仪器分析毛细管电泳法
人卫第七版分析化学第二十章毛细管电泳法
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
常用的阴离子表面活性剂有十二烷基硫酸钠（SDS）、 N-月桂酰-N-甲基牛磺酸钠（LMT）、牛磺脱氧胆酸 钠（STDC）等。 阳离子表面活性剂最常用的是季铵盐，如十二烷基三 甲基溴化铵（DTAB）、十六烷基三甲基溴化铵 （CTAB）等。 非离子型表面活性剂有3-[3-(氯化酰胺基丙基)二甲基 胺基]-1-丙基磺酸酯（CHAPS）等。
3.吸附
产生原因：
（1）阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用 （2）疏水作用。 对于生物大分子，如碱性蛋白和多肽等，吸附严重时可能导致测不
到信号。因此，生物大分子分析时常需用涂层处理的毛细管柱。
4.进样
5.电泳
（过载）
样品区带与周围电解质溶液间的电导率差，从而导致峰形展宽。
第二十章 五、分离度
另外，还有手性表面活性剂，如胆酸、毛地黄皂苷、 十二烷基-N-L-缬氨酸钠等。
Hale Waihona Puke 第二十章毛细管电泳法
仪器分析
表面活性剂选择时应考虑以下因素：
（1）经济易得 （2）水溶性好 （3）紫外吸收背景越低越好 （4）不与样品发生破坏性作用
（5）所形成的胶束足够稳定
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
碳链较短的阴离子表面活性剂为优先选择对象。SDS易得、紫外
吸收低，最为常用。如经浓度、缓冲溶液及pH优化，分离仍不佳，
再换具有不同碳链长度或结构的其它阴离子表面活性剂。若结果 仍不好，应考虑使用阳离子或中性、两性表面活性剂，如CTAB
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
第三节
毛细管电泳的主要分离模式
毛细管电泳仪核酸分离分析
毛细管电泳仪核酸分离分析毛细管电泳仪核酸分离分析是一种广泛应用于生物技术和生物医学研究领域的分析方法。
它通过将DNA、RNA或其他核酸样品注入到毛细管中，利用电场的作用使核酸在毛细管内迁移，在电泳分离过程中根据核酸分子的大小、电荷和构象差异，实现对核酸样品的分离和定量分析。
本文将从毛细管电泳仪的原理、实验操作和应用领域三个方面展开介绍。
一、毛细管电泳仪的原理毛细管电泳仪是以电泳为基础的仪器设备，主要由高压电源、注射器、分离柱、检测器和数据处理系统等组成。
核酸样品首先通过注射器被导入到毛细管内，然后通过电场力将核酸分子在毛细管内迁移。
毛细管内的分离柱起到了筛选和分离核酸的作用，不同长度或不同带电性质的核酸分子将被分离开来。
分离完成后，检测器会检测样品，根据检测信号进行数据处理和分析。
二、毛细管电泳仪的实验操作1. 样品制备：将待测核酸样品提取并纯化，测定浓度和纯度。
2. 缓冲液的配制：根据实验需要选择合适的缓冲液，调节缓冲液的pH值和离子强度，以优化分离效果。
3. 毛细管的选择：根据样品特性和分离目标，选择合适的毛细管材料、内径和长度。
4. 样品注入：使用专用注射器将核酸样品注入到毛细管中。
5. 分离条件设置：根据样品的性质和实验需要，设置适当的分离电压、电流和温度等条件。
6. 分析与结果解读：根据检测器所得到的信号，进行数据处理和结果解读。
三、毛细管电泳仪的应用领域毛细管电泳仪核酸分离分析广泛应用于生命科学研究、医药领域以及法医学等领域。
具体应用包括但不限于以下几个方面：1. 生物医学研究：在基因工程、遗传学、分子生物学等领域中，毛细管电泳仪被广泛应用于核酸样品的分离、纯化和测序等方面。
2. 临床诊断：毛细管电泳仪可用于检测和分析人体内的基因突变、染色体异常等，对临床疾病的诊断、预测和治疗具有重要意义。
3. 食品安全监测：毛细管电泳仪可以对食品中的转基因成分、有害物质和添加剂等进行快速准确的分析，为食品安全监测提供科学依据。
毛细管电泳法
此外，还有一类基于芯片的二维分离系统主要应用于蛋白质酶解物的分离分析。
除上述分离模式外，芯片自由流电泳也是芯片电泳分离蛋白质的重要方法。芯片自由流电泳是指在芯片中通 过外加电场使样品随缓冲液连续流动的同时沿电场方向进行电迁移，从而按照电泳淌度不同实现分离的电泳分离 模式。Raymond等采用芯片自由流电泳模式分离了人血清蛋白、缓激肽和核糖核酸酶A，其分离长度为3.1 cm，流 出时间为62 S。Kobayashi等采用自由流电泳的分离模式在一个体积为56.5 mm×35 mm×30 mm的微分离室 (60uL)中实现了持续的蛋白质分离，并用羟丙基甲基纤维素涂覆来抑制蛋白质吸附，在25 min内有效分离了细胞 色素C和肌红蛋白。最近，Kohl．heyer等H 3。制作了一种自由流等电聚焦分离蛋白质的玻璃芯片，成功地将人 血清白蛋白(pI=4.4)与等电聚焦标记物(pH 3和9)分离。
