鼠源单克隆抗体
《鼠单抗的改造》课件
基因转录技术
基因转录技术是通过特定的转录调控手段，改变目的基因 的表达水平和表达模式。在鼠单抗的改造中，基因转录技 术可用于提高鼠单抗的表达水平和产量，以及调控其表达 模式和组织特异性等。
VS
药物作用机制研究
通过研究鼠单抗与药物受体的相互作用， 有助于深入了解药物的作用机制和药效。
04 鼠单抗改造的未来展望
改造技术的进一步发展
01
02
03
基因编辑技术
随着基因编辑技术的发展 ，未来可能会实现更加精 准、高效的鼠单抗改造。
细胞工程技术
利用细胞工程技术，可以 实现鼠单抗的高效表达和 生产。
鼠单抗的来源和应用
来源
通过免疫小鼠制备得到。
应用
在生物医学研究、诊断试剂开发、治疗药物等领域有广泛应用。
鼠单抗的优缺点
优点
制备方法成熟、成本相对较低、特异 性高。
缺点
免疫原性较强，可能导致过敏反应； 鼠源性单抗与人体免疫系统存在一定 的交叉反应。
02 鼠单抗的改造技术
基因敲除技术
基因敲除技术是通过特定的基因编辑工具，将目的基因从基因组中删除或破坏，以达到改造或消除特定性状的目的。在鼠单 抗的改造中，基因敲除技术可用于删除或降低鼠单抗中与免疫原性、毒性和其他不良性质相关的基因，提高其安全性和有效 性。
《鼠单抗的改造》PPT 课件
目录
Contents
• 鼠单抗的介绍 • 鼠单抗的改造技术 • 改造后的鼠单抗的应用 • 鼠单抗改造的未来展望
01 鼠单抗的介绍
鼠单抗的定义
GAPDH内参抗体,抗GAPDH单抗,GAPDH小鼠源单克隆抗体
GAPDH内参抗体，抗GAPDH单抗，GAPDH小鼠源单克隆抗体Anti-GAPDH Mouse Monoclonal Antibody （ 2B5）在Western Bloting实验中，可能存在总蛋白浓度测定不准确，或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差；这些误差可以通过测定每个样品中实际转到膜上的内参，比如内参GAPDH的含量来进行校正。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
应用类型：WB（1:1000-1:10,000）、IHC（1:100-1:800）Fig.Western blot analysis (1:10,000) of GAPDH expression in Rat brain (lane A), HeLa cell lysate (lane B), Mouse brain (lane C), Rabbit muscle (lane D), Chicken muscle (lane E) and Pig heart (lane F) with Anti-GAPDH mouse monoclonal antibody (2B5). 免疫原：KLH偶联的GAPDH部分多肽序列来源宿主：小鼠反应性：该GAPDH内参抗体可识别人、小鼠、兔、大鼠、猴、狗、鸡、猪和绵羊等种属的GAPDH蛋白。
保存建议：能在-20℃保存1年。
为最大限度的避免损失，请在打开管盖之前融化抗体并离心。
建议使用前分装以避免反复冻融，分装后可在4℃保存1个月。
GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）是参与糖酵解的一种关键酶，由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western blot蛋白质标准化的内参。
单克隆抗体的应用及其发展前景
单克隆抗体的应用及其发展前景姓名: 学号：专业：摘要：抗体是机体免疫系统的重要效应分子，从第一代多克隆抗体到第二代单克隆抗体的成功制备，人们投入了大量的临床应用研究，对医学和生物学的发展发挥了巨大的作用。
关键词：单克隆抗体，临床，B 淋巴细胞，诊断疾病，局限性，展望1.引言：抗体是由B 淋巴细胞转化而来的浆细胞分泌的，每个B淋巴细胞株只能产生一种它专有的、针对一种特异性抗原决定簇的抗体。
这种从一株单一细胞系产生的抗体就叫单克隆抗体（McAb），简称单抗。
