碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)的分离与纯化一、实验目的1.掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理；2.悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理有机溶剂分级沉淀是分离蛋白质的常用方法之一。
有机溶剂能使许多溶于水的酌生物大分子发生沉淀，其主要作用是降低水溶液的介电常数。
例如20℃时水的介电常数为80，82％的乙醇溶液的介电常数为40。
溶液的介电常数降低意味着溶质分子间异性电荷库仑引力增加，从而使溶质的溶解度降低。
这一点可从静电学的库仑定律中得到阐明。
同时有机溶剂溶于水，对大分子物质表面的水化膜具有破坏作用，最后使这些大分子脱水而互相聚集析出。
沉淀不同物质所需有机溶剂的浓度不同，利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中发生沉淀作用而达到分离。
用于生物大分子分级分离的溶剂主要是能与水互溶的有机溶剂，常用的有乙醇、甲醇和丙酮等。
进行有机溶剂沉淀时，欲使原溶液中有机溶剂达到一定浓度，需加入有机溶剂的浓度和体积可按下式计算：V－需加10 0％有机溶剂剂的体积；V0－原溶液的体积；S1－原溶液中有机溶剂的浓度；S2－要求达到的有机溶剂浓度；100－指加入的有机溶剂浓度为100％。
如所加入的有机溶剂的浓度为9 5％，上式(100一S2)项应改为(95一 S2)。
在大规模制备沉淀时，若溶剂浓度的要求不太严格时，可用简单的交叉方法求出。
本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
用有机溶剂分离纯化酶(或蛋白质)必须注意以下几点：(1)有机溶剂沉淀是个放热过程，所以要在低温下进行。
碱性磷酸酶的研究进展
碱性磷酸酶的研究进展【标题】碱性磷酸酶的研究进展【作者】柯清练【关键词】碱性磷酸酶?分离纯化?分子结构?生理功能【指导老师】陈春【专业】生物科学【正文】1?前言?碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)是一种专一性较广的磷酸酯水解酶，可以催化所有的磷酸酶的水解反应和磷酸集团的转移反应，在生物体内具有非常重要的生理功能，它直接参与磷代谢，并与DNA，RNA蛋白质脂质等代谢有关。
能催化磷酸单脂的水解和磷酸基团的转移反应，在生物体内具有重要的生理功能，且它是一种非特异性磷酸水解酶，能催化磷酸单脂的水解及磷酸基团的转移反应，对动物的生存具有重要的意义。
[1]它是一种在碱性条件下具有较高活性的酶，在机体各组织和血清中有着广泛的分布。
因为锌原子可作为AKP的辅基，所以可以通过测定血清AKP的活性来判断机体对锌元素的吸收利用情况，AKP的活性提高意味着机体对锌的利用率较高，反之亦然。
由于AKP的作用十分广泛，各行业对它的研究一直都没有停止过，虽然AKP对各方面的功能作用很多，但它主要的研究方向是在对人体和生物的生理所起作用的研究，所以历年来学者对它的这两方面功能作用都做过研究，以这两种功能作用来更进一步来研究其作用。
目前我国研究碱性磷酸酶主要在对水体环境、人体功能、动物功能的影响方面有主要涉及：①河流的影响方面；我国首先进行水体及沉积物碱性磷酸酶活性研究的是厦门大学洪华生教授等②人体的影响研究方面；碱性磷酸酶主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎的检查及孕妇、骨折愈合期、骨软化症、佝偻病、骨细胞癌、骨质疏松、肝脓肿、肝结核、肝硬变、白血病、甲状腺机能亢进时等疾病方面③动物方面：碱性磷酸酶市动物机体生长代谢、保持内环境稳定、维持机体健康所必需的酶，它们也同样受营养状况、环境变化及疾病和生长阶段的影响，动物赖以生长、生存的重要酶类之一。
由此对碱性磷酸酶的研究显得尤为重要，研究碱性磷酸酶的理化性质，探讨其活性部位，研究其对动物各种生活的关系影响；研究其对人体系统功能的各种影响，对研究碱性磷酸酶的结构与功能及酶的催化机理具有重要意义。
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究
碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静 201131301031摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。
关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。
此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。
它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。
药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。
它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。
临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。
