光损伤大鼠视网膜TNF

光损伤大鼠视网膜TNF【摘要】目的：观察光损伤大鼠视网膜肿瘤坏死因子（tnf）-α表达变化的规律，及预先使用米诺环素（minocycline，mc）对其分泌表达的影响，探讨视网膜光损伤的损伤机制和防治措施。

方法：54只sd大鼠，随机分为光照对照组、光照实验组、正常对照组，前两组再各分为光照后6h、3d、7d、14d组，每组各6只大鼠（12只眼）。

光照前90min，光照实验组大鼠mc灌胃（45mg/kg），光照对照组大鼠等量pbs液灌胃。

分别于预定时间点取眼球，左眼石蜡包埋、he染色、tnf-α免疫组化染色，计算机图像分析软件（image-pro plus，ipp）测量视网膜外核层（outer nuclear layer，onl）厚度。

右眼球摘除后即刻完整取出视网膜，匀浆后取上清液，elisa法测定tnf-α的吸光度（o.d）值并计算出tnf-α浓度。

spss 行统计分析。

结果：1，正常对照大鼠视网膜形态正常，tnf-α未见阳性染色，elisa定量仅含微量。

2，光照对照组视网膜6h即出现病理改变，3d和7d进行性加重，14d略有减轻。

视网膜tnf-a阳性表达6h开始增加，3d显著增加，7d减少，14d进一步减少，elisa定量结果和免疫组化结果相平行。

各时间点onl厚度、tnf-a 表达量和正常对照组相比，p值均0.05。

tnf-a表达量均较光照对照组同一时间点为少，两两比较p值均p0.05。

结论：本实验首次研究了光损伤大鼠视网膜tnf-α定位和定量的表达变化，及预先使用米诺环素对tnf-α表达变化和视网膜病理损伤的影响，结论如下：1.光损伤时过度表达的tnf-α参与并加重了视网膜光损伤。

2.mc能减少光损伤大鼠视网膜感光细胞的丢失，对视网膜有保护作用，该作用主要通过抑制tnf-α分泌细胞的活性、减少tnf-α的过度分泌实现。

3.分泌tnf-α的小胶质细胞参与了视网膜光损伤的病理生理过程。

【关键词】视网膜光损伤；米诺环素；免疫组织化学视网膜光损伤发病机制和药物防治的研究是最近几十年来眼科领域一个基础结合临床的重要课题，其中光化学损伤最常见。

特别是近年来，各种眼科光学诊疗器械光源所致视网膜损伤等问题已越来越引起人们的注意，视网膜光化学损伤还是视网膜变性类疾病的良好动物模型，其病理过程与年龄相关性黄斑变性及视网膜色素变性有许多相似之处[1]，而这两种疾病到目前为止尚无有效的防治方法。

所以对视网膜光化学损伤的继续深入研究有着重要的理论和临床实用价值。

本实验意在探讨视网膜光损伤的发病机制，及为其有效防治提供实验依据。

1材料和方法1.1实验动物及分组健康雌性sd大鼠54只（8～10周），体重200±20g，检查无眼疾。

随机分为光照对照组（pbs灌胃）、光照实验组（mc灌胃）和正常对照组，前两组再分别分为光照后6h、3d、7d、14d组，每组分别6只大鼠（12只眼）。

1.2光损伤建模采用自制光损伤装置（1m×1m×1m）（图1，图2）。

所有实验用大鼠（包括正常对照组）均于光照前暗适应24小时。

光照前90分钟，光照实验组大鼠0.5%mc溶液灌胃（9ml/kg/只），光照对照组大鼠等量pbs溶液灌胃。

正常对照组大鼠未予任何处理。

用光照强度为1737.9±393.0lux的绿色荧光灯作为致伤光源，连续照射36小时。

光照结束后送回暗环境饲养。

1.3组织标本的获取预定时间点，3%戊巴比妥钠按1ml/kg腹腔内注射麻醉，迅速摘除双侧眼球（包括球后视神经约3mm）。

追加3%戊巴比妥钠过量麻醉处死大鼠。

右眼球立即放入盛有pbs液的玻璃皿中，双目立体显微镜下完整取出视网膜并用pbs液再次冲洗，立即称取湿重后，按重量体积比1：2加入样品稀释液，低温下研磨匀浆视网膜后，移入离心管中，低温离心机， 10000rpm、4℃下离心20min。

收集全部上清液，-20℃备用做elisa检测。

左眼球立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定48小时后，去除眼前节和玻璃体，逐级酒精脱水，常规石蜡包埋，经视乳头颞侧旁1mm纵向做切片。

