人源化单克隆抗体
人源化单克隆抗体研究进展
人源化单克隆抗体研究进展人源化单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的生物药物，通过杂交瘤技术将鼠源单克隆抗体的可变区与人类抗体的恒定区进行交换，以减少免疫原性，提高治疗效果。
近年来，随着科技的不断进步，人源化单克隆抗体研究取得了显著的进展，为肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等治疗领域提供了新的思路和方法。
研究现状：人源化单克隆抗体方法、成果与不足人源化单克隆抗体研究主要包括抗体库的建立、抗体筛选和优化、以及抗体生产等多个环节。
目前，研究人员已成功建立了多种人源化单克隆抗体，并应用于临床试验，取得了一定的疗效。
例如，针对肿瘤治疗的人源化单克隆抗体药物能够特异性地识别肿瘤细胞，并通过激活免疫反应来杀死肿瘤细胞。
然而，人源化单克隆抗体研究仍存在一定的不足之处，如抗体药物的免疫原性、毒副作用等问题需要进一步解决。
研究方法：人源化单克隆抗体研究实验设计与数据分析人源化单克隆抗体研究的实验设计主要包括建立人源化抗体库、筛选和优化抗体，以及进行药效和毒理试验等。
在实验过程中，需要采集和处理大量的实验数据，并进行深入的统计分析和比对，以获得抗体的最佳配对组合和最佳治疗剂量等参数。
成果和不足：人源化单克隆抗体研究的成果与不足人源化单克隆抗体研究在肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等多个治疗领域取得了显著的成果。
例如，针对肿瘤治疗的人源化单克隆抗体药物已经成功应用于临床试验，并显示出较好的疗效和安全性。
在自身免疫性疾病和神经系统疾病治疗领域的人源化单克隆抗体药物也在研发和试验阶段。
然而，人源化单克隆抗体研究仍存在一定的不足之处，如抗体药物的免疫原性、毒副作用等问题需要进一步解决。
同时，抗体药物的生产成本较高，限制了其在临床上的广泛应用。
尽管人源化单克隆抗体研究取得了一定的成果，但仍存在许多问题需要进一步解决。
未来，研究人员需要进一步探索人源化单克隆抗体的作用机制和优化方法，以获得更高效、安全、低成本的药物。
同时，需要加强抗体药物的工艺研究，提高生产效率和降低生产成本。
人源化抗体与单克隆抗体制备的主要方法
ELISA
抗體生產： 1) 可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，通常可取15mL 左右； 腹水中的抗體濃度非常高，每 mL 可達數 mg。 2) 把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每 mL 只得約數 mg，濃度較腹水稀約一 千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。 3) 得到穩定的抗體後，通常要再以 ELISA 方法 檢定該抗體的 subclass 是屬於 IgG, IgM 或 IgA 等。 免疫時 間太短的，較可能取得 IgM，但一般仍以 IgG 較多，注意 IgG 又可分成幾種 sub-subclass。 4) 所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰ • 硫酸銨分劃： 收集約 40% 飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。 • 離子交換法： 用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。 • 膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。 • 親和層析法： 以 Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 (IgG)。
• • •
基因工程抗体的优点和缺点 • 优点：
不受动物品系（species)和抗体类型（isotype)的限制。 利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。 全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。