因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。
本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。
此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。
碱性磷酸酶的分离纯化鉴定
2、 定量分析的理论基础 －－Lambert—Beer定律
A ＝ K·L·C
吸光度 (Aabsorbance,A ) 消光度 (degree of extinction,E ) 光密度 (optical density,D )
参比溶液的选择
• 溶剂空白： 当显色剂及所用其它试剂在测定波长 都没有吸收峰时，可用纯溶剂(如蒸馏水)作参比 溶液。
• 试剂空白： 当显色前的样品在测定波长没有吸收 峰，而显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时， 可用不加入样品的“试剂空白”作参比溶液，这 种方式最为常用。
基本组件及常见分光光度计
样品的蛋白含量
纯化倍数 =
每一步比活性 初提液比活性
得率 =
每一步总活性 初提液总活性
每一步总活性 = 酶活性 × 每一部记录的体积数
分光光度法 （Spectrophotometry）
根据物质对不同波长的光线具有选择性吸收 （即可产生吸收光谱）的特性而建立起来的一种 定量、定性分析的技术。也称为吸收光谱法 （Absorption spectrometry）。
不需要把欲分析的样品从混合物中分离开来
（一）基本原理
1、光的基本知识 光具有波粒二相性。 波长和频率是光的波动性的特征。
K-- 吸光系数,是物质的特征性常数。
• 对比法进行定量分析
A样 = K ·L ·C样 A标 = K ·L ·C标
A样
K ·L ·C样
C样
A标
K ·L ·C标
C标
C样 = A样·C标 / A标
Lambert—Beer定律的适用范围：
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告
碱性磷酸酶的分离纯化实验报告实验报告：碱性磷酸酶的分离纯化引言：碱性磷酸酶是一种常见的酶类，在生物化学和生物工程领域有着重要的应用价值。
分离纯化碱性磷酸酶可以有效地提高其催化活性，从而更好地满足利用需求。
本实验旨在通过分离纯化的方法获得高纯度的碱性磷酸酶。
材料与方法：材料：1. 含有碱性磷酸酶的混合酶液；2. DEAE-纤维素离子交换柱；3. 带有荧光物质的酶学百科试剂盒；4. 透析膜。
方法：1. 将50 mL含有碱性磷酸酶的混合酶液，通过DEAE-纤维素离子交换柱进行分离纯化；2. 用PBS缓冲液洗涤纤维素柱，收集洗脱液以及洗脱后的洗脱液，测定酶活力；3. 分别将洗脱后的洗脱液和洗脱液透析入PBS缓冲液中；4. 用带有荧光物质的酶学百科试剂盒测定样品的酶活力。
结果：样品中碱性磷酸酶的活性经过分离纯化后得到了提高，相对活性提高了3倍以上。
同时，样品纯度也有了显著的提高。
分析和讨论：本实验通过离子交换柱和透析膜的方法，成功地分离和纯化了碱性磷酸酶。
实验中使用的DEAE-纤维素离子交换柱是一种较为成熟且常见的方法，具有操作简单、精度高等特点。
透析膜则可以更为彻底地去除不需要的杂质，进一步提高受体的纯度。
在实验结果中，我们发现酶的相对活性得以提高，这说明经过纯化后酶的质量得到了提高，可以进行更好地应用。
但同时，这样的分离纯化也存在一定的局限性，如纯度并没有达到100%，仍存在需进一步提高的空间。
结论：本实验成功地纯化和分离了碱性磷酸酶，提高了其相对活性，获得了具有实际应用需求的高纯度酶样品。
同时，在实际应用过程中，需要根据需求进行更为严格的纯化和分离，以满足更加精细化的需求。
(动物来源)碱性磷酸酶的提取及性质研究
最适pH及酸碱稳定性实验
最适pH及酸碱稳定性实验
最适温度及热稳定性实验
最适温度及热稳定性实验
抑制剂类型鉴别
实验仪器
谢谢！
分离纯化试剂
（1）0.5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸 馏水中，定容至1000ml （2）0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠溶液:准确 吸取20ml0.5mol/L醋酸镁溶100ml0.14mol/L醋酸 钠溶液，混合后定容至1000ml （3）正丁醇、丙酮、乙醇 （4）Tris-HCl ph8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲 烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为 0.1mol/LTris溶液.取100ml 10.1mol/LTris溶液， 加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L醋酸镁溶液 100ml，混匀后用1%冰醋酸调ph为8.8，用蒸馏 水定容至1000ml；
Km值测定试剂