30 年以来，人们一直尝试利用人免疫系统产生人源性单抗来制备特异性强的人源抗体药物，从而治疗肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等。
近年来，单克隆抗体技术的出现是免疫学领域的重大突破。
利用单克隆抗体靶向病变组织或细胞表面抗原，已成为理想的治疗方法2 单克隆抗体在临床上的应用2. 1 用于疾病诊断方面利用单抗进行疾病的诊断现已被广泛应用。
( 1)可用以检测淋巴细胞表面分子, 以区分不同分化阶段的淋巴细胞, 用于鉴别淋巴细胞。
( 2)可用于鉴定病原体, 准确诊断感染性疾病。
将病原体的抗原分离, 再同骨髓瘤细胞杂交建立相应的杂交瘤细胞株, 分泌单克隆抗体, 可以同病原体发生特异性的抗原- 抗体反应, 通过免疫荧光试验或ELISA试验对疾病进行诊断。
( 3)可以用于肿瘤的诊断和分型。
某些单抗具有在肿瘤部位蓄积的特性, 可用于肿瘤的诊断。
目前已批准使用的诊断剂有: 用于结肠癌的votomab和arc ilumonab, 用于探测感染部位的sulemab, 用于卵巢癌的igovomab,用于黑色素瘤的tecnemab K- 1。
( 4)激素类单抗可用于测定体内激素含量, 判断内分泌的功能状态（崔银珠,2001）。
2. 2 用于疾病的治疗目前利用单抗对疾病进行治疗已取得了很大的成果, 主要是将单抗同药物耦联,再与病原体或肿瘤的特异抗原结合后发挥作用。
2. 2. 1 抗细胞表面分子单抗, 可抑制同种免疫反应,主要用于移植排斥反应的防治。
简介鼠源单克隆抗体
张明刚3090101659简介鼠源单克隆抗体众所周知，抗体是于二十世纪三十年代才在世界上通用的词，本质是与相应抗原特异结合的具有免疫功能的球蛋白！而能与抗体特异结合的物质叫做抗原！一、鼠源单克隆抗体的产生历史1、需要证明每种B细胞只能产生单一的抗体2、提取并体外培养骨髓瘤细胞3、解决B细胞与骨髓瘤细胞融合的问题4、如何筛选融合成功的骨髓杂交瘤细胞5、骨髓杂交瘤细胞的体外或体内培养早在1847年，Bence Jones在骨髓瘤患者尿中发现了本周氏蛋白，后被证明是均一的抗体轻链，而生物体产生抗体的基本特点是多样性及不均质性,因而在20世纪50年代之前对这一现象一直没有很合理的解释。
1957年Burnet 提出了抗体产生的细胞系选择学说，认为每个B细胞只能产生一种抗体，且它以独特的受体形式在细胞表面，只与特定的抗原决定簇结合。
后被证明是对的。
后来1965年Sachs等人成功的诱导出骨髓瘤细胞，并且在体外培养成功。
1957年冈田等人用高浓度的仙台病毒是小鼠细胞发生融合。
1975年Kao和Chayluk 提出用聚乙二醇作为融合剂，80年代发现啦电融合技术，解决啦细胞融合问题。
因为细胞融合存在存在A-A、B-B、A-B三中融合方式。
因而如何筛选A-B方式便极为重要。
1964年Littlefiled 创建了融合细胞的筛选方法。
利用两种不同生化缺陷的双亲进行杂交，借助于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤、胸腺嘧啶核苷的HAT选择性培养基选择出了所需杂交细胞。
在这些理论基础上Kohler和Milstein 发表了《分泌特异性抗体融合细胞的持续培养》这篇文章，提出用仙台病毒使小鼠骨髓瘤细胞和经羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合产生的杂交瘤细胞，既具有骨髓瘤细胞永生的特性和脾细胞产生抗羊红细胞抗体的能力。
这一工作为后来制备单抗提供了依据，也标志着单克隆抗体的产生！二、鼠源单克隆抗体的制备1、融合前的准备工作2、融合3、融合后的管理（一）融合前的准备工作（1）准备工作包括组织培养材料的制备、组织培养用水（去离子水）、培养基（高糖DEME、RPMI-1640两种培养基）、血清（常用胎牛血清）、抗生素（2）小鼠免疫用特定的抗原来刺激小鼠，第一次免疫往往产生多价的低亲和力的IgM,随着多次免疫产生了主要为二价的IgG.。
单克隆抗体在人体内应用
噬菌体抗体库技术 具有：能够得到完全人源性Ab、分离抗体速度快、简单易
行等优点。
