猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用
猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用
ＰＣＲ ｓ ａ ｏ ｅ ｅ ｔ ｎ ０ ｙ ｏ ｌ ｓ ａ ｈ ｏ ｎ ｕ ｏｄ ｅ ａ ｄ ｉ ａ ｓ ｙ ｆ ｒ ｄ ｔ ｃ ｉ ｆＭ ｃ ｐ ａ ｍ ｙ ｐ ｅ ｍ ｒ ａ ｎ ｔ ｏ ｓ
（ Ｓ ａ ｄｉ ｌ ｉａ ａ ｐｉ ｔｎ ． ａ ｆ ｒ ｅ ａ ｅｉ ｅ ｒｔｅｄｔｃ ｏ ｆＭ ｅｐａｍａｈ ｏｎｕ ｏｉｅ（ ｐ ＭＰ ） ｎ ｓｃ ｎｃ ｐ ｌ ａ ｏｓ Ａ ｐ ｉｏ ｉ ｒ ｓｄｓ ｎｄｆ ｅ ｔｎ ｏ ｙｏｌｓ ｙｐ ｅ ｍ ｎａ Ｍｈ） ｔ ｉ ｌ ｃｉ ｒ ｐｍ ｗ ｇ ｏ ｈ ｅｉ
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猪细小病毒病PCR检测方法的建立及应用
保健科 技 公 司 提 供 （ 号 ０４４ １ ， 小 病 毒 核 酸 批 ０ ００ ） 细 模板 分离 自细 小 病毒 血 清 检测 阳性 病 猪 组 织 ， 料 病 采集 于 临床 表现 体温 升 高 ， 呼吸 困难 ， 腹泻 的 患病断 奶仔 猪 及 呼 吸 困难 、 殖 障 碍 的母 猪 和 流 产 胎 儿 。 繁
１ ２ 引物 设 计 和 合 成 根 据 Ｎ Ｂ ． Ｃ Ｉ中 已登 录 的
反 应体 系 中 ， 上 下游 引 物 （０ｕ ｏ Ｌ 各 ０ ５ ｌ 含 ２ ｍ ｌ ） ｆ ． ，
ｄ Ｔ （ ０ｍ Ｎ Ｐ １ Ｍ）０ ５ ｔ ， “ １ ５ ｔ ，０×Ｐ Ｒ ｂ ｆ ． ｘ Ｍｇ ． ｘ １ ｌ ｌ Ｃ ｕｅ ｉ
至研 钵 内 ， 研磨 ５～１ ｎ 倒 人 １５ｍ 离 心管 内 ， ０ｍｉ后 ． ｌ 在 一 ０ 冻融 ２次 ，００ｒｍｉ ２℃ ５ ０ ／ ｎ离心 ５ｍｎ 备用 。 ｉ， １４ Ｄ Ａ抽 提 （ 照 Ｑ Ａ Ｅ ． Ｎ 参 ＩＧ Ｎ试 剂盒说 明书 ） 吸
取 ２０Ｉ 经 处 理 的 组 织 样 品 至 １ ５ｍ 离 心 管 中 ， ０ ｌ ｘ ． ｌ
病 毒病 检测 方 法 。
１ 材 料 与方 法
加人 １０ ｔ Ｔ ８ ｘ Ａ Ｌ液 ； 人 ２ ｌ蛋 白 酶 Ｋ， 旋 ， ｌ 加 ０ 涡 ５ ℃ 孵化 ｌ～ ， 时 涡 旋 （ 夜 效 果 更 好 ） ５ ３ｈ 不 过 ；涡 旋 １ ，加 ２０ Ｉ Ｌ液 ，充 分 涡 旋 ，７ ℃ 水 浴 １ ５Ｓ ０ ｘ Ａ ｌ ０ ０ ｍｎ 加 ２０Ｉ 元 水 乙 醇 ， 分 涡 旋 ； 离 心 管 中液 ｉ； ０ ｌ ｘ 充 将
维普资讯
一步法RT—PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的方法建立及应用
Ｐｏ ｃ ｎ ｐｒ ｄｕ ｔｖ ｎ ｓ ｉａ ｏ ｙ Ｓ ｎ ｏ ｒ ｓ ｒ ｉ ｅ Ｒｅ ｏ ｃ ｉ ｅ ａ ｄ Ｒｅ ｐ ｒ ｔ ｒ ｙ ｄｒ ｍｅ Ｖｉ ｕ
Байду номын сангаас
Ｃ Ｉ ｉ ａ ｇｅ ａ． Ａ —ｇｎ ｔ １ Ｑ （ ｉｇａ Ａ ａｅ ｙｏ ｎｍ ｎ ｅ ｒ ａ ｃ ｎｌ， ｉｉｇ８ ０ １ ） Ｑ ｎｈ ｉ ｃｄ ｍ ｆ ｉ ａａ ｄＶ ｔ ｉ ｒ Ｓｉ ｃ Ｘｎｎ １０ ６ Ａ ｅｎ ｙ ｅ ｓ
