大鼠视网膜神经节细胞培养
大鼠视网膜Müller细胞体外培养特性
大鼠视网膜Müller细胞体外培养特性李春花;郑玉萍;周婷洁;雷晓琴;王润生;宋虎平;马为梅【期刊名称】《临床眼科杂志》【年(卷),期】2018(26)5【摘要】目的探讨视网膜Müller细胞(RMCs)体外培养方法,研究其增殖、凋亡特性.方法将出生7 d的SD大乳鼠处死,分离出视网膜组织并收集于培养皿中,分别加入木瓜蛋白酶(27 U/ml)和0.25％的胰蛋白酶37℃进行消化30 min,使用20％FBS的DMEM/F12培养基终止消化.用移液枪轻轻吹打,接种于6孔培养板,放入37℃、体积分数为5％的CO2培养箱培养.定时观察细胞的生长情况,2～3 d换液1次.当细胞长满培养板的80％～90％时进行消化终止,按1:3传代,移入放有细胞爬片的6孔培养板,置于5％CO2恒温培养箱中培养.在倒置显微镜下观察细胞形态变化.在原代培养5 d时,将细胞爬片取出,进行谷氨酰胺合成酶(GS)、波型蛋白(Vimen-tin)免疫荧光染色.结果原代培养的RMCs与神经元细胞共同生长,随接种时间延长,逐渐自接种块周边爬行生长,呈扁平的多边形融合状生长,并有较长的突起,传2代时细胞纯化率高,传3～4代时细胞失去原有秩序,体积约有原代的3～4倍,胞质内见明显束状纤维增生.GS主要在Müller细胞胞核和胞质中表达,胞膜不表达,其阳性表达率达80％以上.Vimentin主要在Müller细胞胞质中表达,其阳性表达率达90％以上.结论本试验通过酶分步消化法以及机械吹打法在体外成功培养并纯化了视网膜Müller细胞,GS和Vimentin均可鉴别视网膜Müller细胞,将二者一起使用可提高Müller细胞鉴别率;随着体外传代培养时间延长,Müller细胞逐渐分化为带有收缩功能的纤维细胞,这可能参与了增生性视网膜病变的发病机制.【总页数】5页(P460-464)【作者】李春花;郑玉萍;周婷洁;雷晓琴;王润生;宋虎平;马为梅【作者单位】710004 西安市第四医院;710002 西安交通大学附属第二医院;710054 西安市疾病预防控制中心;710004 西安市第四医院;710004 西安市第四医院;710004 西安市第四医院;710004 西安市第四医院【正文语种】中文【相关文献】1.大鼠视网膜Müller细胞受刺激后具有神经干细胞的特性 [J], 董晓飞;柳林2.视网膜Müller细胞体外培养研究 [J], 张海涛;李燕;唐志萍3.葛花总黄酮对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜Müller细胞的保护作用 [J], 罗影;左中夫;张俏;薛坤;刘畅;闵连秋4.红景天苷抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞的凋亡 [J], 赵宁;于洪丹;冯珍;丁佳媛;刘学政5.α1-抗胰蛋白酶抑制高糖诱导大鼠视网膜Müller细胞凋亡实验研究 [J], 田蕴霖;白淑玮;邵娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠视网膜神经细胞的原代培养(译文)
大鼠视网膜神经细胞的原代培养摘要目的:在前人建立的方法上优化SD 大鼠视网膜神经细胞体外培养的技术和方法，为后续研究提供实验基础。
方法:使用胰酶消化法分离新生1 ～ 3d SD 大鼠视网膜神经细胞，以DMEM/F12 为培养基体外培养，免疫组织化学染色的方法进行鉴定。
结果:观察光镜下培养的细胞贴壁生长，部分细胞伸出突起，且有些突起相互连接。
免疫细胞化学染色显示，培养的细胞大多数抗神经元特异性烯醇化酶(NSE) 抗体反应阳性。
结论:视网膜神经细胞体外培养成功为进一步进行视网膜疾病的研究创造了条件。
