微生物技术实验
微生物培养实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握微生物的纯系分离技术。
2. 掌握微生物的接种方法和培养技术。
3. 了解微生物在不同培养基上的生长特征。
二、实验原理微生物的纯系分离是指从混杂的微生物群体中分离出单一菌种的过程。
常用的分离方法有平板划线法、稀释涂布法等。
微生物的培养是指为微生物提供适宜的生长条件，使其能够繁殖和生长的过程。
培养基是微生物生长的营养来源，包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 土壤样品- 琼脂培养基（牛肉膏蛋白胨培养基）- 蒸馏水- 无菌接种环- 灭菌器- 培养皿- 显微镜- 移液器- 恒温培养箱2. 实验仪器：- 电子天平- 高压蒸汽灭菌器- 酶标仪- 离心机四、实验步骤1. 土壤样品的采集与处理- 采集土壤样品，放入无菌容器中。
- 将土壤样品与蒸馏水按1:10的比例混合，搅拌均匀。
2. 稀释涂布法分离微生物- 取适量的土壤样品稀释液，用无菌移液器吸取适量样品，均匀涂布在琼脂培养基平板上。
- 将平板倒置放入恒温培养箱中培养。
3. 平板划线法分离微生物- 取适量的土壤样品稀释液，用无菌接种环蘸取样品，在琼脂培养基平板上划线。
- 将平板倒置放入恒温培养箱中培养。
4. 观察和记录- 观察平板上生长的菌落，记录菌落特征，如大小、形状、颜色等。
- 用无菌接种环挑取单个菌落，进行纯化培养。
5. 纯化培养- 将挑取的单个菌落接种到新的琼脂培养基平板上。
- 将平板倒置放入恒温培养箱中培养。
6. 观察和记录- 观察纯化后的菌落，记录菌落特征，如大小、形状、颜色等。
- 将纯化后的菌落接种到液体培养基中，进行扩大培养。
7. 扩大培养- 将纯化后的菌液用无菌移液器移入无菌锥形瓶中。
- 加入适量的琼脂，搅拌均匀。
- 将锥形瓶放入高压蒸汽灭菌器中灭菌。
- 将灭菌后的锥形瓶冷却至室温，加入适量的蒸馏水，搅拌均匀。
- 将锥形瓶放入恒温培养箱中培养。
8. 观察和记录- 观察扩大培养后的菌液，记录菌液的颜色、透明度等特征。
微生物培养的实验观察与分析
微生物培养的实验观察与分析微生物培养是一种重要的实验技术，通过培养微生物可以观察和研究它们的生长特性和代谢活动。
本文将描述一次微生物培养实验的观察与分析。
实验目的：观察不同环境条件下微生物的生长情况，并分析其对环境的适应能力。
实验材料：琼脂平板、无菌培养基、不同微生物菌株、无菌培养皿、无菌棉签、色素染液、无菌深瓶、无菌试管。
实验步骤：1.准备工作：将琼脂平板按照要求配置好，装入无菌培养皿中。
准备好培养基和色素染液。
清洁并消毒实验台面、培养皿、培养瓶等器材。
2.无菌操作：戴上实验手套，用火炙烧培养皿外侧，将琼脂平板打开后立即盖上，避免细菌污染。
用无菌棉签沾取所需微生物菌株，均匀涂抹在琼脂平板上。
3.分组实验：将不同培养条件（如温度、pH、营养成分等）下的微生物培养皿放入相应的培养箱或恒温培养箱中，控制培养时间和环境条件。
4.观察和记录：每天记录微生物培养皿中的菌落数量、大小、形状等信息，拍摄照片记录观察结果。
5.染色观察：在培养箱中寻找生长良好的微生物培养皿，取出后用色素染液进行染色。
染色后倒置放置一段时间，待色素渗透到微生物菌落内。
6.观察染色结果：用显微镜观察染色后的微生物菌落，注意观察染色颜色、形状、结构等特征，记录观察结果。
7.实验分析：通过观察和记录微生物培养皿中的菌落数量和生长情况，我们可以分析不同环境条件对微生物生长的影响。
例如，对于不同温度条件下的实验，可以观察到生长最快的微生物菌株，并确定其适宜温度范围。
对于不同 pH 条件下的实验，可以观察到微生物的酸碱适应能力，确定最适 pH 值。
对于不同营养成分的实验，可以观察到微生物菌落的生长和颜色变化，推测其对不同营养物质的利用能力。
通过染色观察微生物菌落的特征，可以初步判断微生物的种类和形态。
比如，革兰氏染色可以分辨出细菌的类型（革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌）。