摘 要： 根据 Ｇ ｎ Ｂ ｎ 公 布的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（ Ｒ Ｓ 美洲型毒株 Ｖ ２ ３ ｅｅ ａｋ Ｐ Ｒ Ｖ） Ｒ一 ３ ２序列 设计了一对特异 性引物 Ｐ ／ ２ 扩增片段为 ５ ８ ｐ 从 而建立 了检 测 Ｐ Ｒ Ｖ的一步法 Ｒ Ｐ Ｒ蛤测方法 ， 异性试验 表明 ， 引物均不 １Ｐ ， ０ｂ ， ＲＳ Ｔ— Ｃ 特 该 能扩增 其它常 见的与 繁殖障碍有关 的病毒基 因。敏感性实验 表明 ， 引物可 以检测到 １ ～Ｔ Ｉ 的病 毒含量 。利用 该 该 ０ ＣＤ 。 方法对青海某猪场 中 ２ ０份临床上疑似 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ的组织进行检测 ， 中 ｌ 其 ６份样品呈 Ｐ Ｒ Ｖ阳性结果 ， ＲＳ 阳性率 为 ８ ％ ， ０ 表明 建立的该方法完全可 以快速检测组 织中的 Ｐ Ｒ Ｖ。 Ｒ Ｓ 关键词 ： 猪繁殖 与呼 吸综合征 ； 病毒 ； Ｔ— Ｃ Ｒ Ｐ Ｒ； 中 图分 类 号 ：８ １４ ￥ ５ ． 文 献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ３７５ （０ ０ ０ －０４０ １０ －９ ０ ２ １ ） １ ０ －３ ０ Ｅｓａ ｉｈ ｅ ｎ ｐｌ ａ ｉ ｎ ｏ ｅ ｓｅ ＲＴ． ｔ ｂｌ ｍ ｎｔａ ｄ Ａｐ ｉ ｔｏ ｆ Ｏｎ ．ｔ ｐ ｓ ｃ ＰＣＲ ｔ ｃ ｅ Ｄｅ ｅ ｔ ｄ
猪病诊断和防治中PCR技术的应用
X u m u s h o u y i随着我国畜牧业的全面发展，带动了农村经济水平的提升。
在畜牧养殖过程中，最多的动物品种就是猪类养殖，面临着市场对猪肉食品需求越来越大，我国猪类养殖规模不断扩大，为畜牧养殖企业和个体户带来了丰厚的收益。
但是在实际养殖过程中，猪病是影响健康养殖的主要因素，而诊断和防治技术是解决猪病的主要手段。
在现代科技的影响下，广泛采用了PCR猪病诊断技术，同时快速和精准的发现猪病的原因，找出病原菌，有利于进一步开展治疗。
一、PCR技术概述随着我国现代科技的发展，在畜牧领域中广泛引入了PCR 技术，并且在猪病诊断和防治工作中发挥出良好的作用。
其中，PCR技术凭借着操作简单，特异性强以及扩增效果俱佳等特点，在猪病诊断和防治中实现了全面推广与应用。
而PCR技术在实际运用中，可以达到快速扩散的效果，从而对微量基因进行全面监测，并在PCR技术的支持下，还会对寡核苷酸产生影响，而寡核苷酸也是靶序列的重要引物。
目前，我国PCR技术仍然不断突破，并在以往技术水平上实现了创新技术，提出了PCR荧光定量技术、RT-PCR技术以及PCR多重技术等新型技术手段，并在猪病诊断和防治中取得了良好的应用效果，具有重要的应用价值。
二、PCR技术在猪病诊断与防治中的实际应用1、猪2型环病毒中PCR技术的运用在我国猪类养殖活动中，猪2型环病毒属于一种微型动物病毒，结合以往的养殖经验分析，对于PCV1和PCV2血清来说，前者具有非致命性，而后者属于致病性病毒。
猪2型环病毒的临床现象一般会造成断奶仔猪的多器官衰竭综合征，如果为急性病种，那么致死率高达10%，同时对猪的生长发育也造成严重的影响。
对于这种猪病的防治来说，可以采用疫苗接种的方式进行预防，同时也可以使用抗生素类药物进行猪2型环病毒进行治疗。
结合该病毒的调查发现，这种病毒的基因序列设计引物是以临床分离出的病毒基因为模板，并在促进反映环境下，利用PCR技术准确的检测出猪2型环病毒ORF2基因，同时也能够展现出良好的特异性，具有较高的诊断率。
猪2型圆环病毒感染的PCR检测及甘肃株的同源性分析
猪2型圆环病毒感染的PCR检测及甘肃株的同源性分析猪2型圆环病毒（PDCoV）是一种对猪群健康产生严重影响的病毒，它引起了猪产业的巨大损失。
PCR（聚合酶链反应）是一种常用的病毒检测方法，可以快速、准确地检测出PDCoV的存在。
本文将介绍PDCoV的PCR检测方法以及对甘肃株的同源性分析。
首先，我们需要准备样品。
为了进行PDCoV的PCR检测，我们需要收集猪粪便等样品，并将其保存在适当的条件下，以确保样品中病毒的完整性和稳定性。
收集的样品应当来源于不同地点和不同时间的猪场，以保证样本的多样性。
接下来，我们需要提取样品中的病毒RNA。
病毒RNA提取是PCR检测的前提，它可以通过商业化的RNA提取试剂盒或自制方法来实现。