1.4检测指标及方法⑴视网膜tnf-αelisa检测；⑵常规he染色；⑶tnf-α免疫组化。

1.5结构改变，并测量光照对照组、光照实验组各时间点和正常对照组onl厚度，求其均值代表这张图片onl的厚度，并以此作为视网膜光感受器最终丧失的判断指标。

各指标以均数±标准差（x ±sd）表示）。

光镜下比较、分析tnf-α免疫组化切片的染色动态变化及定性、定位变化。

用spss 15.0 for windowss进行统计分析。

统计方法：各组各时间点的比较用单因素方差分析，光照组和正常对照组之间的两两比较及两组同一时间点比较采用配对t检验，p2.1.2 光照前后视网膜onl厚度改变的统计学分析：如表1和图6示，光照对照组各时间点onl厚度和正常对照组相比，差别均有统计学意义，p0.05）。

光照对照组和光照实验组各相同时间点两两比较，差别都有统计学意义（p0.05）。

说明光照前全身预防性应用米诺环素，视网膜组织损伤轻、恢复快，明显减少了感光细胞的丢失，对大鼠视网膜光损伤发挥了有效的神经保护作用。

这也证明了米诺环素可以通过血视网膜屏障。

tnf-α是主要由巨噬细胞和活化的单核细胞分泌的前炎性细胞因子，对机体发挥“双刃剑”作用，低水平时参与机体的免疫防御，高水平时会给机体造成严重损害，在诸多眼病的发生发展中起着重要介质作用。

本实验观察了各组大鼠视网膜中tnf-α的动态表达变化，取材分别来自同一大鼠的左右眼，采用免疫组织化学定位、定性和elisa定量观察相结合的方法。

实验中观察到，正常对照组大鼠视网膜形态、结构均未发现异常，elisa定量检测发现含微量tnf-α，说明其是视网膜实现正常的生理功能所必需，对维持视网膜组织的稳定状态和抵制各种致病因子具有重要意义。

光照后6h 迅速增多，3d达最大值，为896.65±19.21pg/ml，而he染色光镜下观察视网膜损伤最重是在光照后7d，出现在视网膜tnf-α表达达峰值之后，这提示tnf-α参与并加重了视网膜光损伤。

视网膜tnf-α含量7d和14d逐渐减少，但仍维持在一个较高的水平，14d 时下降为120.40±9.35pg/ml。

上述光照对照组光照后各时间点视网膜tnf-α含量和正常对照组比较，差别均有统计学意义。

而光照实验组光照后各时间点视网膜tnf-α含量也呈相似的动态变化，但表达量均较相同时间点光照对照组低得多，同一时间点两两比较，差别均有统计学意义。

说明预防性使用mc明显抑制了光损伤后视网膜tnf-α的表达。

光照后14d，光照实验组视网膜tnf-α含量已下降到接近正常对照组水平，两者差别无统计学意义，同时反映视网膜组织损伤程度的onl厚度也无明显差别，这就进一步说明tnf-α参与了视网膜光损伤的病理过程，视网膜tnf-α含量和视网膜光损伤程度密切相关，含量的多少直接影响到视网膜损伤程度的大小，当tnf-α含量下降到接近正常水平时，视网膜损伤停止，并以较快的速度完成形态学的修复。

所以笔者认为，视网膜光损伤时tnf-α过度分泌，通过诱导感光细胞的凋亡参与并加重了视网膜光损伤的病理过程。

而预防性使用米诺环素，视网膜损伤减轻而且修复较快，同时tnf-α在视网膜表达明显减少，看来抑制tnf-α的过度分泌是米诺环素发挥神经保护作用的重要机制之一。

tnf-α主要来自单核巨噬细胞系统，而cns和视网膜中固有的巨噬细胞是神经胶质细胞中的小胶质细胞[6]，故cns和视网膜病理损伤时表达增加的tnf-α主要由小胶质细胞分泌， tnf-α被称为“小胶质细胞源性毒性细胞因子”之一。

已有多项研究发现，米诺环素是中枢神经系统小胶质细胞的抑制剂[7]，但尚未发现对其他细胞有抑制作用。

所以本实验条件下，小胶质细胞是光损伤后视网膜tnf-α的主要分泌细胞。

视网膜光损伤中米诺环素通过抑制小胶质细胞的过度活化，减少了tnf-α的过多分泌表达，从而发挥了抗凋亡活性。

米诺环素还有无其他可能发挥保护作用的机制还有待进一步的研究。

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