关键词:细胞培养; 视网膜神经元; 胰蛋白酶消化法; 神经元特异性烯醇化酶引言一个世纪前，从青蛙身上剥离的神经管片段仍能在生理液中维持几天的活性，使得越来越多的神经纤维得到的实时观测以来，体外培养技术已经广泛的应用于生物技术领域。
【1】在没有了完整动物的复杂性，体外培养的方法可以大大提高对视网膜的基本属性和环境的适应性的了解。
在体外系统中，这个界定的实验条件可以很容易设定和维持。
这提供了一个稳定的辅助药理学和分子操纵的平衡，同时保持了完整的组织复杂表型特征。
在这里我们根据一些成功方法报告探讨一下大鼠视网膜神经细胞的原代培养技术。
【2-3】材料与方法动物：实验中使用的所有SD大鼠幼崽均是从青岛实验动物中心根据眼科和视觉研究中动物的ARVO声明，同时保留了出生后1-3SD大鼠的相对温度和湿度条件下获得的SD大鼠幼崽材料：DMEM/F12培养液和胎牛血清购自Gibco公司（美国），兔抗大鼠神经元特异性烯醇化酶（NSE）单克隆抗体，兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体，羊抗兔IgG 和HRP-链霉亲和素购自中山Goldbridge生物技术有限公司（北京，中国）。
所有其他试剂均为Sigma公司（圣路易斯，密苏里州，美国）。
方法：预涂层的聚-D-赖氨酸组织培养皿为了使视网膜神经细胞，紧贴组织培养皿，聚-D-赖氨酸添加到被预先放置盖玻片的24孔板的孔中。
LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究的开题报告
LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究的开题报告
概述：
本研究旨在探究LEDGFp52在大鼠视网膜神经节细胞中的作用，与疾病发展的关联以及治疗方法的研究。
视网膜神经节细胞是视网膜中负责传递视觉信息到脑部的重
要细胞。
众所周知，视网膜神经节细胞的损失是引起眼疾的主要原因之一。
LEDGFp52是一种与基因转录和DNA修复有关的蛋白质。
越来越多的研究表明，LEDGFp52在视网膜神经节细胞中的表达与细胞凋亡、炎症、视网膜神经节细胞的死
亡等病理过程密切相关，可能是治疗眼疾的潜在靶点之一。
研究方法：
本实验将使用体外细胞培养的方法，在大鼠视网膜神经节细胞中转染LEDGFp52，观察LEDGFp52的表达情况，以及其对视网膜神经节细胞的影响。
同时，使用Western Blot和实时荧光定量PCR等方法，检测LEDGFp52参与了哪些信号通路以及
对关键基因表达的调控。
预期结果：
- 确定LEDGFp52在大鼠视网膜神经节细胞中的表达情况及变化规律；
- 探索LEDGFp52参与了哪些信号通路，并比较其在疾病状态下的变化；
- 研究LEDGFp52对视网膜神经节细胞的影响，以及其对细胞的生存、凋亡、炎
症等过程的影响；
- 探究LEDGFp52在治疗眼疾中的应用潜力，为开发治疗眼疾的新药物提供新的
思路。
视网膜神经节细胞多种培养方法的实验研究
视网膜神经节细胞多种培养方法的实验研究
胡竹林;杜蜀华
【期刊名称】《中华实验眼科杂志》
【年(卷),期】2002(020)001
【摘要】目的探讨视网膜神经节细胞(RGCs)的多种培养方法. 方法 (1)在涂有鼠尾胶原的器皿上通过调整培养液培养:①乳鼠混合及纯化的RGCs;②单层星型胶质细胞上种植纯化的乳鼠RGCs;③引产胎儿混合RGCs.(2)检验鼠尾胶原及中脑顶盖提取液(Te)对培养的乳鼠RGCs的影响. 结果 (1)混合培养的乳鼠及引产胎儿RGCs大多能存活2周以上;(2)纯化的乳鼠RGCs大多能存活48h;(3)单层星型胶质细胞上种植的纯化乳鼠RGCs能存活4周以上;(4)鼠尾胶原及Te对培养的乳鼠RGCs的贴壁及生长有明显的促进作用. 结论通过调整培养液及改善微环境能用多种方法培养RGCs.