重点在于保证提取的RNA质量和纯度，以确保PCR反应的准确性和可靠性。
完成RNA提取后，我们可以进行PDCoV的PCR检测。
PCR反应是一种基于DNA聚合酶的体外扩增方法，可以将目标DNA的特定片段放大到可检测的浓度。
在这里，我们需要选择合适的引物和探针，以扩增并检测PDCoV的特定基因区域。
在PCR反应中，我们首先需要将提取的RNA反转录为cDNA，以便使用DNA聚合酶进行扩增。
接着，我们将cDNA与引物和探针一起放入PCR反应管中，进行PCR扩增。
PCR反应通常包含一个热启动步骤，用于激活DNA聚合酶，并一系列的循环步骤，包括变性、退火和延伸，以完成DNA片段的扩增。
扩增结束后，我们可以使用凝胶电泳等方法，检测PCR产物的存在与否。
通过凝胶电泳，我们可以观察到特定大小的PCR产物，从而确定猪样品中是否存在PDCoV。
在对PDCoV进行PCR检测后，我们可以进一步对甘肃株的同源性进行分析。
同源性分析可以帮助我们了解不同样品中PDCoV的遗传相似度，并揭示其传播途径和流行规律。
同源性分析通常使用序列比对和系统进化分析等方法。
首先，我们需要提取PDCoV阳性样品中的RNA，并通过逆转录为cDNA。
猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ Ｖ ｅ ｅ ｉ ａ ｙ Ｍ ｅ ｉ ｉ ｏ ｒ ｓ ｎ ｔ ｒｎ ｒ ｄ ｃｎｅ
猪 细 小 病 毒 、 狂 犬 病 病 毒 和 猪 圆 环 病 毒 ２型 伪 多重 Ｐ ＣＲ 检 测 方 法 的 建 立 及 应 用
测 方法可 用 于临床样 品 的检 测 ， 为疾病诊 断提供 参 考 。
关键 词 ： 细 小病 毒 ； 猪 伪狂 犬病 病毒 ； 圆环病毒 ２型 ； 猪 多重 Ｐ Ｒ Ｃ
中图 分 类 号 ： ８ ； ８ ８ ２ Ｑ７ ９ ￥ ５ ． ８ 文 献标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ７ ５ ３ （ ０ １ ０ — ０ ５０ １０ —０ ８ ２ １ ）８０ ２—７
的发 生 ， 如感染 仔猪 先天 性震 颤 、 奶仔 猪 多系 统衰 断
用方 法 ， 也为 养殖 企 业对 这 ３种 疫 病 的 防控 提 供基
础 资料 和参考 。
１ 材 料 与 方 法
１ １ 材 料 ．
竭综 合征 和猪皮 炎 与肾炎 综合 征 等［ 。 ４ ］ 聚 合 酶 链 反 应 （ ｏｙ ｒｓ ｈ ｉ ｅ ｃｉｎ ｐ ｌｍｅａｅ ｃ ａｎ ｒａｔ ， ｏ
Ｐ Ｖ） 伪狂犬 病病 毒 （ ｓｕ ｏａ ｉｓｖｒｓ Ｐ Ｐ 、 Ｐ ｅ ｄ ｒ ｂｅ ｉ ， ＲＶ） 猪 ｕ 、
圆环病 毒 ２型 （ ｏ ｃ ｅｃ ｃ ｖｒ ｓｔｐ ， Ｃ ２ 是 Ｐ ｒｉ ｉ ｏ ｉ ｙ ｅ２ Ｐ Ｖ一） ｎ ｒ ｕ 当前 影 响 养 猪 业 发 展 的 ３种 重 要 的 病 原【 。 由 于 １ ］ Ｐ Ｖ、 Ｒ Ｐ Ｖ ２单 独 感 染 或 混 合 感 染 均 能 引起 Ｐ Ｐ Ｖ、 Ｃ 一 猪发病 ， 造成 母 猪 的 繁 殖 障 碍／ 染 猪 的 免疫 抑 制 ， 感 为其他 病原 的继 发 感染 提 供 了便 利 ， 至会 造成 猪 甚 群 中疫病 的流 行 ， 养殖 生 产蒙 受损 失 ， 使 并有 可 能 引 发 公 共 卫 生 问 题［ 。Ｐ Ｖ 和 Ｐ Ｖ 是 造 成 猪 繁 殖／ ２ ］ Ｐ Ｒ
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用
探讨猪病诊断和防治中PCR技术的应用猪的生产健康一直备受关注，猪病的诊断和防治是保障猪群生产健康的重要环节。
近年来，PCR技术在猪病诊断和防治中的应用越来越广泛，得到了业界的高度关注。
本文将探讨PCR技术在猪病诊断和防治中的应用，以期为猪农和养猪企业提供一些有益的参考。
1. PCR技术原理PCR技术（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA复制技术。