仪器要求
所用的仪器为毛细管电泳仪。正文中凡采用毛细管电泳法测定的品种，其所规定的测定参数，除分析模式、 检测方法(如紫外光吸收或荧光检测器的波长、电化学检测器的外加电位等)应按照该品种项下的规定外，其他参 数如毛细管内径、长度、缓冲液的pH值、浓度、改性剂添加量、运行电压或电流的大小、运行的时间长短、毛细 管的温度等，均可参考该品种项下规定的数据，根据所用仪器的条件和预试验的结果，进行必要的调整。
检测方法
毛细管电泳通常用到的检测方法有吸收光谱，荧光光谱，热镜，拉曼光谱，质谱和电化学方法。
毛细管电泳法的使用方法
毛细管电泳法的使用方法毛细管电泳法是一种分离和分析化学物质的常用方法，它基于物质在电场中的运动速度差异而实现分离。
适用于各种复杂样品的分析，包括生物样品、环境样品和食品样品等。
本文将介绍毛细管电泳法的使用方法。
一、实验准备1. 仪器准备：毛细管电泳仪和电泳装置是进行毛细管电泳分析的关键设备。
确保仪器完好无损，并根据仪器的使用说明进行正确操作和维护。
2. 毛细管准备：选择适当的毛细管，一般为无机硅玻璃或石英毛细管。
根据分析需求，选择不同内径和长度的毛细管。
3. 缓冲溶液准备：根据分析的目标物质的性质，选择合适的缓冲溶液。
常用的缓冲溶液包括磷酸盐缓冲液、乙酸缓冲液等。
根据需要，可以添加其他辅助剂来改善分离效果。
二、样品制备1. 样品处理：根据分析目标，选择合适的处理方法。
常见的样品处理方法包括离心、过滤、稀释、萃取等。
2. 样品溶解：将处理后的样品溶解于适当的溶剂中，并进行必要的稀释。
保证样品的浓度范围适合毛细管电泳的检测方法。
3. 样品准备：将样品注入样品瓶中，并保持封闭状态，以防止污染和样品损失。
三、实验操作1. 建立分析方法：根据样品性质和目标物质的不同，确定最适合的毛细管电泳分析方法。
包括电泳条件的选择、运行缓冲溶液的优化以及检测参数的设置等。
2. 毛细管填充：在进行毛细管电泳之前，需要将毛细管填充成电泳缓冲液中的一种或多种成分。
常用的填充方法包括静态填充法、动态填充法和电泳填充法。
3. 毛细管电泳条件的设定：根据样品的性质和分析目标的要求，设定合适的毛细管电泳条件，包括电压、电流、温度、电泳缓冲液的浓度和pH值等。
4. 样品注入和分析：将样品通过母液喷射装置或静态注射装置注入到填充好的毛细管中，然后开启电源，进行电泳分析。
5. 检测和数据分析：通过检测器对分离后的化合物进行检测，并记录峰的峰高和峰面积等参数。
利用这些数据进行数据分析和结果解释。
四、实验注意事项1. 仪器操作：严格按照仪器的使用说明进行操作，保证实验安全和设备的长期稳定性。
毛细管电泳仪的使用(原创)电泳仪的使用方法
毛细管电泳仪的使用(原创)电泳仪的使用方法毛细管电泳仪的使用 (原创)引言毛细管电泳是一种常见的分离和检测生物分子的方法。
毛细管电泳仪是用于进行毛细管电泳实验的仪器，它可以实现对生物样品的快速、高效分离和检测。
本文将介绍毛细管电泳仪的使用方法，包括仪器的准备和操作步骤。
仪器准备在开始使用毛细管电泳仪之前，需要对仪器进行一些准备工作。
1. 仪器清洁：确保仪器和使用的毛细管是干净的。
使用一定量的去离子水和实验室级酒精清洗仪器表面和通道。
使用纯净棉布擦拭毛细管，确保其表面干净。
2. 试剂准备：根据实验要求，准备所需的毛细管电泳缓冲液和样品。
确保试剂的质量好，并按照实验方法准确配制。
3. 电解质填充：根据实验设计和毛细管的使用要求，选择合适的电解质填充毛细管。
将电解质溶液注入毛细管两端，确保毛细管内充满电解质溶液。
操作步骤接下来，将详细介绍毛细管电泳仪的使用步骤。
1. 样品制备：根据实验要求，准备样品溶液。
将样品溶解在适当的溶剂中，并进行必要的稀释。
确保样品溶液的浓度适中，以免影响电泳结果。
2. 毛细管安装：，将毛细管插入仪器的毛细管插槽中。
确保毛细管插入的位置正确并且稳定。
然后，将毛细管的两端连接到电泳仪上的电极。
3. 仪器设置：根据实验要求，设置仪器的运行参数，如电压、电流和电泳时间等。
确保设置的参数符合实验要求，并检查仪器的参数显示是否正常。
4. 准备电泳缓冲液：根据实验要求，将正确配制的电泳缓冲液注入仪器的缓冲液槽中。