不同菌株在菌落状况和形态上也会有所不同，比如有些菌落颜色发生变化，有些菌落形状不规则等。
微生物细菌实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解细菌的基本形态结构。
2. 掌握细菌的分离、纯化和鉴定方法。
3. 学习细菌生理生化反应的检测原理和应用。
二、实验原理细菌是单细胞微生物，具有典型的原核细胞结构。
通过观察细菌的形态、染色和生理生化反应，可以鉴定细菌的种类。
三、实验材料与仪器1. 材料：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等纯菌株。
2. 仪器：显微镜、接种环、培养皿、酒精灯、无菌水、生理盐水、革兰氏染色液、生理生化试剂等。
四、实验方法1. 细菌形态观察- 将细菌涂布在载玻片上，进行革兰氏染色。
- 使用显微镜观察细菌的形态、大小、染色性等特征。
2. 细菌分离与纯化- 将纯菌株接种于琼脂平板，进行划线分离。
- 观察菌落特征，挑选单菌落进行纯化。
3. 细菌生理生化反应检测- 进行糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、V-P试验等。
- 观察反应结果，判断细菌的生理生化特性。
五、实验结果与分析1. 细菌形态观察- 大肠杆菌：革兰氏阴性，呈杆状，两端钝圆。
- 金黄色葡萄球菌：革兰氏阳性，呈球形，呈葡萄串状排列。
- 肺炎克雷伯菌：革兰氏阴性，呈短杆状，两端钝圆。
2. 细菌分离与纯化- 划线分离后，观察到单菌落形成。
3. 细菌生理生化反应检测- 糖发酵试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均能发酵葡萄糖。
- 吲哚试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均呈阳性。
- 甲基红试验：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均呈阳性。
- V-P试验：金黄色葡萄球菌呈阳性，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌均呈阴性。
六、讨论与分析1. 通过观察细菌的形态、染色和生理生化反应，可以初步鉴定细菌的种类。
2. 细菌的生理生化反应具有特异性，可用于细菌的鉴定和分类。
3. 在实际应用中，细菌的分离、纯化和鉴定是微生物学研究和临床诊断的重要环节。
七、实验结论1. 通过本次实验，我们掌握了细菌的基本形态结构、分离、纯化和鉴定方法。
2. 我们学会了利用生理生化反应进行细菌的鉴定和分类。
3. 本实验有助于提高我们对微生物学基本理论的认识和应用能力。
微生物检测技术的使用方法和实验操作技巧
微生物检测技术的使用方法和实验操作技巧微生物检测技术是一种重要的实验手段，用于分析和检测环境、食品、药品等领域中的微生物污染情况。
本文将介绍微生物检测技术的使用方法和实验操作技巧，以帮助读者更好地理解和应用这一技术。
一、微生物检测技术的使用方法1. 样品准备在进行微生物检测之前，首先需要准备样品。
样品可以是环境中的空气、水质、土壤等，也可以是食物、药品等。
样品准备的关键是保持其在检测之前的原样性，并确保样品中微生物的数量能够被准确检测。
2. 样品处理样品处理是为了提取样品中的微生物，常用的方法有离心、过滤、稀释等。
离心用于分离样品中的大颗粒物质，以便更好地检测微生物；过滤则可以去除样品中的大颗粒物质和悬浮微生物，使样品更易于处理；稀释则是为了使微生物数量在适宜检测范围内。
3. 微生物培养微生物培养是为了增殖样品中的微生物数量，以便更好地进行检测。
常用的培养方法包括液体培养和固体培养。
液体培养适合于微生物数量较多、培养时间较短的情况；固体培养适合于较少微生物数量、培养时间较长的情况。
4. 微生物检测方法微生物检测方法根据检测目的和样品性质的不同而不同。
常用的微生物检测方法包括显微镜观察、生物化学检测、分子生物学检测和免疫学检测等。