单克隆抗体在人体内的应用
转基因小鼠技术
单克隆抗体在人体内的应用
几种已被批准上市的McAb药物
Rituxan ( Rituximab,Mabthera，利妥昔单抗 )，Genentech公司生产，商品 名为美罗华。是1997年第一个被美国FDA批准用于人肿瘤治疗的基因工程 1997年FDA批准Zenapax(daclizumab，PDL公司生产)上市。它是靶向为 抗体，最初被用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤， 总有效率达60%，现在正在探 CD25 抗原的人源化单抗，是第 个无严重不良反应的免疫抑制剂，能有 1986 年美国 FDA批准抗CD3鼠单抗1 OKT3 上市，改善了许多肾移植病人的存活。 索用于治疗抗体病相关淋巴瘤和中枢神经系统淋巴瘤。 效减缓器官移植所引起的免疫反应
HGPRT-
单克隆抗体在人体内的应用
HAT培养基
单克隆抗体在人体内的应用
单克隆抗体在人体内的应用
鼠源性单抗应用于人体时具有较强的免疫原性，
将诱发产生 人抗鼠抗体( human anti-mouse
antibody, HAMA ) 反应； 鼠源性单抗通常不能有效地激活人体的免疫反
应，如 补体依赖的细胞毒(CDC)作用 及 抗体依
鼠源单抗人源化 鼠源单抗人源化经历了如下历程：
恒定区人源化 可变区人源化 利用抗体库技术获得完全人源序列
单克隆抗体在人体内的应用
鼠源单抗人源化
1. 恒定区人源化——鼠/人 嵌合抗体 (chimeric antibody)
由于异源性McAb的免疫反应约有90%是针对 恒定区（C区），要降低McAb 的抗原性，必须对它的恒定区进行 人源化 。其原理是从分泌某McAb的杂交
单克隆抗体
单克隆抗体生物技术制药之单克隆抗体【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。
随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。
鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。
减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。
抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。
1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。
从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展
从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展摘要：近年来，单克隆抗体是生物制药领域研究和发展最快的领域之一，单克隆抗体具有地耐药性、高效性、专一性等多种优越特性而受到各界关注，随着单克隆抗体制备技术的不断出现，对其稳定性和亲和力提出了更高的要求，本项目从全人源单克隆技术出发，探讨其改造策略以及未来发展方向关键字：鼠源，全人源，单克隆抗体单克隆抗体是一种由人类通过采用各种化学技术或者人工方式制备，由单一b 受体细胞的单克隆抗体细胞产生的一种抗体。
其高度均一，且仅针对某一特定受体抗原上的表位。
单克隆免疫抗体的制备方法主要具有产物纯度高、交叉免疫反应少、制备时间和成本低、结构均一、特异性强等特点，其主要生物学机理功能主要特点是与抗原分子结合后不能产生间接免疫受体分子或直接阻断配体。
当前已有40多种单抗体克隆免疫抗体被广泛用于自身自体免疫功能性疾病、肿瘤和器官移植等各个方面，效果显著。
1全人源单克隆抗体制备技术自从1975年，KOHLER等人通过杂交瘤技术成功获得了具有抗原特异性的鼠源性单克隆抗体，从而开启了单克隆抗体开发的新纪元。
随着多年发展，单克隆抗体已经成为人们疾病诊治的重要工具。