它通过特定的引物（即PCR 扩增引物）和酶的作用，把DNA片段进行多轮放大，从而使少量的DNA样本被扩增到可以检测或分析的水平。
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点，广泛应用于分子生物学、生物医学、遗传学等领域。
2. PCR技术在猪病诊断中的优势(1) 高灵敏度：PCR技术对病原体的检测灵敏度非常高，可以检测到病原体的极低浓度，有利于早期诊断和防治。
(2) 高特异性：PCR技术可以通过设计特异性引物来识别目标病原体，避免了其他对猪群健康不构成威胁的微生物的干扰，确保诊断结果的准确性。
(3) 快速：PCR技术不需要培养病原体，可以在短时间内完成检测，有利于及时采取措施，减少疫情传播。
(4) 多重检测：PCR技术可以同时检测多种病原体，有助于全面了解猪群的健康状况。
目前，PCR技术已广泛应用于猪病的诊断，主要包括猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、口蹄疫病毒、猪链球菌、猪传染性胃肠炎病毒等。
以猪瘟为例，PCR技术可以在短时间内检测到猪瘟病毒的存在，快速、准确地进行猪瘟的诊断，有助于及时隔离和治疗，避免疫情的蔓延。
除了在猪病的诊断中的应用外，PCR技术还可以在猪病防治中发挥重要作用，主要体现在以下几个方面：(1) 疫苗研发：PCR技术可以对病原体进行基因组序列分析，为疫苗的研发提供基础数据，有助于研发更安全、更有效的疫苗。
(2) 病原体监测：PCR技术可以在疫苗接种后对病原体进行监测，了解疫苗接种的效果，有助于疫苗的改进和优化。
(3) 病原体溯源：当猪群出现疫情时，PCR技术可以对病原体进行溯源，了解疫情的起源和传播途径，有助于采取针对性的防控措施。
猪常见病PCR检测程序
猪病检测手册目录猪瘟RT-PCR检测程序 (3)猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 (5)高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 (7)猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序 (9)猪伪狂犬病毒（PRV）PCR检测程序 (11)猪细小病毒（PPV）PCR检测程序 (13)猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）PCR检测程序 (15)细菌学检测程序 (17)猪瘟RT-PCR检测程序一、病毒RNA的提取1、阳性对照RNA的提取材料冻干猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。
方法将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗用1.5ml蒸馏水或PBS液稀释，用1ml RNase-free管分装，每管500µl，-20℃保存。
取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于RNA的提取。
RNA提取按试剂盒说明进行，最后用50µl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。
2、疑似病料RNA的提取样品采集采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，用注射器取血5ml，4℃保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。
附：通常木乃伊胎不能作为检测样品。
对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。