显微镜观察适用于检测微生物的形态特征，能够直观地观察微生物的数量和分布情况；生物化学检测适用于分析样品中微生物的代谢产物，如酶活性、酸碱度等；分子生物学检测则可以通过分析微生物的DNA或RNA序列来确定其种属和数量；免疫学检测是通过与微生物特异性抗体的结合反应来检测微生物的存在。
二、实验操作技巧1. 严格遵守操作规程在进行微生物检测技术实验时，必须严格遵守实验室的规程和操作规范，包括个人防护、实验操作流程、废物处理等。
正确佩戴实验手套、防护眼镜等个人防护装备，减少实验操作中的污染风险。
2. 实验仪器的选择与操作根据具体的实验目的和方法，选择合适的实验仪器和设备。
例如，在培养微生物时，选择合适的培养皿、培养基和培养箱等；在显微镜观察微生物时，选择适合的镜头和聚焦方式等。
医学微生物学实验技术
咽拭子、粪便、血液等。
样品保存与运输
03
采集后尽快送检，如需暂存，应选择合适的保存条件和运输方
式，避免样品变质或污染。
分离与纯化方法选择依据
微生物种类与特性
不同微生物具有不同的生长特性和营养需求，需选择适合的分离 与纯化方法。
样品来源与污染程度
样品来源和污染程度不同，需采用不同的分离与纯化策略。
实验目的灭菌
对实验器材、培养基等进行严 格消毒或灭菌处理，防止微生 物污染。
废弃物处理
对实验废弃物进行分类、收集 和处理，避免对环境和人员造
成危害。
03
微生物分离与纯化技 术
微生物样品采集与处理方法
采集工具与容器选择
01
无菌棉签、无菌吸管、无菌容器等，确保采集过程中不污染样
品。
采集部位与方法
02
根据微生物种类和感染类型，选择合适的采集部位和方法，如
利用PCR技术可以特异性地扩 增微生物的某个或某些基因片 段，实现快速、灵敏的微生物 检测和鉴定。
将大量的微生物基因探针固定 在芯片上，通过与待测微生物 样品的杂交反应，可以一次性 检测多种微生物的存在和种类 。
通过直接提取环境样品中的全 部微生物DNA进行测序和分析 ，可以研究微生物群落的组成 、结构和功能，为微生物生态 和进化研究提供新视角。
的利用能力和酶活性。
应用领域
生理生化鉴定技术广泛应用于临 床微生物学、食品微生物学、环 境微生物学等领域，用于检测和 鉴定病原微生物、食品污染菌等
。
分子生物学鉴定技术进展
基因测序技术
聚合酶链式反应（PCR）
生物芯片技术
宏基因组学技术
通过测定微生物的基因组序列 ，可以准确鉴定微生物的种类 和遗传特征，为微生物分类和 进化研究提供有力手段。
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1．培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。
加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
C. 无菌生理盐水和保种液：生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液：生理盐水，加25%甘油D. 碳源优化培养基：以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。
微生物实验技术操作手册
微生物实验技术操作手册一、实验介绍微生物实验技术操作手册旨在为研究人员提供详细的实验步骤和操作指南，以确保实验的准确性和可重复性。
本手册涵盖了微生物实验的基本原理、实验材料和设备的准备、实验步骤以及结果分析等内容。
通过遵循本手册的操作指南，研究人员可以顺利进行微生物实验，并获得可靠的实验结果。
二、实验材料和设备准备1. 实验材料：- 微生物培养基：根据实验需要选择适当的培养基，如LB培养基、TSB培养基等。
- 微生物菌种：根据实验目的选择所需的微生物菌种。
- 试剂：如抗生素、染料等。
- 培养皿、试管、移液器等实验器材。
2. 实验设备：- 培养箱：用于控制培养温度。
- 离心机：用于离心培养物。
- 恒温振荡器：用于培养物的摇床培养。
- 显微镜：用于观察微生物的形态和结构。
三、实验步骤1. 准备工作：- 消毒操作台和实验器材：使用适当的消毒剂对操作台和实验器材进行消毒处理，以确保实验环境的无菌。
- 培养基制备：按照培养基配方准备培养基，并进行高压灭菌处理。
- 微生物菌种制备：选择适当的菌种进行预培养，以获得足够的菌量。