而鼠源性抗体来源于小鼠，在对人体使用时，存在着诸多缺陷，为解决此类问题，全人源单克隆抗体被提出，是未来单克隆抗体的主要研究方向之一，目前使用较为广泛的全人源单克隆抗体制备技术有以下几种：1.1噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术至1990年成功实施以来，经过30年的发展，已经成为该领域应用最广的制备技术之一。
噬菌体抗体库技术的应用原理是使用PCR技术（聚合酶链式反应技术），将人体抗体编码的基因序列通过技术进行扩增，然后将抗体的基因序列插入到噬菌体中的适当位置，并通过建立一个噬菌体抗体库，让人体抗体和另一个噬菌体外壳上的蛋白进行相融，将两者互相融合的蛋白质形式展示在噬菌体的表面。
噬菌体抗体库技术将通过构建好的抗体库与抗原进行结合，并通过抗原与抗体的差异性相互结合的基因组原理，通过筛选，挑出一种能与目的抗原进行结合的噬菌体，在通过噬菌体基因测序，得到一种新的基因序列,并将其通过基因组技术应用于全人源抗体中。
鼠源单克隆抗体人源化进展
自1975年单克隆抗体杂交技术问世以来，鼠源单克隆抗体（mAb）被誉为神奇的子弹，广泛用于肿瘤检测与治疗。
然而，鼠源单抗作为异源性蛋白在人体内可诱鼠单抗人源化成为最早出现的基因工程抗体。
发抗鼠抗体的生成（HAMA），可产生毒性反应，并使mAb在体内消除加快，这严重影响了鼠单抗的治疗效果。
为解决这一难题，从80年代初期发展到现在，鼠单抗人源化经历了如下历程：恒定区人源化→可变区人源化→利用抗体库技术获得完全人源序列（如图）。
1．恒定区人源化--鼠/人嵌合抗体（chimeric antibody）由于异源性Ab的免疫反应约有90%是针对恒定区（C区），要降低mAb的抗原性，必须对Ab的恒定区进行人源化[1]。
其原理使从分泌某mAb的杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出重排的功能性可变区（V区）基因，经基因重组与Ig恒定区基因相拼接，插入到适宜的表达载体中，构成鼠/人嵌合的轻重链基因表达质粒，经转染骨髓瘤细胞，通过筛选即可制备出鼠/人嵌合抗体。
这种嵌合抗体同鼠源抗体比较至少有以下两个优点：首先，它可以按需要对抗体的效应基因进行选择或剪切。
例如人Ig的同种型IgG1和IgG3对介导补体依赖及细胞介导的溶解作用具备优势，因而利用该技术可以拼接不同亚类的人C区基因，来改变抗体的效应功能，使原细胞毒性较低的IgG2a和IgG2b变成细胞毒性较高的IgG1和IgG3，增强抗体的免疫治疗功能，可用来杀死肿瘤细胞。
其次，在治疗中使用人而不是鼠mAb的同种型，大大减小了鼠源mAb作为异种蛋白对人体的免疫原性，它通过避免抗同种型抗体的产生，减少了HAMA的生成。
例如，当鼠对鼠Ig互补决定区（CDR）产生免疫耐受时，用鼠抗-淋巴细胞Ab可以激发抗独特型反应，但相对那些对可变区不耐受的动物来说，该鼠的抗独特型反应被推迟并很微弱[2]。
Lobulio 对鼠/人嵌合抗体在人体内的动力学和免疫反应的研究表明，鼠/人嵌合抗体在人体内的半衰期比mAb长6倍以上。
注射用抗人T细胞CD3鼠单抗
注射用抗人T细胞CD3鼠单抗【药品名称】通用名称：注射用抗人T细胞CD3鼠单抗英文名称：Mouse Monoclonal Antibody against Human CD3 Antigen of T Lymphocyte for Injection【成份】主要组成成分:鼠抗人T淋巴细胞CD3抗原单克隆抗体。
【适应症】肾脏移植、器官移植病人之急性排斥反应的治疗和预防。
【用法用量】1 用1毫升生理盐水溶解本品,溶液应清亮、无颗粒、沉淀及异物,再稀释于100毫升生理盐水中,立即静脉滴注,30～60分钟注毕,注射速度由医生根据情况掌握,本制剂勿与其他药物混合注射。
2 在第一、二针注射时应密切监视48小时,为减少第一针注射反应,在本品使用前可静脉注射甲基强的松龙琥珀酸钠1.0毫克/kg或地塞米松5～10毫克。
3 在本品使用期间,其他免疫抑制剂的使用应遵医嘱。
4 本品用量一般5～10毫克/日,连续5～14天,具体用法用量由医生酌情掌握。
