枯草芽孢杆菌培养基的优化分析研究

目录枯草芽孢杆菌培养基的优化研究- 2 -1 枯草芽孢杆菌简介及应用- 3 -1.1 枯草芽孢杆菌简介- 3 -1.2 枯草芽孢杆菌应用- 3 -2材料和方法- 4 -2.1 实验材料- 4 -2.1.1 菌株- 4 -2.1.2 培养基- 5 -2.1.3 仪器与设备- 5 -2.2 培养基的优化- 5 -2.2.1 培养方法- 5 -2.2.2 检测方法- 5 -2.2.3含水量对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.4稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.5氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.6碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.7碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 6 -2.2.8 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -3 结果和分析- 7 -3.1含量水对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -3.2稻草粗细程度对枯草芽孢杆菌生长的影响- 7 -3.3氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -3.4碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响- 8 -3.5碳氮比对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 -3.6 pH对枯草芽孢杆菌生长的影响- 9 -参考文献- 10 -枯草芽孢杆菌培养基的优化研究摘要。

随着国家对农业的支持，微生物化肥有农业中的应用也越来越受到重视。

而枯草芽孢杆菌在农业方面和其它方面都有广泛的应用，因此，对枯草芽孢杆菌的研究也越来越多，对枯草芽孢杆菌的需要也越来越大。

为了在枯草芽孢杆菌的工业生产中，降低生产成本而又能提高枯草芽孢杆菌的产量，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基进行研究。

本文先就培养基的主要原料，含水量，碳源，氮源，碳氮比，pH等几个因素作单因素实验。

研究表明最佳培养基是：稻草49.05%，玉M粉2.25%，尿素0.9%，CaCO 1.8%，KH PO 1.0% ，水含量57%，pH 7.8[1][2]。

关键词。

枯草芽孢杆菌。

培养基优化[3]。

应用Bacillus subtilis culture medium optimizationAbstract :along with the country the support to agriculture, microbialfertilizer has application in agriculture has been paid more and moreattention. And Bacillus subtilis in agriculture and other aspects of awide range of applications, therefore, on Bacillus subtilis are studiedmore and more, on Bacillus subtilis needs more and more. In order toBacillus subtilis in industrial production, reduce production cost andcan improve the yield of Bacillus, Bacillus subtilis fermentationmedium of.This article first medium main raw material, water content, carbonsource, nitrogen source, carbon and nitrogen ratio, pH and several otherfactors single factor experiment. Research shows that the optimummedium was49.05%: straw, corn flour 2.25% ,urea 0.9%,CaCO 31.8%,KH3 PO 4 1%, water content 57%, pH 7.8[1] [2].Key words:Bacillus subtilis。

medium optimization。

application1 枯草芽孢杆菌简介及应用1.1 枯草芽孢杆菌简介枯草芽孢杆菌<Bacillaceae）编号为Strain Number ACCC 11060，是芽孢杆菌属的一种。

单个细胞0.7～0.8×2～3微M，着色均匀。

无荚膜，周生鞭毛，能运动。

革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微M，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，需氧菌。

可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚[1]。

早在1835 年，Ehrenberg 所描述的“Vibrio subtilis”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由Cohn 于1872 年正式命名的，现作为芽孢杆菌科(Bacillaceae> 的模式菌株[2]，芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。

1.2 枯草芽孢杆菌应用[4]枯草杆菌(B acillus Subtilis> 是一种重要的α-淀粉酶生产菌。

同时枯草芽孢杆菌作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研诸领域。

随着经济的发展、科研水平的提高，枯草芽孢杆菌与人们的日常生活将更为密切，它也必将作为一种十分重要的工业微生物菌种越来越引起人们的普遍关注和青睐。

①枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用[5]工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。

枯草芽孢杆菌是当今工业酶生应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50 %。

由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。

②枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用[5]-[7]枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用美国迄今已有4 株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713 菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM，并于2000 年通过美国环保局(EPA> 的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。

我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。

③枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好实验材料[5]枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200 种原核和真核生物来源的蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。

④枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中的应用[5]枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。

枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。

另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。

⑤枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用[5]研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。

⑥枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用[5]枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体及有害气体(氨、硫化氢等> ，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等> ，后分解为更小分子的有机物，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD ，使水体中氨基氮(NH3-N> 、亚硝基氮(NO2-N> 和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质，同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。

浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体。

越来越多研究发现，枯草芽孢杆菌可在水产养殖中发挥重要的作用。

2材料和方法[6]～[19]2.1 实验材料2.1.1 菌株枯草芽孢杆菌2.1.2 培养基牛肉膏蛋白胨液体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5gNaCl，1000mL蒸馏水，pH 7.2—7.5。

牛肉膏蛋白胨固体培养基：5g牛肉膏，10g蛋白胨，5g NaCl，20g琼脂, 1000mL蒸馏水，pH 7.2—7.5。

1号培养基：3g木屑, 0.4g葡萄糖,0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。

2号培养基：3g稻草, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL 水。

3号培养基：3g玉M芯, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2g CaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL水。

4号培养基：3g糠壳, 0.4g葡萄糖, 0.2g蛋白胨, 0.2g酵母膏, 0.2gCaCO3 ,0.1g KH2PO4 ,16mL 水。

2.1.3 仪器与设备高压灭菌锅、超净工作台、37℃摇床培养箱、培养箱、光学显微镜、电烘箱、电子天平、分析天平、冰箱、三角瓶、接种环、试管、培养皿、酒精灯2.2 培养基的优化2.2.1 培养方法先用接种环接种1环试管菌种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，200r/min，37℃培养24h，进行扩大培养和活化，然后再取1mL液体种接种到发酵培养基中，37℃培养48h。

2.2.2 检测方法活菌的检测方法：称量大概5g发酵48h后的培养基溶解在50mL无菌水中,200r/min，20min 摇散得10，再用5mL无菌吸管吸取5mL到45mL无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到一个适当的稀释度，取0.1mL稀释液到无菌牛肉膏蛋白胨固体培养基中并涂匀，37℃培养24h，然后数培养皿上的菌落数[7]。

芽孢率的检测方法：称量大概5g发酵48h后的培养基溶解在50mL无菌水中,200r/min，20min摇散得10，再用5mL无菌吸管吸取5mL到45mL无菌水中，摇匀得10，依次这样稀释到10，取0.02mL滴到载玻片上，涂匀，用酒精灯烘干，然后用酚酞染色1min，用清水冲洗，再用酒精灯烘干，镜检，找几个清晰的画面，数画面中的芽孢数和杆数，取其平均值，即可得到其芽孢率。