响。 １ ． ｐ 对反硝 化 细 菌生长及 脱 氮能 力影响 ．６ Ｈ ５ 设 置 ｐ 为 ５ 、６０ ．、７０ ．、８０ ． Ｈ ． ０ ．、６５ ．、７５ ．、９０ 等６ 个梯度 ， ３ 在 ０℃的 １０ Ｌ的反硝化培养基 中 ０ ｍ 培养培养 ５ ， 通过定时测定 Ｏ ６ 变化 ， ｄ Ｄ０ ０ 检测脱氮 效果 ，分析 ｐ Ｈ对脱氮能力影响。 １６ 周 质 Ｎ ． ＡＲ亚基基 因 （ ａ Ａ ） ｎ ｐ 的扩增
反硝化菌培养流程
反硝化菌培养流程
反硝化细菌的培养需要遵循以下步骤：
1. 富集培养：首先，需要准备适合反硝化细菌生长的培养基。
常用的培养基成分包括KNO3、柠檬酸钠、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O和陈海水（或蒸馏水）。
将这些成分溶解于水后，调整pH至，然后分装于试管或烧瓶中。
在121℃的蒸汽下灭菌20分钟以杀死有害微生物。
接着，在富集培养液的试管中分别加入少量的海泥、池泥或河泥。
在20℃或25-30℃下培养5-15天或3-10天。
如果培养液变混浊，有气泡产生，或者检验到有氨和亚硝酸产生，则说明有反硝化细菌生长。
2. 分离培养：在富集培养的基础上，可以通过适当的分离培养基进行反硝化细菌的分离。
分离培养基的成分包括葡萄糖、酒石酸钾钠、KNO3、
K2HPO4、CaCl·2H2O和陈海水（或蒸馏水）。
将这些盐类溶于水中，调整pH至，然后装入烧瓶中。
在121℃的蒸汽下灭菌20分钟。
将经过富集培养的反硝化细菌接种到分离培养基中，继续在20℃或25-30℃下培养。
通过观察和检测，可以挑选出具有优良反硝化性能的菌株。
请注意，上述步骤仅为反硝化细菌培养的基本流程，实际操作中可能需要根据具体情况进行调整。
同时，工作人员应确保实验操作的安全性，穿戴适当的防护装备，并遵循相关的实验室安全规定。
好氧反硝化细菌培养基配制知识分享
好氧反硝化细菌培养基配制好氧反硝化细菌培养基配制以及实验方法一、好氧反硝化培养基（液体）醋酸钠/ 0.5 g ; KNO3 / 0.1 g ; K2HPO4 / 0.01g ;MgCl2/ 0. 02 g ;CaCl2/ 0. 01g ; H2O/ 1 000 ml ;p H 7～7. 5.好氧反硝化培养基（固体）醋酸钠/ 0.5g ; KNO3/ 0.05g ; Na2HPO4 .7H2O/ 0. 5 g ;NaNO2/0.01g;MgSO4·7H2O/ 0. 1 g ;琼脂18 g ;p H 7～7. 5. 富集分离：取样品泥样置于上述液体培养基中，经过每天24小时曝气富集10天。
之后，取1毫升底泥与10毫升去离子水混合，之后进行107倍稀释，在上述固体培养基上进行平板划线分离。
细菌初筛：将分离得到的细菌接种到上述液体培养基中，然后在30摄氏度环境下进行24小时的摇瓶培养，用紫外分光光度法检测硝态氮含量，重复2次，取降低最多的样品继续进行平板划线，再重复上述操作，得到单一菌落。
（验证所得菌落是否单一：将所得菌落接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，进行无菌培养，检测菌落是否单一。
）细菌复筛：将初筛得到的单一菌落，进行实际污水测试，测试其实际降解硝态氮的能力。
二、BTB 初筛培养基：琼脂20 g、KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.5 g、CaCl2·7H2O 0.2 g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g、溴百里酚蓝(BTB)(1%乙醇溶液)1 mL，用1 mol/L 的NaOH 调节pH 至7.0～7.3，121 ℃灭菌20 minLB 液体培养基(/L)：KNO3 1 g、KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g，121 ℃灭菌20 minDM 反硝化培养基(/L)：KNO3 0.72 g、KH2PO41g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠2.8 g，121 ℃灭菌20 min采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1 mL 均匀涂布于BTB 培养基表面，置入恒温培养箱，30 ℃下培养2～3 d 后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株。