2. 培养操作：- 接种：将预培养的菌种接种到含有适当培养基的培养皿或试管中。
- 培养条件控制：根据菌种的生长要求，设置适当的培养温度、pH值和培养时间。
- 培养物观察：使用显微镜观察培养物的生长情况，并记录相关数据。
3. 实验操作：- 抗生素敏感性实验：将不同浓度的抗生素添加到含菌培养基中，观察菌落的生长情况，以确定菌株对抗生素的敏感性。
- 染色实验：使用适当的染料对微生物进行染色，观察染色后的微生物形态和结构。
四、结果分析根据实验操作所获得的结果，进行相应的数据分析和结果解读。
通过比较不同实验组的结果，可以得出结论并提出相应的讨论。
五、注意事项- 操作前需仔细阅读实验操作手册，并按照操作指南进行实验。
- 严格遵守实验室的安全操作规程，佩戴适当的个人防护装备。
- 实验过程中保持实验环境的无菌和洁净。
微生物常用实验3篇
微生物常用实验第一篇：细菌涂片染色实验细菌涂片染色实验是微生物学中最基本的实验之一。
通过染色方法，使细菌变得可见，便于观察形态、结构、数量等特征，有利于研究其生长、代谢、致病性等方面。
下面，我们来介绍细菌涂片染色实验的具体步骤：一、制备细菌涂片1.取出培养基上生长良好的细菌菌落，用不锈钢嵌片环沿中心点轻压一下。
2.将嵌片环中的菌落涂匀于无菌载玻片上，制备成直径约1厘米的薄片。
3.待载玻片上的细菌涂片晾干，并用火焰消毒。
二、涂片染色1.用火焰将铺有细菌涂片的玻片烤干。
2.将烤干的玻片浸入甲醇中，固定一分钟，再用水漱洗。
3.将玻片浸入碘酒中，固定一分钟，再用水漱洗。
4.将玻片浸入乙醇中，使背景颜色褪去，再用水漱洗。
5.将玻片浸入洋红染色液中，染色时间不超过1分钟。
6.用水冲洗干净，晾干后可以在显微镜下观察。
通过细菌涂片染色实验，我们可以直观地观察到细菌的形态、大小、聚集情况、颜色等，有助于鉴定细菌种类，并进一步深入研究其生物学特性。
第二篇：厌氧培养实验厌氧菌是一类生长需要在完全无氧条件下进行的微生物。
在许多疾病的发病机制中，厌氧菌都发挥着重要作用，因此，研究厌氧菌对于认识疾病的发病机制具有极其重要的意义。
下面，我们来介绍厌氧培养实验的具体步骤：一、制备厌氧培养基制备厌氧培养基是进行厌氧菌培养的关键。
具体操作步骤如下：1.准备培养基，并在其中加入培养菌株所需的配方和其他适宜的添加剂。
2.将培养基分装到无菌针筒或暗口瓶中。
3.在体积的一半至三分之二处加入去氧剂（一般为Thioglycolate或Dithiothreitol）。
二、厌氧细菌接种与培养1.准备厌氧细菌培养物的接种种子。
一般情况下，把生长适应在厌氧条件下的细菌进行分生处理来获得设计数量的细胞，并将其重新悬浮在与培养基相同的缓冲液中。
2.在无氧条件下接种厌氧菌，避免暴露于空气中。
可以通过使用瓶盖和橡胶塞的局部替代或全封闭气密容器的方法来实现无氧条件。
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② 影印法 • 取无菌MM、LB培养基各一皿，在平皿底部 画箭头作为方向标记。选择一个菌落分散 的培养皿作为母平皿，作如上标记，并在 影印板上也作同样标记。 • 将母平皿对好标记倒放在影印板的绒布上， 然后轻轻放下，立即把MM培养皿对好标记 倒放在影印板下，取下MM培养皿，再印 Cu-TY培养板。 28℃培养两天左右。
Ⅱ 诱变育种
培养基
LB培养基（完全培养基）：蛋白胨 10g，酵母提取物
5g，NaCl 5g，蒸馏水 1000ml，pH7.0-7.2
基本培养基MM：(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 7g，KH2PO4 3g，
柠檬酸钠 0.5g，MgSO4· 7H2O 0.1g，葡萄糖 5g，蒸馏水 1000ml，pH自然（~7.0）
Ⅲ 发酵生产黑色素—实验步骤
1、菌种活化 取保藏斜面菌种划线接种于CuTY平板，28℃ 培养24小时。
2、种子培养 接一单菌落至装有5mL液体LB培养基的试管 中，28℃振荡培养24小时。