（1）0.04mol/L底物液（磷酸苯二钠）：称取10.16g磷酸苯 二钠（C6H5PO4Na2· 2H2O），用煮沸后冷却的蒸溜水 溶解，并稀释至1，000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶 内，置冰箱内保存，可用一周。 （2）0.1mol/l碳酸盐缓冲液（ph10.0）：称取无水碳酸钠 6.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，并稀释至 1000ml； （3）0.5mol/LNaOH （4）0.3%4-氨基安替比林:称取3g4-氨替比林及碳酸氢钠 42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，贮于棕色瓶中， 放冰箱内保存 （5）0.5%铁氰化钾：称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于 800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml。置棕色 瓶中，放冰箱内保存；
（动物来源）碱性磷酸酶 的提取及性质研究
碱性磷酸酶的分离纯化
碱性磷酸酶的分离纯化碱性磷酸酶的分离纯化、⽐活性测定与定⼒学分析⼀、实验原理(⼀)碱性磷酸酶的分离纯化、⽐活性测定1.机械破碎法制备肝匀浆低浓度⼄酸钠：低渗破膜低浓度⼄酸镁：保护和稳定AKP2.有机溶剂沉淀法分离纯化AKP加⼊不同有机溶剂重复离⼼正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋⽩质33%丙酮、30%⼄醇：溶解AKP50%丙酮、60%⼄醇：沉淀AKP3.⽐活性的定义＊单位重量的蛋⽩质样品中所含的酶活性单位。
＊通常⽤每毫克蛋⽩质具有的酶活性单位来表⽰。
＊⽤以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之⼀。
4.测定样品的⽐活性必须测定：＊每毫升样品中的酶活性单位数。
＊每毫升样品中的蛋⽩质毫克数。
5.磷酸苯⼆钠法测定碱性磷酸酶活性测定AKP 4-氨基安替⽐林＊磷酸苯⼆钠→→酚→→→→醌衍⽣物（红⾊）铁氰化钾↓根据红⾊的深浅⽤⽐⾊法测定酚的含量。
＊37℃保温15分钟产⽣1mg酚者为1个酶活性单位。
(⼆)底物浓度对AKP活性的影响K m 即为⽶⽒常数，V max为最⼤反应速度＊上式表⽰,⽶⽒常数是反应速度为最⼤值的⼀半时的底物浓度。
因此,⽶⽒常数的单位为mol/L。
当反应速度等于最⼤速度⼀半时,即V= 1/2 V max, K m = [S] ＊吸光度表⽰不同底物浓度时的酶反应速度。
以吸光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km 值。
双倒数作图法（三）PH对AKP活性的影响酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在⼀定pH范围内才具有活性，酶活性最⾼时的pH，称为酶的最适pH，⾼于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。
不同酶的最适pH不同。
酶的最适pH不是⼀个特征性的物理常数，对于⼀个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同⽽有差异。
（四）温度对AKP活性的影响酶的催化作⽤受温度的影响很⼤，⼀⽅⾯与⼀般化学反应⼀样，提⾼温度可以增加酶促反应的速度。
通常温度每升⾼10℃，反应速度加快⼀倍左右，最后反应速度达到最⼤值。
酶工程实验碱性磷酸酶实验报告
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
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碱性磷酸酶的分离纯化与酶学性质研究董静 201131301031摘要：以猪肝为原料，采用低浓度醋酸钠(低渗破膜作用)制备肝匀浆，醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用，匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
酶学性质研究表明该酶催化对磷酸苯二钠水解反应的最适PH值为10.0，最适温度为37℃,米氏常数值Km为3.154mmol/L，酶的热稳定性研究表明该酶在pH在8-9区间和温度在25℃-37℃区间下稳定。
关键字：碱性磷酸酶分离纯化热稳定性酸碱稳定性碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，EC3．1．3．1，简称AKP)广泛存在于微生物界和动物界，它在动物机体的骨化过程中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用。
此外，通过催化磷蛋白的水解，碱性磷酸酶在细胞调节过程中也具有一定的作用。
它可专一性的水解磷酸单酯化合物而释放无机磷，主要用于核酸研究，分析、测定核苷酸顺序及其基团的重组、分离，也是酶标免疫测定技术的常用工具酶之一。
药用化妆品中添加碱性磷酸酶有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，还可用于核苷酸脱磷产生核苷等。
它是一种膜结合蛋白，在生物体内直接参与磷酸基团的转移和代谢等生理过程[1]。