污水处理培养菌种方法
污水处理培养菌种方法一、引言污水处理是一项重要的环保工作，有效的污水处理可以减少对环境的污染，保护水资源。
在污水处理过程中，菌种的选择和培养是关键步骤之一。
本文将介绍一种常用的污水处理培养菌种方法，以提供参考和指导。
二、菌种选择在污水处理过程中，常用的菌种有好氧菌、厌氧菌和硝化菌等。
好氧菌主要用于有机物的降解，厌氧菌主要用于有机物的发酵和产气，硝化菌主要用于氨氮的氧化。
根据实际情况和处理要求，选择适当的菌种进行培养。
三、培养基配制1. 好氧菌培养基配制：- 水：1000ml- 葡萄糖：10g- 氯化铵：1g- 硫酸镁：0.5g- 磷酸二氢钾：0.5g- pH值调节至7.0左右2. 厌氧菌培养基配制：- 水：1000ml- 葡萄糖：10g- 氯化钠：5g- 硫酸镁：0.5g- 磷酸二氢钾：0.5g- pH值调节至7.2左右3. 硝化菌培养基配制：- 水：1000ml- 葡萄糖：5g- 硝酸铵：1g- 硝酸钠：1g- 硫酸镁：0.5g- 磷酸二氢钾：0.5g- pH值调节至7.5左右四、菌种培养1. 好氧菌培养：a. 取一定量的好氧菌接种于含有好氧菌培养基的试管中；b. 在适宜的温度下（一般为30℃），静置培养一段时间（一般为24小时）；c. 观察培养基是否出现浑浊现象，测定菌液的浓度。
2. 厌氧菌培养：a. 取一定量的厌氧菌接种于含有厌氧菌培养基的试管中；b. 在适宜的温度下（一般为37℃），静置培养一段时间（一般为48小时）；c. 观察培养基是否出现气泡和沉淀现象，测定菌液的浓度。
3. 硝化菌培养：a. 取一定量的硝化菌接种于含有硝化菌培养基的试管中；b. 在适宜的温度下（一般为25℃），静置培养一段时间（一般为72小时）；c. 观察培养基是否出现颜色变化，测定菌液的浓度。
五、菌种应用1. 好氧菌的应用：好氧菌主要用于有机物的降解，可以应用于生活污水、工业废水等的处理过程中。
将培养好的好氧菌接种到污水处理系统中，通过菌群的作用，加速有机物的分解和降解，提高处理效果。
培养基资料
常用的配方是：亚硝化细菌培养基：硫酸铵0.5g 氯化钠0.3g 硫酸亚铁0.03g 磷酸二氢钠1g 硫酸镁0.03g CaCl2 7.5g 蒸馏水1000ml PH 7.5，固体培养基加5％琼脂硝化菌培养基：亚硝酸钠1g 硫酸镁0.03g 硫酸锰0.01g 磷酸氢二钾0.75g 无水碳酸钠1g 磷酸二氢钠0.25g 蒸馏水1000ml PH 7.5，固体培养基加5％琼脂。
另外如果是用固体培养基倒置培养，可以适当多加些琼脂。
亚硝酸盐有毒，使用时要当心。
亚硝化细菌18分钟可繁殖一代，硝化细菌大约要15小时繁殖一代。
一般3-5天就会出结果，乳白色的菌落。
亚硝化细菌用格里斯试剂检测(出现红3天, 略微呈色)，硝化细菌用二苯胺检测（出现蓝色）。
第0天不呈蓝色; 第1~8天, 呈深蓝色, 而空白对照二苯胺试剂检蓝色; 第4天, 蓝色明显加深; 第5~测结果一直不呈蓝色。
活性污泥中的硝化细菌富集培养取得了预期结果, 自养硝化细菌成为优势菌群。
然后还要根据你的用途进行定向培育。
肉汤培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂2％1.2 实验方法1.2.1 硝化细菌的分离将采集到的海水样本分别放在两个培养皿中，分别加入亚硝化菌液体培养基和硝化菌液体培养基，放在24℃地培养箱中培养5天，然后取培养液在固体培养基上进行分区划线，得到单菌落，再挑取单菌落进行分区划线分离。
1.2.2 形态结构鉴定（1）将分离得到的单菌落分别接种到肉汤培养基的平板上看其是否生长（硝化细菌是严格的自养菌，在肉汤培养基上不能生长）。
（2）镜检观察：单染色法（3）在培养液中加入格利斯试剂，亚硝化菌培养液变红即可判断为阳性，硝化菌的培养液需比色计算出其亚硝酸根浓度是否降低，才能判断是否为硝化菌。
1.2.3 细菌的培养（摇瓶、发酵罐）（1）摇瓶培养：将初步鉴定是硝化细菌的菌落接种到摇瓶中20-28℃培养，200转/分钟，每隔五天取样一次测硝化作用强度和菌浓度。
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好氧反硝化细菌培养基配制以及实验方法
一、好氧反硝化培养基（液体）醋酸钠/ 0.5 g ; KNO3 / 0.1 g ; K2HPO4 / 0.01
g ;MgCl2/ 0. 02 g ;CaCl2/ 0. 01g ; H2O/ 1 000 ml ;p H 7～7. 5.