3、 发酵培养 将上述培养液1ml分别接种到四种装有50ml发酵培 养基的250ml摇瓶中，8层纱布封口，28℃、 200rpm的恒温摇床上培养。 4、取样 每隔24小时取4ml的发酵液，离心后取上清液用 721型分光光度计测 OD400值。OD400值表示各实 验菌株产黑色素状况，结果填入表3。菌体沉淀用 4ml的蒸馏水悬浮后测 OD600（菌浓度）。直至培 养96小时结束。
发酵培养基
⑴ FW发酵培养基： 葡萄糖 2g，(NH4)2SO4 5g， K2HPO4 3g，KH2PO4 3g， NaCl 5g，MgSO4 1g，L-酪氨酸 1g，水1000ml，pH7.0； ⑵ CuFW发酵培养基： 在1000ml FW发酵培养基中加入CuCl2 0.1mM ；
⑶ TY发酵培养基： 葡萄糖 1 g，蛋白胨 5 g，NaCl 5 g，氯化钙 0.1 g， 酪氨酸 1 g，水1000ml，pH7.0 ⑷ CuTY培养基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g， CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0
Vegetable & fruit browning
Diseases:
Hale Waihona Puke Albinism Melanoma Correlate with Parkinson disease Deaf
酪氨酸酶研究前沿
酪氨酸酶的应用
• 1.合成左旋多巴和黑色素 :帕金森病 等； • 2.食品工业方面——褐变：色泽
(凡是有亚硝基胍的器皿，都要置于通风处用1N NaOH溶液 浸泡，使残余的亚硝基胍分解破坏，然后清洗。注意不要 让含有NG的上清液滴在皮肤或衣物上)
6、营养缺陷型的检出 ① 点种法 取基本培养基(MM)和完全培养基(LB)平板， 作好成对与方向的标记(即一皿MM和一皿 LB为一对)，将事先已编号的格子纸分别放 在两培养皿的底部。用无菌牙签小心地在 待测菌落表面挑取少许细胞，分别点在MM 和LB培养皿的对应位置上(先点MM，后点 LB)。尽可能多点些菌落。置28℃培养两天。
黑色素具有选择性抗病毒活力，能阻止HIV病毒、流感病毒对动物细胞的感染
细菌黑色素合成关键酶 ——酪氨酸酶Tyrosinase (EC 1.14.18.1)
酪氨酸酶研究前沿
酪氨酸酶的生化性质及生理功能
• 酪氨酸酶（EC 1.14.18.1），广泛存在于 动物、植物及微生物中 • 特殊之处：同时具有两种不同的催化活性： 以单酚物质如酪氨酸为底物的单酚氧化酶 的活性，又称甲酚酶活性；以双酚物质如 左旋多巴为底物的双酚氧化酶的活性，又 称为儿茶酚氧化酶活性
Melanin
SEM Angel et al. J Immunol Methods 2000 Lopez-Serrano et al. Microbiology 2007
黑色素的研究概况
黑色素的类型及其合成途径
真黑色素：多巴途径 棕黑色素 ：酪氨酸氧化为多巴后，有半 胱氨酸参与反应 异黑色素 ：植物和微生物 脓黑色素：尿黑酸途径 神经黑色素 ：脑中产生
CuTY培养基： 蛋白胨 16 g，NaCl 5 g，酵母抽提物10 g，
CuCl2 0.1mM ，酪氨酸 2mM(0.36 g) ，水1000ml，pH7.0
Ⅱ 诱变育种
实验步骤
1、制备菌悬液 ① 挑取少许斜面菌种接种于盛有5ml LB液体 培养基的试管中，28℃振荡培养过夜。 ② 取0.5ml培养液转入另一盛有5ml LB液体 培养基的试管中，28℃振荡培养6-7小时。 2、制作平板 将LB固体培养基融化，倒平板，凝固后待用。
表1 初测结果（用“+”表示生长）
菌落编号 添加物
1
2
3
4
5
6
7
……
氨基酸 维生素 碱 基
表2 准确鉴定结果
菌落编号 菌落生长区 缺陷的营养物质 1 2 3 4 5
Ⅲ 发酵生产黑色素
现代意义的发酵主要是利用微生物对周围环境极大 的适应能力、极强的消化能力和繁殖能力等特点， 通过发酵罐大量繁殖微生物来制备所需产品。 发酵工业的生产流程一般是：保藏斜面→活化斜面 →摇瓶种子→种子罐→发酵罐，小型实验可以略 去种子罐一步。 本实验中主要使用摇瓶进行发酵条件的实验。发酵 生产过程中要随时观察菌体生长情况。本实验与 生产中菌浓度的测定方法一样，采用分光光度计 法。