【不良反应】在本品的74例临床研究期间,少数病人出现以下不良反应:发热(9.46%),皮疹(1.35%),肺部感染(5.41%),白细胞下降(8.11%),单纯疱疹(1.35%),恶心呕吐(2.7%),胃部痉挛(1.35%),腹泻(1.35%),鼻塞四肢发酸(1.35%),其中有的不良反应可能与联合使用的其他免疫抑制剂有关.据文献报道,在抗CD3单抗治疗的头两天发生不良反应的比例较常规治疗为多,大部分病人有发烧(73%,其中2%体温升至40℃或更高),寒颤(57%),另外至少有8%病人出现其他不良反应,包括呼吸困难(21%),胸痛(14%),呕吐(13%),哮喘(11%),恶心(11%),腹泻(10%)及震颤(10%),低于2%的病人在第一次注射后有致命性严重肺水肿,这种副反应通常与液体超负荷有关。
【禁忌】1 对本品或其他鼠源制品过敏的病人禁用。
2 在单抗治疗前一周内体重增加超过3%的病人禁用。
简介单克隆抗体技术及其人源化技术
简介单克隆抗体技术及其人源化技术摘要：单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。
鼠源性mAb由于可引起免疫反应而削弱其疗效，因而逐渐被人源化mAb所取代，甚至出现全人mAb取代人源化mAb的趋势。
本文主要介绍了全人mAb的生产方法之一，转基因小鼠技术，并对该项技术的应用作了些展望。
关键词：单克隆抗体；人源化；转基因小鼠；Cre/LoxPAbstract:After its advent, monoclonal antibody has gone an uneven way to its present wide applications in clinical practices, during which the humanized antibody set an important milestone. Murine mAbs are trended to be replaced by humanized mAbs or even human mAbs as murine mAbs’ immuno-side effects may reduce therapeutic effects. The paper briefly introduces tansgenic mice technology as one of generating human mAbs methods as well as share some prospects.Key Words:Monoclonal Antibody(mAb); Humanization; Transgenic Mice; Cre/LoxP一、单克隆抗体背景介绍从1975年英国学者Milstein和德国学者Kohler利用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合[1]，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
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单克隆抗体McAb
免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提 供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血 清中抗体效价不一定最高。 可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完 全佐剂注射小鼠腹腔 2-4周后加强免 疫（量减半，改用不完全佐剂，可反复 多次） 冲击免疫（融合前3天进行） 选用6-12周龄Balb/c小鼠
单克隆抗体McAb
哺乳动物细胞表达
哺乳动物细胞系表达的重组子抗体,暂时或稳定的 决定于所需要的蛋白质量. 为了获得稳定的转染体细胞系,可以广泛的应用中 国仓鼠卵巢细胞(CHO)或鼠骨髓瘤细胞系。利用占 优势的或隐性的扩增标记进行载体扩增后,可以增 加这些细胞的生产力. 骨髓瘤细胞可以被表达载体转染,该载体包含免疫 球蛋白基因和谷氨酰胺合成酶基因,骨髓瘤细胞可 以在游离谷氨酸的介质中培养.
淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即 一种克隆只产生一种抗体 细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保 持双方亲代细胞的特性 利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞， 并克隆化，制备McAb
单克隆抗体McAb
当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融 合在一起。融合细胞含有两个不同的细 胞核，称为异核体，产生具有原来两个 细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交 细胞（hybrid cell）。
Preparation by size: gel filtration chromatography
单克隆抗体McAb
单克隆抗体McAb
Preparation by charge: ion exchange chromatography
小鼠骨髓瘤细胞 （B细胞恶性肿瘤） 1.具永生性 2.8-AG筛选出 HGPRT-株
PEG 融合 HAT筛选
脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞） （HGPRT+、Ig+）
8-AG8：杂氮鸟嘌呤
单克隆抗体McAb
融合的结果及命运
未融合的骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 脾-脾杂交细胞
未融合的脾细胞
骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞
单克隆抗体McAb
细胞克隆：由一个细胞增殖而成的细胞 集团
单克隆抗体McAb
Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体 Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞 克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源 抗体
单克隆抗体McAb
杂交瘤技术的理论基础
单克隆抗体McAb
鼠和人的单克隆抗体
抗体分泌杂交瘤是由生长是不确定的骨髓瘤细胞得到 的。一些不能分泌的骨髓瘤细胞系缺乏次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖基转化酶(HGPRT), 被确定作为融合配 偶。
为了选择成功的融合细胞,细胞须在一个含有次黄嘌呤, 氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的介质中培养,这样只有 融合细胞可以增生。 噬菌体的发展加强了抗体库的筛选,从而为获得人类单 克隆抗体提供了新的手段.
单克隆抗体McAb
转基因小鼠体内的人抗体
免疫后的转基因小鼠可以产生功能上很重要的高亲 和力的人抗体。通过普通的杂交瘤技术可以实现克 隆和生产。 鼠体内的人抗体和人细胞产生的人抗体可以通过他 们糖基化的状态加以区别 。 预期的结果在最初的实验中达到了，该实验利用含 人抗体的小鼠和由鼠分离的杂交瘤细胞和啮齿类动 物细胞系得到人抗体。
单克隆抗体McAb
有限稀释法
从阳性分泌孔中收集杂交瘤细胞，经过 逐步稀释，使每孔只有一个细胞。
单克隆抗体McAb
单克隆抗体制备具体步骤
单克隆抗体是将抗体产生 细胞与具有无限增殖能力的骨髓 瘤细胞相融合，通过有限稀释法 及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一 的单克隆细胞系而产生的。
单克隆抗体McAb
单克隆抗体McAb
单克隆抗体McAb
颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很 好的免疫效果 可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂 目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的 免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
单克隆抗体McAb
一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开 始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤 细胞系。 可靠的筛选方法须在融合前建立，避免 由于方法不当贻误筛选时机。
单克隆抗体McAb
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。 目的是将抗体分泌细胞、抗体非分泌细 胞、特异性抗体分泌细胞和无关抗体分 泌细胞分开。 克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次 克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板 法、显微克隆法 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体 丢失、变异及污染
单克隆抗体McAb
细胞DNA合成途经
1.替代途径：次黄嘌呤（H）
HGPRT 2.主要途径： 氨 基 酸 谷氨 酰 胺 尿核苷单磷酸
鸟嘌呤核苷酸
（A-）
胸腺嘧啶核苷酸 TK 3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）
单克隆抗体McAb
甲氨蝶呤（aminopterin）
甲氨蝶呤是一种叶酸拮抗剂，可阻断 DNA合成的主要途径，这样DNA的合成 需要补救途径来完成。该途径需要次黄 嘌呤（H）、胸腺嘧啶脱氧核苷（T）等 前体存在。而且细胞内要有次黄嘌呤-鸟 嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）、胸腺 嘧啶核苷激酶（TK）存在。若缺乏其中 一种酶，该补救途径便不能发挥作用。
单克隆抗体McAb
含抗体的奶
为了使哺乳动物的乳腺产生乳蛋白以外的其它蛋白 质,可以从超排卵供体的输卵管微量注射数百个复 制体到受精卵而引入胚系序列,使外来基因和DNA融 合,这些基因编码乳房特殊调节序列.经过一段时间 的离体培养,可以把胚胎转移到假孕动物的输卵管 或子宫,并发育到产期.