好氧反硝化培养基（固体）醋酸钠/ 0.5g ; KNO3/ 0.05g ; Na2HPO4 .
7H2O/ 0. 5 g ;NaNO2/0.01g;MgSO4·7H2O/ 0. 1 g ;琼脂18 g ;p H 7～7. 5.
富集分离：取样品泥样置于上述液体培养基中，经过每天24小时曝气富集10天。
之后，取1毫升底泥与10毫升去离子水混合，之后进行107倍稀释，在上述固体培养基上进行平板划线分离。
细菌初筛：将分离得到的细菌接种到上述液体培养基中，然后在30摄氏度环境下进行24小时的摇瓶培养，用紫外分光光度法检测硝态氮含量，重复2次，取
降低最多的样品继续进行平板划线，再重复上述操作，得到单一菌落。
（验证
所得菌落是否单一：将所得菌落接种在牛肉膏蛋白胨培养基上，进行无菌培养，检测菌落是否单一。
）
细菌复筛：将初筛得到的单一菌落，进行实际污水测试，测试其实际降解硝态
氮的能力。
二、BTB 初筛培养基：琼脂20 g、KNO3 1 g、
KH2PO41 g、FeCl2·6H2O 0.5 g、CaCl2·7H2O 0.2 g、
MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g、溴百里酚蓝
(BTB)(1%乙醇溶液)1 mL，用1 mol/L 的NaOH 调节
pH 至7.0～7.3，121 ℃灭菌20 min
LB 液体培养基(/L)：KNO3 1 g、KH2PO41 g、
FeCl2·6H2O 0.05 g、CaCl2·7H2O 0.02 g、MgSO4·
7H2O 1 g、琥珀酸钠8.5 g，121 ℃灭菌20 min
DM 反硝化培养基(/L)：KNO3 0.72 g、KH2PO41
g、MgSO4·7H2O 1 g、琥珀酸钠2.8 g，121 ℃灭菌
20 min
采用梯度稀释法将污泥样品稀释至适当浓度，取0.1 mL 均匀涂布于BTB 培养基表面，置入恒温培养箱，30 ℃下培养2～3 d 后，用接种环挑取使周围培养基出现蓝色晕圈的单菌落，进行分离纯化即为初筛菌株。
接种初筛菌株至LB 培养基，在30 ℃、160 r/min 条件下进行液体培养24 h 后，以10%的接种量接种到反硝化培养基(DM 培养基)中，30 ℃、160 r/min 条件下进行摇瓶发酵，间隔一定时间取样。
测定发酵液中硝基氮浓度(NO-3-N)和亚硝基氮浓度(NO-2-N)，通过分析其NO3--N 和TIN(NO--N+NO-2 -N)去除率，考察所筛菌株的反硝化性能。
NO-3 -N：用紫外分光光度法测定；NO-2 -N：用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定[4]。
菌体量：光密度法，用721 型分光光度计在600 nm 处测定吸光度值。
微量元素溶液:EDTA(乙二胺四乙酸) 50.0 g ,
ZnSO4 2.2 g , CaCl2 5.5 g , MnCl2·4H2O 5.06 g , FeSO4
·7H2O 5.0 g , CuSO4·5H2O 1.57 g , CoCl2·6H2O 1.61 g , 溶解后用蒸馏水定容至1 L ,pH 7.0.。