临床上通过测定AKP的活力，可作为诊断骨骼及肝脏疾病的重要生化指标。
因此纯化和研究AKP的性质、调控等有重要意义。
本实验尝试以猪肝为材料，分离纯化猪肝碱性磷酸酶，研究其酶学性质，旨在探讨以猪肝研制科研用碱性磷酸酶生化试剂的方法，同时也为进一步的深入研究该酶提供理论上的参考。
此外，猪肝来源广泛，价格便宜，可以作为生产碱性磷酸酶生化试剂的原料[2-3]。
研究酶的生物学特性，其之一是它对酸碱度的敏感性， pH对酶活性的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的范围内才表现出活性，同一种酶在不同的pH条件下所表现的活性不同，其表现活性最高时的pH值称为酶的最适pH。
pH 不仅对酶活性有很大影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响，而且对酶的稳定性也有很大的影响。
因为该酶的化学本质是蛋白质，同蛋白质容易变性一样，酶在过酸或过碱的条件下也很容易变性失活。
各种酶的酸碱度稳定范围是不同的，这就需要制作酸碱稳定性曲线[4]。
对温度的敏感性是酶的又一个重要特性。
酶反应速度达到最大值时的温度称为酶的最适温度。
如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度条件下测定酶活力，以温度为横坐标，反应速度为纵坐标，可得到一条温度——酶活性曲线。
酶的种类和来源不同，对热的稳定性也不同，这就需要通过热稳定性试验测出热稳定范围。
一般的试验方法是在一定条件下先将酶在不同的温度下处理一段时间，迅速降温，然后再在一定温度条件下测定酶活力。
以处理温度为横坐标，酶反应速度为纵坐标作图，可得到酶的热稳定性曲线，根据这条曲线即可求出酶的热稳定性范围[5]。
抑制剂是引起酶促反应速度降低的一类物质的统称。
它与酶的活性部位结合，改变了酶活性部位的结构或性质，从而引起酶活力下降，这里不包括酶蛋白的水解或变性等情况。
在可逆抑制类型中，根据抑制剂、底物和酶三者的相互关系，又可分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。
在竞争性抑制中，酶不能同时和底物、抑制剂结合，即不能形成EIS，其动力学特征是：米氏常数的表观值Km增加，酶的最大反应速度Vm不变。
在非竞争性抑制中，抑制剂、底物都能同时和酶结合形成EIS，但是EIS不能进一步转变为产物，其动力学特征是：Vm降低而Km不变。
在反竞争性抑制中，抑制剂必须在酶和底物结合以后才能和酶结合形成EIS，即Ki=∞，其动力学特征是：Km和Vm都发生了变化[6]。
1 材料与方法1.1材料1.1.1原料菜市场购买的新鲜猪肝，由本实验室保存。
1.1.2 主要仪器移液管；量筒；玻璃勺浆器(管)；剪刀；离心机（湘仪Cence H2050R）为湖南湘仪实验室仪器开发有限公产品；新华定性滤纸；HH数显恒温水浴锅为金坛市金城国胜实验仪器产品；721型分光光度计（UNIC7200 SPECTROPHOTOMETER ）为国产分光光度计。
1.1.3 试剂①0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml;②0.1mol/L 酸钠溶液:8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml;③0.01mol/L 醋酸镁-0.0lmol/L 醋酸钠溶液:准确吸取20ml0.5mol/L 醋酸镁溶100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混合后定容至1000ml ；④tris-hcl ph8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g ，用蒸馏水溶解后定容至1000ml ，即为0.1mol/LTris 溶液.取100ml10.1mol/LTris 溶液，加蒸馏水约780mL ，再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100ml ，混匀后用1%冰醋酸调ph 为8.8，用蒸馏水定容至1000ml ；⑤正丁醇、丙酮、95%乙醇；⑥0.04mol/l 作用物液：称取10.16g 磷酸苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解，并稀释至1000ml ，加4ml 氯仿防腐，贮于棕色瓶子内，置冰箱内保存；⑦0.1mol/l 碳酸盐缓冲液（ph10.0）：称取无水碳酸钠6.36g 及碳酸氢钠3.36g 溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml ；⑧碱性磷酸酶液：取纯化的碱性磷酸酶5mg ，用ph10缓冲液配制成100ml ，放置冰箱内保存;⑨0.5mol/lNaOH 溶液;100.3%4-氨基安替比林:称取3g4-氨替比林及碳酸氢钠42g ，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml ，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存；○11 0.5%铁氰化钾：称取10g 铁氰化钾及30g 硼酸各溶于800ml 蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml 。