对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应组织，保存送检。
胎儿的保存方法同上。
组织样品处理称取病变组织0.5g于研磨器中研磨，加入1.5ml PBS（PH7.2）继续研磨制成1:3的组织匀浆液，转至1.5ml灭菌离心管中，8000r/min离心2min，取上清液用于RNA 的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。
RNA提取待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行，最后用50µl RNAase-free水溶解RNA，得到RNA溶液。
二、R T-PCR反应1、材料RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。
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江西农业大学学报2012，34（4）：781－785http：//xuebao．jxau．edu．cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E－mail：ndxb7775@sina．com猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用张文波，蒋新华，冷闯，邓舜洲*（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）摘要：建立猪痘病毒（swinepox virus，SWPV）的PCR检测方法，为SWPV的流行病学调查和临床诊断提供可靠技术支撑。
参考GenBank登录的SWPV（AF410153．1）基因组序列，设计合成1对引物，扩增目的片段为975bp。
以SWPV江西分离株SWPV－JX01为模板，对反应条件进行优化，建立了SWPV的PCR诊断方法。
特异性、敏感性和重复性试验表明，该方法对临床上常见的其它猪病毒检测结果均为阴性；对模板的最低检测量为2．7pg；具有良好的重复性。
用此方法检测50份疑似猪痘的临床样品，其中阳性率为80．2%。
该方法敏感度高，重复性和特异性良好，可用于猪痘病毒的分子流行病学调查和临床病例的诊断。
关键词：猪痘病毒；PCR；猪痘中图分类号：S852．65+9．1文献标志码：A文章编号：1000－2286（2012）04－0781－05Development and Application of a PCR Assayfor Detection of Swinepox VirusZHANG Wen-bo，JIANG Xin-hua，LENG Chuang，DENG Shun-zhou （College of Animal Science and Technology，JAU，Nanchang330045，China）Abstract：A detection method for Swinepox Virus（SWPV）with PCR technique was established as a relia-ble technological means for epidemiological investigation and clinical diagnosis of SWPV．A pair of primers were designed according to the genome of SWPV to develop a PCR assay for detection of SWPV，the length of the product was975bp．The SWPV strain isolated from Jiangxi Province（SWPV－JX01）was taken as tem-plates．