最初的奶纯化阶段使用普通的操作，也就是移去酪 蛋白和脂肪。澄清的乳清包含高浓度的相关抗体， 它可以通过离子交换和亲和层析来纯化。纯化的抗 体和从哺乳动物细胞培养中得到的抗体没有区别。
单克隆抗体McAb
骨髓瘤细胞系选择要点： 稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、HGPRT 缺陷株 常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤） 防止支原体污染（胎牛血清） 融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的 形态，活细胞计数高于95％ 融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环节 需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆 化和扩大培养过程中 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞 饲养细胞一般在融合前一天制备
单克隆抗体McAb
单抗生产的方法： 动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸 或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞， 7-10天后出现腹水，无菌采集。
单克隆抗体McAb
单抗纯化方法：
盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 辛酸沉淀法
单克隆抗体McAb
单克隆抗体特性 理化性状高度均一，生物活性专一，只 与一种抗原表位发生反应，特异性强， 纯度高，易于实验标准化和大量制备
单链Fv片段
scFv 在非靶组织中滞留时间较短，在血液中清除速 度较快且更易侵入肿块。它有较低的免疫原性，并 较易和蛋白质及肽结合。
单一抗体片段
它和轻链可变区相互作用的粘连的碎片影响了他们 的溶解度和稳定性。它和抗原的亲和力较低而且和 不相干的抗原有交叉反应的趋势。
构建多价体Fv抗体
为了增加单价体scFv的亲和性，可以强制缩合肽段 使它们形成多聚体。
单克隆抗体McAb
抗体片段的重组
由重链可变区和轻链可变区组成的Fv片段，是包 含抗原结合位点的最小免疫球蛋白片段。然而， Fvs的两条链的结合力比Fab段的要低，Fab段也是 由CH1和CL的不变区组成的。VH和VL之间是由肽段 连接的，二硫键和“节和孔突变”可以加固他们 的连接。
单克隆抗体McAb
单克隆抗体McAb
免疫动物 收集致敏的B淋巴细胞
培养骨髓瘤细胞 收集骨髓瘤细胞
细胞融合
HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞
检测筛选阳性细胞
克隆化培养（反复3-5次）
获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株
McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）
McAb 纯化及鉴定
单克隆抗体McAb
制备单克隆抗体的基本技术
第三章 鼠源单克隆抗体
单克隆抗体McAb
概述
在过去的二十五年里,利用杂交瘤细胞生产了成千上万 的鼠单克隆抗体.人们用同样的技术从转基因鼠中克隆 人类的抗体，并设计了全长型抗体和重组片段,它们可 以被用于多种诊断和治疗。而且如果他们能在哺乳动 物细胞,牛奶及植物中表达,就可以大量获得. 一个世纪以前,Paul Ehrlich提出了著名的侧链理论来解 释抗原抗体的相互作用.他不久又铸造了一个虚构的短 语”魔弹”来形容抗体对准及中和抗原.七十五年以后 Georges Kö hler and Cé sar Milstein发明了单克隆抗体技 术,因此为细胞生物学和临床诊断学的巨大进步铺平了 道路.
单克隆抗体McAb
重组子抗体的细菌产物
离体培养重组后的大肠杆菌的细胞质包涵体可以产生抗 体片段。分子内二硫键形成功能性抗体片段可以分泌到 壁膜间隙甚至大肠杆菌的介质，这需要融合细菌信号肽 到抗体N末端。然而，高水平表达常常导致不溶解的抗 体片段转运到周质腔后积累。 大肠杆菌一些折叠部分的过度表达，不能增加可溶性抗 体片段的产量。