置棕色瓶中，放冰箱内保存；○12基质液：称取磷酸苯二钠·2H 2O6g,4-氨基安替比林3g ，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中，两液混合并稀释至1000ml ，加4ml 氯仿防腐，于棕色瓶内，用时与等量的水混合即可;○13各ph 值相应缓冲液，○140.5mol/LKH 2PO 4：称取KH 2PO 46.80g ，加水溶解并定容至100ml ；○150.04M 磷酸氢二钠：称取磷酸氢二钠14.3g ，溶解于0.1MpH10的碳酸缓冲液中，并用此液稀释至1000ml 。
1.2 方法 1.2.1 提取方法分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在0-4℃进行）加10ml正丁醇，搅拌3-5分钟后，四层纱布过滤后，离心30min，2500r/min加23.5ml冷丙酮（-10℃）混匀，冰冻离心2500转5分钟加0.5moL/l醋酸镁20ml，量体积为29ml加96%乙醇12,95ml离心3000转5分钟加96%乙醇27.9ml，离心2500转5分钟0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠20ml溶解，加96%乙醇9.75ml，离心2500转5分钟加96%乙醇24.5ml，离心2500转5分钟取新鲜猪肝10g剪碎（0-4℃）肝匀浆体积32.5ml滤液23,5ml上清液（弃去）沉淀悬液沉淀（弃去）上清液33.5ml上清液（弃去）沉淀上清液29.5ml加0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠60ml，在电动匀浆上匀浆。
加0.5mol/L 磷酸镁15ml 溶解，总体积17.5ml ，加99.5%丙酮16.4ml ，离心2500转5分钟加丙酮7.65ml 至50%，离心4000转10分钟上清液（弃去） 沉淀沉淀（弃去）上清液上清液（弃去）沉淀：加pH8.8Tris 缓冲液10ml ，分装保存，1ml1管，在-20℃下保存10管。
1.2.2 Km 值测定方法①取大试管7支，按表1分别加入相应试剂，加入酶液，混匀之后立即计时，各管在37℃水浴中准确保温15分钟后，立即加入0.5molNaOH 液1.0ml 以终止反应；②各管中加入0.3%4-氨基安替比林1.0ml 和0.5%铁氰化钾2.0ml ，充分混匀，放置10分钟，以0管为对照，在波长510nm 下比色，记录各管的吸光度；③作图：所测各管的吸光度代表各管中反应速度v ，以之为纵轴，以作用物浓度[S]为横轴，在坐标纸上连接各点作图，以观察曲线的形状。
以各管吸光度值的倒数为纵坐标轴，以作用物浓度的倒数为横坐标，作图并求出此酶的Km 值。
表1 Km 值测定曲线制作试剂 管号 （ml ）1234 5 6 70.04mol/L 作用物液0.15 0.20 0.25 0.300.400.600.80 0pH10磷酸缓冲液 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 0.90 蒸馏水 0.85 0.80 0.75 0.700.600.40 0.20 0 混匀 37℃ 预热 5分钟1.2.3 最适pH及酸碱稳定性实验①pH—活性曲线的制作取6支试管，按表2操作，以反应pH值为横坐标，A510为纵坐标绘制pH 活性曲线，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适pH值。
表2 pH—活性曲线制作管号 1 2 3 4 5 0反应pH 8 9 10 11 12 10相应pH缓冲液各加0.5ml酶液各加0.1ml（0号管酶液在铁氰化钾之后加）/37℃预热5分钟预热的基质液各加3.0ml37℃精确保温15min后各加1,0ml碱性溶液终止反应0.5%铁氰化钾各加2.0mlA510②酸碱稳定范围的测定为纵坐标，绘制酸碱稳定曲取6支试管，按表3操作，以pH为横坐标，A510线，并分析碱性磷酸酶的酸碱稳定范围。
表3 酸碱稳定范围曲线的制作管号 1 2 3 4 5 0处理pH 8 9 10 11 12 10 相应pH缓冲液各加0.1ml酶液各加0.1ml37℃保温处理1h0.1MPH10碳酸盐缓冲液各加0.5ml预热的基质液各加3.0ml（0号管基质液在铁氰化钾之后加）0.5%铁氰化钾各加0.2mlA5101.2.4 最适温度及热稳定性实验①温度—活性曲线的制作为纵坐标，绘制温度取4支试管，按表4操作，以反应温度为横坐标，A510—活性曲线图，求出碱性磷酸酶在本实验条件下的最适温度。
表4 温度—活性曲线制作管号 1 2 3 0反应温度（℃）25 37 80 37稀释酶液各加0.1ml（0号管在铁氰化钾之后加）预热复合基质液各加3.0ml分别在不同温度下精确反应15min，各加1.0ml碱性溶液终止反应各加0.5%铁氰化钾2.0ml，静置10minA510②热稳定性测定取4支试管，按表5操作，在上述相应温度的恒温水浴锅内放置相应时间后取出，立即以流动水冷却并置于37℃恒温水浴锅中预热2分钟，以处理温度为为纵坐标，绘制处理时间为15min的热稳定曲线，并分析在本实验横坐标，A510条件下碱性磷酸酶的热稳定范围。