The PCR detection method for SWPV was finally established under optimal reaction conditions．The tests for the specificity，sensitivity and repeatability of the PCR assay were conducted，the results indicated that all were negative to the optimal examination method on other pig viruses and the necessary dose of tem-plates of the assay was2．7pg．50clinical samples，which were suspected SWPV syndrome from Jiangxi Prov-ince，were analysed by the method，the result showed that80．2﹪samples（41/50）were SWPV positive．The PCR detection method established in this study has the characteristics of sensitivity，high specificity and good repeatability，may be used in molecular epidemiological investigation and rapid clinical diagnosis of SWPV．Key words：swinepox virus；PCR；swinepox猪痘病毒（swinepox virus，SWPV）在分类上属于脊椎动物痘病毒亚科猪痘病毒属唯一成员。
是引起猪痘（swinepox，SWP）的主要病原，以引起猪的发热、外表皮肤起水泡、形成痘疹和结痂为特征，对3月收稿日期：2012－05－01修回日期：2012－06－04基金项目：国家自然科学基金项目（31160498/C1803）作者简介：张文波（1972—），男，讲师，博士，主要从事动物传染病与免疫学研究，E－mail：hnzwb22@163．com；*通讯作者：邓舜洲，副教授，博士，E－mail：shzhdeng@163．com。
江西农业大学学报第34卷龄以内的仔猪危害较大，成年猪很少发生或症状轻微，可通过猪虱等叮咬机械传播，并与饲养卫生条件差有关［1］。
具有严格的宿主特异性，猪是该病毒的唯一感染宿主，1842年由Spinola 首次在欧洲发现并报道；2011年，Maria Luiza G 等报道SWP 在巴西爆发［2］，目前SWP 呈世界性分布。
SWPV 的成熟病毒粒子呈砖形或椭圆形，有囊膜，是最大型病毒，在水平方向大小约为320nm ˑ240nm 。
病毒粒子由一个中央双侧凹陷的核，两个横向的椭圆体和至少两层质膜组成［3］。
SWPV 的基因组约为146kb 的双股DNA ，含有150个阅读框（ORF ），A +T 含量为72．5%，和其它种属的痘病毒一样，包含一个139023bp 的保守中心基因编码区，该基因区域含有病毒复制和感染的必需基因，包括毒力、宿主范围和组织嗜性的有关基因［4］。
基因组的末端有2个反向末端重复序列（Identlcal inverted termlnal repeat ，ITR ），功能可能与调节或逃逸宿主的免疫应答、调节或抑制宿主细胞凋亡、细胞和组织嗜性等有关［5］。
我国已有猪群中发生猪痘的少量报道，但仅限于临床诊断或动物感染试验，均未见通过分子生物学手段从病原学角度确诊［6－8］。
本试验旨在利用PCR 反应对SWPV 基因进行扩增，建立一种快速、准确检测SWPV 的PCR 方法，以期为江西省SWPV 感染的分子流行病学调查及快速诊断提供技术支撑。