•
• 目的：
缺点：
抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降低。
克隆化的原则是对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失
帕博利珠单抗结构
帕博利珠单抗结构帕博利珠单抗（Pembrolizumab），也被称为Keytruda，是一种人源化的单克隆抗体，具有高度选择性地抑制免疫检查点分子PD-1（程序性死亡-1）。
它是一种免疫疗法药物，用于治疗多种恶性肿瘤，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、鼻咽癌、淋巴瘤等。
帕博利珠单抗的结构是由人源化的单克隆抗体技术制备的。
具体而言，它是由采集人体免疫细胞，经过体外培养与处理获得的。
首先，难以培养的细胞源（如外周血淋巴细胞）被提取，然后通过重组DNA技术将它们与合适的哺乳动物细胞或真核表达系统进行杂交。
通过这种方法，人源化的单克隆抗体可在体外得到扩展和保存，并且具备强大的抗原结合能力和良好的免疫原性。
帕博利珠单抗的结构由两个重链和两个轻链组成，每个链由多个氨基酸组成。
该抗体的重链与轻链之间通过二硫键相互连接，并且形成Y型结构。
每条重链和轻链均包含细胞表面识别特定抗原的结构域，该抗原与PD-1分子表面特异性结合。
通过与PD-1分子结合，帕博利珠单抗能够阻止PD-1与其配体PD-L1（程序性死亡配体-1）或PD-L2结合，从而抑制肿瘤细胞逃避免疫攻击的机制。
帕博利珠单抗的工作机制主要通过抑制PD-1/PD-L1信号通路来增强宿主免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力。
正常情况下，PD-1受体与PD-L1或PD-L2配体结合时，会启动免疫耐受机制，从而抑制免疫细胞的活性。
在一些肿瘤中，肿瘤细胞表面增加了PD-L1的表达，进而与PD-1结合，从而减弱免疫细胞的杀伤能力。
帕博利珠单抗可以与PD-1结合并阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用，从而恢复免疫细胞对肿瘤细胞的攻击能力。
由于帕博利珠单抗的突出特点和疗效，它已经成为一种重要的抗肿瘤药物。
临床研究表明，帕博利珠单抗在许多恶性肿瘤的治疗中具有显著的活性和耐受性。
它可以显著提高患者的生存率和生活质量，并为那些传统治疗方法无效或不耐受的患者提供了新的治疗选择。
总之，帕博利珠单抗是一种针对免疫检查点PD-1的抗体药物。
5.1单克隆抗体人源化
第五章 人源性抗体第一节单克隆抗体人源化通常我们制备的单克隆抗体来源于小鼠，这种抗体若用于人体的治疗，由于抗体的免疫性会诱发机体产生人抗鼠反应，会给机体造成损伤，同时降低药物的疗效。
因此，为了解决这个问题，我们需对鼠源抗体进行人源化改造。
在学习单克隆抗体人源化之前，我们首先来回忆下抗体的基本结构与功能（图1）。
以IgG类抗体为例，抗体是由2条相同的重链和轻链通过二硫键形成的4肽链结构，其中，重链包含一个可变区（VH区）和三个恒定区（CH区）轻链包含一个可变区（VL区）和1个恒定区（CL区）。
重链和轻链的可变区构成特异性识别抗原的区域，可变区中又有超变区（CDR区），重链和轻链可变区中各自有3个超变区，这些超变区构成最直接结合抗原的区域。
图1 抗体的基本结构模式图单克隆抗体人源化就是在保留抗体特异性的前提下降低其免疫原性的过程，因为非人源性抗体进入人体内会引起严重的机体排异反应，进而影响抗体在临床应用时的安全性和治疗效果，因此需要对抗体进行人源化改造，最大程度降低抗体的异源性，并且使其特异性和亲和力保持不变。
单克隆抗体的人源化发展经历了嵌合抗体、人源化抗体及全人源性抗体等3个阶段（图2）。
图2单克隆抗体的人源化发展历程鼠/人嵌合是嵌合抗体的主要类型，由鼠源性抗体的可变区(V区)与人源抗体的恒定区(C区)拼接而成。
优点是保留了鼠源性抗体与抗原结合的特异性和亲和力，又降低或消除了部分鼠源性抗体作为异源蛋白对人体的免疫原性。
第二代人源化抗体就是指CDR移植抗体，也是指现在通常所说的人源化抗体。
因为CDR的氨基酸序列和空间结构有多态性，是决定抗体的特异性和亲和力的关键因素。
所以，我们在做鼠源单抗人源化时仅保留6个鼠源单抗的CDR区，其它区域均换成人源的，人源化抗体的人源性部分可达90%以上。