确保电泳缓冲液的pH值、离子浓度等参数符合实验要求。
5. 样品加载：使用微量注射器或自动进样器，将样品溶液缓慢注入毛细管的一端。
确保样品进入毛细管的位置正确，并注意避免空气泡的进入。
6. 开始电泳：确认样品已经加载完毕后，关闭注射器或自动进样器，将电泳仪的电源打开。
根据设置的参数，开始进行电泳实验。
7. 实验结束：当电泳时间到达设定的时间后，关闭电路，停止电泳实验。
注意关注电泳过程中的实时显示结果，并及时记录实验数据。
毛细管电泳法
毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。
通过施加10-40kV 的高电压于充有缓冲液的极细毛细管，对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。
现在，HPCE 已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA 等生物分子分离分析，药物分析，临床分析，无机离子分析，有机分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。
人类基因组工程中DNA 的分离是用毛细管电泳仪进行的。
毛细管电泳较高效液相色谱有较多的优点。
其中之一是仪器结构 简单（见图1）。
它包括一个高电压源，一根毛细管，紫外检测器及计算机处理数据装置。
另有两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液池。
high-v oltagepower supply BufferV ialBuffer V ial Detector Recording dev icecapillaryElectrode Electrode图1 CE 仪器组成示意图毛细管中的带电粒子在电场的作用下，一方面发生定向移动的电泳迁移，另一方面，由于电泳过程伴随电渗现象，粒子的运动速度还明显受到溶液电渗流速度的影响。
粒子的实际流速 V 是电泳流速度 Vep 和渗流速度 Veo 的矢量和。
即:V = Vep + Veo (1)电渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。
溶液的这一运动是由硅/水表面的Zeta 势引起的。
CE 通常采用的石英毛细管柱表面一般情况下(pH>3)带负电。
当它和溶液接触时，双电层中产生了过剩的阳离子。
高电压下这些水合阳离子向阴极迁移形成一个扁平的塞子流，如图2。
毛细管管壁的带电状态可以进行修饰，管壁吸附阴离子表面活性剂增加电渗流， 管壁吸附阳离子表面活性剂减少电渗流甚至改变电渗流的方向。
毛细管电泳仪操作流程
毛细管电泳仪操作流程毛细管电泳（Capillary Electrophoresis，CE）作为一种高效而准确的分离和分析技术，已经广泛应用于生命科学、环境监测、化学分析等领域。
本文将为您介绍毛细管电泳仪的操作流程。
一、仪器准备1. 确保毛细管电泳仪处于正常工作状态，检查仪器的所有外部连接是否牢固。
2. 根据待测样品的特性选择合适的电泳缓冲液，并准备好所需的电泳缓冲液。
二、打开电泳仪1. 打开电泳仪的电源开关，等待一段时间以确保仪器达到稳定工作温度。
2. 启动电泳仪上的控制软件，并连接电泳仪与电脑。
三、样品处理1. 准备待测样品，并标记好每个样品的相关信息，如样品编号、浓度等。
2. 根据样品特性选择适当的预处理方法，比如蛋白质样品可能需要进行还原、热变性等处理。
四、样品注射1. 取一根胶管，并将其一端插入装有待测样品的样品瓶中，另一端插入电泳仪的样品槽中。
2. 打开电泳仪软件上的样品注射选项，并设置注射时间和注射电压。
3. 确保胶管中没有气泡，控制好注射速度，使样品缓慢注入到毛细管中。
五、电泳1. 设置所需的电泳参数，包括电压、电流、电泳温度等。
2. 在电泳仪软件上选择相应的电泳方法，并输入相关参数。
3. 点击开始电泳按钮，启动电泳过程。
六、数据收集与分析1. 在电泳过程中，观察样品的迁移情况，确保样品在毛细管中顺利迁移。
2. 根据实验需求，在电泳仪软件上选择合适的检测器，并设置相关参数。
3. 点击数据采集按钮，开始采集电泳数据。
4. 采集完毕后，保存数据并进行相应的数据分析和解读。
七、仪器关闭与清洗1. 结束实验后，关闭电泳仪软件和电源开关。
2. 移除使用过的毛细管，并将其丢弃或进行清洗。
3. 使用适当的清洗液清洗电泳槽和其他相关部件，确保仪器干净整洁。