酪氨酸酶研究前沿
酪氨酸酶的的结构
a)Octopus dofleini 血蓝 蛋白； b)Limulus polyphemus 血蓝蛋白 c)Lpomoea batatas儿茶 酚氧化酶； d)castaneoglobisporus( 链霉菌)酪氨酸酶； e) 四个活性位点的重叠说 明四种蛋白活性中心具 有高度的结构相似性。
• 3.有机合成及化学修饰 • 4.应用于生物传感器 ：检测酚类等
实验步骤
Ⅰ 分离产黑色素的细菌 Ⅱ 诱变育种 Ⅲ 发酵生产黑色素
Ⅰ 分离产黑色素的细菌
在自然界中，土壤是微生物生活的大本营， 是人类开发利用微生物资源的重要基地。 分离微生物的策略 分离微生物常用的方法： 稀释平板分离法和划线分离法
③ 夹层法 • 取无菌培养皿3皿，各倒一薄层( 约5 ml )MM培养 基，凝固后加入0.1 ml经诱变处理的10-5倍稀释 液，再加入约5 ml的MM培养基，摇匀，凝固后再 盖上一层约5 ml的MM培养基。待凝固后置28℃ 培养两天左右。 • 取出上述培养平板，在皿底把已长出的菌落作好 标记，统计其菌落数，再盖上一层约5 ml的半固 体LB培养基。置28℃培养两天。
⑶ 产黑色素的性质 观察挑选菌株所产黑色素的基本性质。
Ⅱ 诱变育种
获得营养缺陷型（生物素）高产黑色素的菌株
实验原理 基因突变是微生物诱变育种的理论依据。 生物经理化因子的处理可以提高基因突变的频率， 因此采用物理因素或化学因素处理微生物，使其 体内的DNA发生改变，以提高突变频率和扩大遗传 变异的幅度，然后从中筛选出所需要的突变菌株， 这便是诱变育种。 其中在营养上表现出某种缺陷的变异菌株，叫做缺 陷型菌株。它是遗传学研究和遗传育种工作中不 可缺少的重要材料。
3、 涂平板 取0.1ml 上述菌液放到LB培养基平板上， 用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂满整个平 板表面。 4、 诱变 ① 在上述平板稍靠边的一个位点上放少许亚 硝基胍结晶，然后将平板倒置于培养箱中 28℃培养24小时。 ② 在放亚硝基胍的位置周围将出现抑菌圈。
5、 涂布平板
① 挑取紧靠抑菌圈外侧的少许菌苔到装有4.5ml生 理盐水的试管中，摇匀，制成处理后菌悬液。 ② 取上述菌悬液0.5ml于盛有4.5ml生理盐水的试管 中，稀释到10-4。分别取10-1、10-2、10-3和10-4稀 释液涂布LB平板，每个平板涂0.1ml，经诱变处 理的稀释液每稀释度涂布3个平板，置28℃培养 两天。
② 准确鉴定 按上述方法，将初步测定为某一类缺陷型的 菌株制成菌悬液，涂布在MM培养基上。在 皿底划分区域，划分的区域数和需添加的 生长因素编组数相同。 按区域对应地加入编组混合物。碱基的种类 较少，可单一地加入，不必分组。28℃培 养两天后观察结果。
9、 产黑快慢的比较 将鉴定的营养缺陷型菌株与出发菌株分别 在CuTY平板上划线，比较各个菌株产生 黑色素的快慢，置28℃培养两天。之后 选取高产黑色素的菌株进行发酵。
亚硝基胍（NG或NTG）是一种广泛使用的强诱 变剂。它主要在DNA链的复制区引起G:C A:T转换，即使在杀菌率很低的情况下也能 诱发高频率的突变。对于细菌的处理一般 通过制作杀菌曲线，采用杀菌率在70%90%的诱变剂量处理微生物为好。 本实验采用亚硝基胍对分离菌株进行诱变。 主要用点种法和影印法检出缺陷型菌落， 并用生长谱法进行鉴定，获取生物素营养 缺陷型高产黑色素的菌株。
上述三种方法中，在MM培养基上不长而在 LB培养基上生长的菌落可能是缺陷型菌株， 需要进一步复证。
7、将可能为缺陷型的菌落编号，分别接入 5ml LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。
8、营养缺陷型的鉴定 ① 初步鉴定 取0.1 ml培养液涂布在MM培养基上。待干后： 皿底按图分成三个区域，并分别标上A(混 合氨基酸)，V(混合维生素)和B(碱基混合 物 )。 在每一区域中央分别对应地加入混合氨基酸、 混合维生素和碱基混合物。置28℃培养两 天后，区别该菌属于哪一类缺陷型。
微生物技术实验