CDR移植技术的理论依据是CDR是决定抗原结合位点的唯一结构，因而也是抗体特异性和亲和力的决定部位，而框架区能够接受外源成分的植入。
全人源化单抗(Fully Human Monoclonal Antibody)
全人源化单抗（Fully Human Monoclonal Antibody）人源化 mAb 基本上解决了鼠抗体的最重要问题——免疫原性，但是人源化过程仍很繁复且费用昂贵，它需要广泛的计算机模型设计，即使如此，大量反复试验仍不可避免，因为要试验各种氨基酸置换以测定对目标选择性和结合亲和力的有害作用。
而全人源化单克隆抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体完全人源化的目的。
目前生产完全人源化抗体的方法主要包括抗体库技术和人源性抗体转基因小鼠技术两种。
抗体库技术抗体库技术包括噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术。
噬菌体抗体库技术：是利用噬菌体表达外源基因的一项新技术，是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与噬菌体的外壳蛋白Ⅲ（PⅢ）或外壳蛋白Ⅷ（PⅧ）基因随机重组，继而感染大肠杆菌，后经增殖并在噬菌体表面以抗体片段 Fab 或单链抗体可变区（ScFv）一外壳蛋白的融合蛋白形式表达。
这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程，就能筛选并富集特异性抗体。
所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。
其最大特点是实现了直接将基因型和表型联系在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性的抗体核糖体展示技术：将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的 DNA 在体外进行转录与翻译，由于对 DNA 进行了特殊的加工与修饰，如去掉3′ 末端终止密码子，核糖体翻译到 mRNA 末端时，由于缺乏终止密码子，停留在 mRNA 的3′末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA 三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在 ELISA 微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的 mRNA 进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR 产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。
人源化CD3单克隆抗体
无动物源成分
低内毒素: < 2 EU/mg 纯化 : Protein A亲和层析 纯度：SEC-HPLC检测，纯度≥ 95%
无菌过滤: 0.2 μm滤膜过滤除菌
运输及储存: 2-8℃ For research use only
【产品应用】
流式细胞术 免疫细胞化学 T细胞活化 免疫共沉淀 人外周血淋巴细胞分析，2 μg/106细胞 5-50 μg/ml
研发实验室
生产车间
重组抗CD3人源化单克隆抗体于2007年通过 国家食品药品监督管理局(SFDA)的批准，进 行I～II期临床试验批件号2007L01967。临床 适应症是肾移植术后急性排斥反应的预防和 治疗。目前，I期临床已经完成，II期临床正 在进行中。
【产品特性】
反应种属：Human 特异性：TCR-CD3复合物ε链 来源：OKT3人源化改造 产品质量通过GMP认证
活化T 细胞—用法用量根据预实验确定；本品适用于直肠癌、乳腺癌、肺 癌、肾癌、淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、恶性黑色素瘤、卵巢癌等多 种肿瘤的CIK细胞免疫疗法临床研究。
根据实验需要确定
【相关染色PBMC
Humanized CD3 MAb
Fig 2. 本产品与OKT3相对亲和力测定量效曲线
背景介绍