1材料与方法1．1材料1．1．1引物设计与合成根据GenBank 中登录（登录号：AF410153．1）的SWPV 基因组序列，设计1对引物。
引物序列如下：SP1：5'－CCGGAATTCATGACGACGCCTCAAAAAGAAATCG －3'。
SP2：5'－CCCTCGAGTTATACAATATACGTGAATCCTATTCC －3'，扩增片段大小为975bp 。
1．1．2SWPV 江西分离株（SWPV －JX01）本实验室分离鉴定。
1．1．3待检病料疑似猪痘病猪皮肤痘痂，采自江西省部分规模化猪场。
1．1．4主要试剂Taq DNA 聚合酶等均购自天根生化科技（北京）有限公司。
1．2方法1．2．1SWPV DNA 的提取以分离的毒株SWPV －JX01株接种PK15单层细胞，盲传3代，收集第3代细胞培养液600μL ，反复冻融3 4次；加入5μL 蛋白酶K 56ħ，消化2h ；再加入等体积的Tris 平衡酚，轻轻反复颠倒混匀10min ，室温12000r /min 离心10min ；吸取上清转移到新的离心管中，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25ʒ24ʒ1）重复上述抽提步骤；转移上清到新的离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24ʒ1）重复上述抽提步骤；向最后获得的上清液中加入2倍体积的无水乙醇沉淀DNA ，室温12000r /min 离心10min ，再用500μL 70%乙醇洗涤1次；轻轻弃去无水乙醇，自然风干2min ，加入50μL 灭菌的去离子水溶解。
用紫外分光光度计测量核酸的浓度，重复测量3次取平均值，－20ħ保存备用。
1．2．2PCR 以提取的基因组DNA 为模板，进行PCR 。
反应体系为50μL ，其中含10ˑEasyTaq Buffer 5μL ，5U /μL 的DNA 聚合酶0．5μL ，2．5mmol /L dNTPs 4μL ，20μmol /L 的上、下游引物各0．5μL ，模板2μL ，ddH 2037．5μL 。
扩增条件为：95ħ预变性5min ，95ħ变性45s ，54ħ复性1min ，72ħ延伸1min ，共30个循环；最后72ħ延伸8mim 。
1．2．3特异性试验按文献［9－10］方法提取猪痘病毒（SWPV －JX01）、伪狂犬病毒（PRV ）、圆环病毒（PCV ）、流行性乙型脑炎病毒（JEV ）阳性病料和正常PK15细胞的DNA ，猪瘟病毒（SFV ）、猪流行性腹泻病毒（PEDV ）和猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV ）阳性病料的RNA 。
以SP1/SP2为引物进行PCR或RT －PCR 。
1．2．4敏感性实验取SWPV 细胞培养液600μL ，提取病毒DNA ，用紫外分光光度法定量后，将DNA做10倍比稀释，每个稀释度取2μL DNA 稀释液作为模板，按1．2．2体系及方法进行PCR 扩增，验证本方法的敏感性。
1．2．5重复性实验以建立的PCR 对猪痘病毒（SWPV －JX01）进行重复性试验，重复检测3次，以验证PCR 方法的重复性。
·287·第4期张文波等：猪痘病毒PCR检测方法的建立及应用1．2．6临床样品的检测从江西省各地区规模化猪场收集50份疑似猪痘病毒感染的病料（病猪背部和腹部外侧皮肤呈现数量不等、突出皮肤表面、直径0．5 2．0cm 的丘疹或结痂，采集其皮肤或结痂），加入灭菌生理盐水，匀浆器匀浆后12000r /min 离心10min 取上清，按1．2．1操作提取DNA 用作模板。
按1．2．2的方法进行PCR 检测。
2结果2．1PCR 检测方法的建立以纯化的猪痘病毒（SWPV －JX01）株DNA 为模板，SP1和SP2作为引物进行扩增，选择不同的退火温度做对比试验。
结果，在退火温度为54ħ时可扩增到1条大小约975bp 的条带（图1）。