【总页数】5页(P30-34)
【作者】胡竹林;杜蜀华
【作者单位】华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属同济医院眼科,武汉,430030
【正文语种】中文
【中图分类】R774
【相关文献】
1.合用多种草药提取液促进轴突切断的视网膜神经节细胞的存活和再生 [J], CheungZH;武明媚
2.左卡尼汀对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞保护作用的实验研究 [J], 于常红;韩彦弢;曹玉;安明;时肖;杨军廷;焦俊;李胜;王春波
3.天麻钩藤饮抗大鼠视网膜神经节细胞凋亡机制的实验研究 [J], 吕繁涛;李玉洁;马科;王海燕
4.Brn-3a标记大鼠视网膜神经节细胞的实验研究 [J], 林俊;朱益华
5.荧光金逆行标记乳鼠视网膜神经节细胞的实验研究 [J], 李静波;徐尤学;方家华;张祖海
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肿瘤坏死因子对体外培养大鼠视网膜神经节细胞凋亡的诱导
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不同浓度ＴＮＦ—ｄ对视网膜神经细胞活
力的影响
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ＴＮＦ－ａ浓度（ｎｇＪｍｌ）
图２不同浓度ＴＮＦ—Ｑ对视网膜神经细胞凋
亡的诱导
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ＴＮＦ．ｄ浓度
８１００
∞如∞∞加
０
附图
幽１原代培养接种即刻的视网膜神经细胞，少数神经元仍保留轴突或树突，相差显微镜ｘ２００
幽２原代培养２４小时，细胞基本贴壁．基单层排列，细胞聚集成团，人部分细胞Ｋｍ短的突
图３原代培养第２ｄ，细胞体积较前增人，视网膜神经元再生出较长的轴突和树突，相差显微镜ｘ２００
浏５原代培养第４ｄ．视网膜神经元的突起数倍丁胞体直径，相著显微镜ｘ２００
附图
图７原代培养２ｄ的视网膜神经元，ＨＥｘｌ０００
图８原代培养３ｄ的视网膜神经元，突起之间相互连接形成突触，ＨＥｘ２００
９
附幽
图９原代培养４ｄ的视网膜神经元，个别细胞轴突数倍于胞体直径，ＨＥｘ２００。
新生大鼠视网膜神经元的改良培养及鉴定
州
医
药
２１ ０ ０年第 ４ １卷第 ３期
・
・
３・
实验研究 ・
新 生 大 鼠视 网膜 神经 元 的改 良培 养 及鉴 定
郭 梦翔 冯 光 强
广 州市 妇女 儿童 医疗 中心 眼科 （ １１０ ５０ ２ ）
【 摘 要】 目的 探 讨新生大 鼠视 网膜神 经元 获取 和体外培 养 的方法 ，为视 网膜 神 经细胞 的基础研 究提供 合
ｗ ｒ ｂ ａｎ ｄ ｂ ｎ ｙ ｉｅ ｔ ｎ，ｃ ｌ ｒ ｄ ｉ ｄ ａｏ ｅ ｅｏ ｔｉ ｅ ｙ ｅ ｚ ｍｅｄ ｇ ｓｉ ｏ ｕ ｔ ｅ ｎ ｍｅ ｉ ｆＤＭＥ ｕ Ｍ／Ｆ ２，ｉ ｖ ｓｉａ ｅ ｙ ｉｖ ｒｅ ｃ ｏ ｃ ｐ ｎ １ ｎ ｅ ｔ ｔｄ ｂ ｅ ｔ ｄ ｍｉｒ ｓ ｏ ｅａ ｄ ｉ ｇ ｎ ｍｍｕ ｏ ｉｔｃ ｅ ｎ ｈ ｓ ｈ ｍ— ｏ ｉｔ ｔ ｉ． ｓｒ ｓａｎ ｙ Ｒｅ ｕ ｔ Ｒｅｉ ａ ｅ ｒ ｌ ｅ ｌ ｃ ｕ ｄ ｂ ｉ ｅ ｓ ｄ ａ ｎ ｅ ｌｓ ｓ ｅ ｓ ｎ ｂ ． ５％ ｔ ｐ ｉ ｎ ． ２ ｅｈ ｌｎ ｉ — ｓ ｓ ｌ ｔ ｌ ｕ ａ ｌ ｏ ｌ ｅ ｄ ｓ ｒ ｅ Ｓｕ ｉａ ｕ ｐ ｎ ｉ ｙ０ ２ ｎ ｎ ｃ ｓ ｐ ｌ ｏ ｒ ｓ ａ ｄ０ ０ ％ ｔ ｙｅ ｅ ｄ ａ ｙ ｎ