CD3分子是广泛分布于人成熟T淋巴细胞表面的膜抗原，它与T细胞表面膜受体 TCR形成复合体，在细胞内信息传递过程中起着重要的作用。已有的研究表明抗 人T细胞CD3的单抗具有激活和抑制T细胞的双向功能，它在抗肿瘤、抗多种器 官移植排斥反应及再生障碍贫血的治疗中已显示出广阔的应用前景。 OKT3是由美国Ortho药物公司生产的抗人CD3的单抗，它对预防和治疗器官移植免 疫排斥反应有良好的效果，因此成为第一个被美国FDA批准投放市场的单克隆抗 体。OKT3作为鼠源性单抗应用于人体时可引起人抗鼠抗体免疫应答(HAMA)， HAMA可加快血清中鼠源抗体的清除，阻断单抗的治疗效果，严重时还可引发变 态反应危及生命。 为了克服鼠源性单克隆抗体应用于人体时所出现的 严重过敏反应，人源化抗体应运而生，并很快成为 十余年来国内外生物医学研究的重大热点之一。由 于通过杂交瘤技术难以获得特异性强、亲和力高的 人源抗体，鼠源抗体的人源化改造成为主要途径。 进行抗体人源化有两个基本原则：l、保持原鼠源抗 体的亲和力和特异性；2、大大降低鼠源抗体的免疫 原性。
人源化单抗
穿上披风 我们开溜！
❖ 诱发人抗小鼠反应、降低抗体效果甚至造成 人体损伤、半衰期较短、较快被清除而影响 疗效、在人体中常不能有效激活补体和Fc受 体相关的效应系统。
❖ 它不禁具有较长的半衰期，低免疫原性，还 能与天然效应因子相互作用，
人源化抗体的构建相关技术
❖ 嵌合体制备技术 ❖ 噬菌体表面展示技术 ❖ 核糖体展示技术 ❖ 转基因技术
转基因技术
❖ 全人抗体还可以通过小鼠的基因工程免疫 方法获得。 产生一免疫反应的基因工程敲 除鼠，然后用杂交瘤技术使小鼠的脾细胞 或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。通过灭活 内源 性的小鼠抗体基因，然后引进人源抗 体基因片段，当对人源抗体免疫的时候就 可以在小 鼠体内产生全人抗体分子。
❖ 另一种方法是将人抗体基因微位点转入小鼠 体内细胞，转染 色体小鼠的免疫抗原基因环 境和人类非常相似。 还有一种不同的方法是 向免疫供体或混 合性严重免疫缺陷的小鼠注 入人源淋巴细胞， 通过抗原免疫使小鼠脾细 胞融合骨髓瘤细 胞
子的表达。因而更多的是用来高效表达Fv、 Fab及ScFv等功能片段。
2 酵母表达体系
主要包括酿酒酵母、裂殖酵母、克鲁维酸酵母、 甲醇酵母等表达系统。其中甲醇酵母表达系统 使用最广泛。巴斯德毕赤酵母系统作为甲醇酵 母系统之一，使用得最多，也最广泛。
3 昆虫杆状病毒表达系统
昆虫杆状病毒表达系统是一种优良的真核基 因细胞表达系统。由于昆虫细胞来源广，比 较经济，而且具有正确完成蛋白质翻译后加 工和糖基化修饰等诸多优越性，已被广泛应 于外源基因的表达。
我国人源化抗体药物
上海中信国健药业有限公司历时5年，自主 研发的抗体类新药“注射用重组人Ⅱ型肿瘤 坏死因子受体－抗体融合蛋白”（商品名为 “益赛普”），获得国家食品药品监督管理 局颁发的《药品ＧＭＰ证书》，成功上市。
人源化单克隆抗体
3.SDR移植抗体(SDR grafted antibody)
humanized monoclonal antibody
4.全人单克隆抗体(Fully humaneantibody)
humanized monoclonal antibody
噬菌体表面展示技术
抗体库筛选技术 核糖体展示技术
转基因小鼠
humanized monoclonal antibody
真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3 个互补决定区(CDR) 是鼠源的外，其余全 部是人源结构，人源化程度可达到95%以 上，具有更高的安全性和更低的毒性。
缺点：
有时异基因的CDR人源化抗体可能引起抗 个体基因型反应。
改良方案：
进行SDR移植改良
微胞杂交干细胞技术
类骨髓移植技术
人源化单克隆抗体的研究进展与应用
什么是单克隆抗体？
humanized monoclonal antibody
什么onal antibody
具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞 分泌特异性抗体能力的致敏B细胞
为什么要研究人源化单克隆抗体？
humanized monoclonal antibody