4. 关闭电泳仪的电源，并进行日常维护和保养。
总结：以上便是毛细管电泳仪的操作流程。
在操作过程中，注意仪器的准备、样品处理、样品注射、电泳、数据采集与分析等步骤，确保实验顺利进行。
(仪器分析)9.3高效毛细管电泳的理论基础
2020/7/9
HPCE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 石英毛细管：内表面带负电荷，电渗流流向阴极。 改变电渗流方向的方法：
（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团。
（2）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛
e eV
e
e
E
Q f
Q为离子所带的静电荷,f 为stokes阻力系数
2020/7/9
对于球形离子： f = 6πηr
e
QV QV
f L 6πRsL
e
e
E
Q
6πR
Rs —离子的表观液态动力学半径；η —介质的粘度；
从上式可见，当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速 度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲液黏度及带电离 子的大小有关。电渗流是驱动离子运动的第二种作用力。
所以，带电离子在溶液中的迁移速度：
e
eE
eV
L
μe ：电泳迁移率（电泳淌度,单位：cm2·V-1 ·s -1 ），E：电场强 度，V：电压；L：毛细管长度（有效长度为 l ）。
物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。
淌度μ ：单位电场强度下的平均电泳速度。 被分离组分的保留时间 t 为：
t l lL
（b）加入表面活性剂，可改变电 渗流的大小和方向。
加入不同阳离子表面活性剂来控 制电渗流。
加入阴离子表面活性剂，如十二 烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表 面负电荷增加，zeta电势增大，电 渗流增大。
（c）加入有机溶剂，如甲醇、乙腈， 使电渗流增大。
2020/7/9
9.3.2 HPCE中的基本关系式
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Capillary Electrophoresis
本章要求
⒈ 了解电泳、淌度、电渗的概念 ⒉ 了解毛细管电泳仪的结构 ⒊ 了解六种毛细管电泳分离模式
毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE） 又称高效毛细管电泳（HPCE），是以毛细管为分离通道、 以高压直流电场为驱动力的液相分离技术。
根据各组分荷质比不同而分离。背景电解质仅起
传导电流的作用。
t＝0
t＞0
2. 毛细管等速电泳（CITP）
使用两种电解质：一种为迁移率较高的前导离子L电解 质，一种为迁移率较低的尾随离子T电解质，被分离组分夹在L 与T之间，以同一速度运动，由于迁移率不同而分离。
3. 毛细管等电聚焦 (CIEF)
基本操作步骤：进样、聚焦和迁移，用于生物大分子的分 离。
在毛细管中电渗速度可比电泳速度大一个数量级，所以能 实现样品组分同向泳动。正离子的运动方向和电渗流一致， 最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，其迁移速度 相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反， 但因电渗流速度一般都大于电泳速度，在中性粒子之后流 出，从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
3. 检测系统
紫外-可见检测器 ；激光诱导荧光检测器；电化学检测器。
4. 数据处理系统
5.3 毛细管电泳分离模 式
6种分离模式： 毛细管区带电泳CZE 毛细管等速电泳CITP 毛细管等电聚焦CIEF 毛细管电色谱CEC 胶束电动毛细管色谱MECC 毛细管凝胶电泳CGE
1. 毛细管区带电泳 (CZE) 用CZE时，整个系统用一种缓冲溶液 (背景电解质)，
碱
酸
碱
酸
毛细管等电聚焦电泳的运行过程 (a)进样；(b)聚焦；(c)迁移
4. 毛细管电色谱 (CEC) 分为填充柱和开管柱两种方式，可分离离子和中性分子，