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B族维生素对体外培养大鼠视网膜神经细胞及节细胞的神经营养作用
B族维生素对体外培养大鼠视网膜神经细胞及节细胞的神经营养作用白海青;王竫华;李树宁【期刊名称】《中华实验眼科杂志》【年(卷),期】2004(022)001【摘要】目的评价维生素B1、B6、B12及其衍生物甲钴胺对视网膜神经细胞及神经节细胞(RGCs)的生存和轴突再生伸长的影响.方法采用新生大鼠视网膜神经细胞体外原代培养技术,与不同浓度的B族维生素共同培养,MTT比色法检测细胞活力,进行HE染色和抗Thy1免疫细胞化学染色,测量视网膜神经细胞和RGCs轴突长度,比较各种维生素对细胞轴突伸长的影响.结果维生素B1、B1、B12和甲钴胺的最有效作用浓度分别为100、100、1.0、1.0μmol/L;高密度培养该营养作用更明显.用该浓度作用于细胞,维生素B6、B12和甲钴胺可促进视网膜神经细胞和RGCs轴突伸长.结论B族维生素在体外短期内能够显著提高视网膜神经细胞和RGCs的活力,促进上述细胞轴突再生伸长.【总页数】4页(P73-76)【作者】白海青;王竫华;李树宁【作者单位】266003,青岛大学医学院附属医院眼科;266003,青岛大学医学院附属医院眼科;266003,青岛大学医学院附属医院眼科【正文语种】中文【中图分类】R774【相关文献】1.睫状神经营养因子对大鼠急性高眼压眼视网膜神经节细胞的保护作用 [J], 武劲圆;孙丰源;唐东润;张蕊2.睫状神经营养因子对大鼠急性高眼压眼视网膜神经节细胞的保护作用 [J], 武劲圆;孙丰源;唐东润;张蕊3.脑源性神经营养因子对大鼠视网膜节细胞损伤的保护作用 [J], 黄蔚;王琳;惠延年;张淼丽4.不同生长期晶状体蛋白对体外培养的大鼠视网膜神经节细胞存活的促进作用 [J], 王文军;唐罗生;杨新光5.睫状神经营养因子对大鼠视神经损伤后视网膜神经节细胞的保护作用 [J], 王山丹;钱志敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
视神经节细胞的体外培养与纯化
内蒙古中医药
视 神经 节细 胞 的体 外培 养 与纯 化
袁 晓 燕 谌 立巍 一 陈 思敏 一
摘
要 ：进行 大鼠视 网膜神经节细胞体外培养及 纯化的方法学研 究。取 出生 ７ ｈ内的 ｓ ２ Ｄ大鼠乳 鼠视 网膜制成 细胞悬液 ，放
于 已包被 多聚鸟氨酸和层粘连蛋 白 （ ｒｉｎ Ｎ）的培养皿 中，加 ２ ％ Ｅ Ｍ 血 清培养液 、于 ３ ℃ 、５ １ｎｎ ，Ｌ ａ ｉ ０ ＭＤ ７ ％二氧化碳 孵箱 中 培养 ，同时分 别在 混合培 养的视 网膜神 经细胞 中加入 ５ 一溴 一２ 一脱 氧脲 苷 （ ｒｕ ’ ’ Ｂｄ ）和 羊抗鼠 Ｉ ｇ Ｏ、小鼠抗 大鼠 Ｔ ｙ ． ｈ １１ 抗体 ，于 ４小时，２ ４小时，４ ８小时，７ ２小时观测细胞存 活情况；并采 用 ＭＴ Ｔ法测定不 同方 法培 养的视 网膜细胞在 不 同时 间的存 活率 ，绘 制细胞 生长曲线。通过对 不同方 法培养的细胞观 察可见，视 网膜混合培 养细胞和加入 Ｂｄ 培 养的细胞 ，于 ３ ｒｕ