且可分离手性分子。
5. 胶束电动毛细管色谱 (MECC) 两相：流动的水相和起固定相作用的胶束相(准固定
相)，被测组分由于在水相和胶束相之间分配系数的差异而分 离。
利用这些带电粒子在电场中迁移速度的不同而达 到分离的技术称为电泳。
2. 毛细管电泳：CE
以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，利用被分 析离子在电场作用下移动速率不同而达到分离的目的，主要 用于分析在毛细管缓冲溶液中离解为离子的物质。
毛细管的内 径比头发丝 还细得多
10-30千伏电压
3. 淌度
2. 缺点
(1) 进样不够方便。 (2) 分析阴离子时，出峰时间较长。电渗会因样品组成而
变化，影响分离重现性。 (3) 光路太短，非高灵敏度的检测器难以测出样品峰。
毛细管电泳与高效液相色谱比较： 操作简单，试样量少。 分离效率高，成本低。 迁移时间的重现性、进样的准确性和灵敏度比HPLC差。
3. 应用
可检测多种样品，如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、 体液或组织及其实验动物活体实验。
本章要求
⒈ 了解电泳、淌度、电渗的概念 ⒉ 了解毛细管电泳仪的结构 ⒊ 了解六种毛细管电泳分离模式
感谢下 载
淌度：单位电场下的电泳速度。
绝对淌度：在无限稀释溶液中（稀溶液数据外推）测
得的淌度称为绝对淌度，0em
电泳速率：待测物从进样端到检测窗口的迁移速度，vem
μem
=
vem E
em：cm2/(sV)；
vem ：cm/s；
E：V/cm
4. 电渗
毛细管内充满溶液 pH > 3时，管内 Si-OH 电离 SiO- 基， 毛细管壁带负电，与溶质界面上形成双电层。在双电层的 扩散外层中，阳离子向阴极移动，带动溶液形成轴向流动。
除分离生物大分子（肽、蛋白、 DNA、糖等）外，还可 用于小分子（氨基酸、药物等）及离子（无机、有机）， 甚至可以分离各种颗粒（硅胶颗粒等）。从无机离子到 整个细胞，具有“万能”分析功能或潜力。
毛细管电泳技术不仅在基础科学中得到广泛应用，在临床 医学等领域也有较多应用，如临床疾病诊断、临床蛋白分 析、临床药物监测、代谢研究、病理研究、PCR产物分析、 DNA片段及序列分析等。
离子的出峰次序为：正离子 > 中性分子 > 子、中性粒子的分离。
㈡ 改变电渗流的大小和方向，可改变分离效率和选择性， 也是CE与HPLC相比能优化分离的重要因素。
㈢ 电渗流的微小变化影响结果的重现性，控制电渗流恒定 是CE分析关键所在。
㈣
电渗流在CE中起到像HPLC中的泵一样作用。
5.4 毛细管电泳特点及应用
1. 优点
(1) 高分辨率：理理论论塔塔板板数数高达数百万块至数千万块。
(2) 高灵敏度：可检测出低至10-20 mol浓度的物质。
HPL(C3中)，纵高向分扩析散速和度传：质可阻3力m是in影内响分谱离峰3展0种宽阴的离重子要；因素1.，7 min 而CE内只分有离纵1向9种扩阳散影离响子谱；峰4 展m宽in，内塔分板离数10：种蛋白质。
(4) 试样用量少：仅需几nL (10-9 L)的试样。
N(5)
(6)
2仪自eDU器动简：C单E，是DU操目:：前作组毛分自成细扩动本管散化低两系端程：数施度分加最析电高一压的个分试离样方仅法需。几毫升。
可 改善采(7，用) N20为0通0(10~~常26)0使010用005V，水的H溶高PL液压C的，，N分对为离人5速和10度3环~和2境分1无0离4。害度。有明显的
CE 实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，使分 析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析， 乃至单分子分析成为可能。生物大分子如蛋白质的分离 分析也因此有了新的转机。
5.1 基本概念和原 理
1. 电泳
在电解质溶液中，带电粒子在直流电场的作用下， 以不同的速度或速率向其所带电荷相反电场方向迁移的 现象。阴离子向正极方向迁移，阳离子向负极方向迁移， 中性化合物不带电荷，不发生电泳运动。
5.2 毛细管电泳装 置
毛细管 铂电极 缓冲溶液
高压电源
1. 进样系统
电动进样；压力进样；扩散进样。 进样体积一般在纳升级。
2. 分离系统
毛细管： 熔融石英，长40~100 cm，内径25~100 m； 恒温系统：控制柱温变化在±0.1℃； 高压电源：电流0~300 A，电压0~30 kV (稳定性±0.1%)