ｌ ｎ （ Ｎ） ． ｄ２ ％ Ｅ Ｍ ｕ ｉ ｔ ｑｉ ａｄｃｌｖｔ ｃｂｔｒ ｉｅ ｉ ％ ｃｒｏ ｉ ｉｅＡ ｅｓｒｅｉ ， ａ ｉ Ｌ ｍｉ ｎ Ａｄ Ｏ ＭＤ ｃｌｖ ｅ ｌ ｕ ｕ ｉ ｅｉ ｉ ａ ｉ ａ ｌ ｗ ｔ ５ ａｂｎｄ ｘｄ ． ｔ ｈ ｎｔ ｔ ａｄ ｉ ｄｎ ｔ ａ ｔ ｎｎ ｎ ｕ ｏ ｆｌ ｄ ｈ ｏ ｔ ａ ｍｅ
～
４小时开始贴壁 ，４ ８小 时开始 伸 出粗 细 长短 不等 的突起 ，７ ２小 时后 突起 增 多，并 伸长 ；加入 羊抗 鼠 Ｉ ｖ ． 抗体的细胞 ，其呈 多边形 ，大 多数细胞质折光强 ，７ ２小时后很 少见到活细胞 ；混合 培养 细胞 数量在 ４ ８小时后增加 约 ７ ％ ，加入 Ｂｄ 后 ，混合培 养的细胞数量在 ４ ０ ｒｕ ８小时无明显减少 ，纯化 的视 网膜 神经细胞在 ４ ８小时后 明显减 少。本 实验
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大鼠视网膜神经节细胞培养步骤及配方
1.成年SD大鼠摘除眼球，取出视网膜组织。
2.在木瓜蛋白酶中37o C，孵育25分钟
木瓜蛋白酶溶液配制：木瓜蛋白酶34个单位/ml（或2mg/ml）
DL-半胱氨酸3.3mM（或0.4mg/ml）
BSA 0.4mg/ml
溶解于Neurobasal medium中
3.RGC培养基漂洗3次
RGC培养基配制：Penicillin 100单位/ml
Streptomycin 100ug/ml
Pyruvate 1mM(无)
Glutamine 2mM
Insulin 5ug/ml
Transferring 100ug/ml
BSA 100ug/ml
Progesterone 60ng/ml
Putrescine 16ug/ml
Thyroxine 40ng/ml
Tri-iodothyronine 40ng/ml（无）
BDNF 50ng/ml
CNTF 10ng/ml
bFGF 10ng/ml
froskolin 5um(无？)
fetal calf serum 1%
培养基：neurobasal/B27
各浓缩液配制：penicillin: 10000单位/ml (每100ml培养基加入1ml)
Streptomycin 10mg/ml (每100ml培养基加入1ml)
Glutamine(分子量：146.15) 29.23mg/ml或200mM (每100ml培养基加入1ml)
Insulin 5mg/ml (每100ml培养基加入100ul)
Transferring 10mg/ml (每100ml培养基加入1ml)
BSA 10mg/ml (每100ml培养基加入1ml)
Progesterone 600ug/ml (每100ml培养基加入10ul)
Putrescine 1.6mg/ml (每100ml培养基加入1ml)
Thyroxine 400ug/ml (每100ml培养基加入10ul)
BDNF 500ug/ml (每100ml培养基加入10ul)
CNTF 100ug/ml (每100ml培养基加入10ul)
bFGF 100ug/ml (每100ml培养基加入10ul)
fetal calf serum
Neurobasal/B27
4.将细胞吹打成悬液
5.将1x103－3x103接种到8孔细胞培养板中，孔板由多聚赖氨酸和层连蛋白
包被（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）。