(1)鼠源性单抗容易齐易产生人抗鼠抗 体(HAMA)，在体内作为异源蛋白被清 除掉，从而削弱其治疗的有效性。
不，你不要
(2)鼠源性单抗在人体内生物活性降低，
我要
不能有效地激活人体的生物效应。
怎么做人源化单克隆抗体？
humanized monoclonal antibody
基本思路：
鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓， 从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导HAMA (人抗鼠抗体)反应。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
什么是人源化单克隆抗体？
人源化单克隆抗体是利用现有的无数已详细分析 过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段 （互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和 力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几 乎去除免疫原性和毒副作用的抗体。
人源单克隆抗体的发展
斯坦利斯（Steinitz）1977年报道了利用EB病毒（一 种常见疱疹病毒），在体外直接感染人外周血淋巴细胞， 建立了能分泌半抗原抗体的人B淋巴细胞系。
真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3个互补决定区（CDR） 是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可达到95%以上， 具有更高的安全性和更低的毒性。 不足
有时异基因的CDR人源化抗体可能引起抗个体基因型反应。
改良方案
——进行SDR移植改良
临床应用
近年来 ,人源化抗体和人抗体的出现为临床应用带来 了新的希望 ,当前正处于临床研究的多种抗体中 , 嵌合抗 体和 人 源 化 抗 体 所 占 比 例 大 于70 %。目前的人源化 抗体 ,主要用于肿瘤、 自身免疫性疾病和心血管疾病的治 疗以及抗移植排斥反应和抗病毒感染等方面。
*谢谢观看！
后来用这种技术成功获得了抗病毒、Байду номын сангаас菌、血型抗 原、自身抗原及肿瘤相关抗原的人单克隆抗体分泌细胞。
制备人源单克隆抗体的方法
1、人—鼠杂交瘤单克隆抗体。 人-鼠杂交瘤的融合方法基本与鼠-鼠杂交相同。
亲本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B细胞来源 于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。
2、人—人杂交瘤单克隆抗体。 建立人骨髓瘤或其他人细胞系与人淋巴细胞融合来制
缺点
由于嵌合抗体可变区（V）约占整个抗体的30%，鼠源性抗体V 区中的框架区（FR)仍残留一定的免疫原性，可诱导HAMA反应。
解决方案
灵长目源抗体也是一类嵌合抗体， 通过免疫短尾猿猴产生。由于其抗体的 可变区与人可变区无差异，不至于发生 抗体反应。
2.CDR移植抗体（CDR grafted antibody)
3 .在心血管疾病方面的应用：
美国 FDA 于 1994 年批准了第一个人-鼠嵌合 Fab 抗体的上市，该 抗体现已被广泛应用于多种心血管疾病治疗 ,主要用于预防冠状动 脉成形术后的再狭窄。 4 .在自身免疫性疾病方面的应用: 现有的研究表明 ,抗体对类风湿性关节炎、 系统性红斑狼疮、 牛皮 癣、 多发性硬化、 硬皮病、 溃疡性结肠炎等疗效较好。 5 . 在抗病毒感染方面的应用： 近年来研究表明 ,在 HBV、HCV、 HIV 等病毒感染性疾病中 ,人源 化抗体显示了较好的应用前景。如：商品名为 SynagisTM的抗呼吸 道病毒感染的抗体在美国已经上市 ,为人源化的基因工程抗体。
备人单克隆抗体。人源性融合亲本细胞须具有较高的融合 率、产生的杂交瘤核型稳定并能产生一定量的具有特异性 的抗体等特征。 3、严重联合免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体。
将人免疫干细胞移植到SCID小鼠（CB-17纯系小鼠16 号染色体突变，使动物T、B淋巴细胞功能障碍导致联合免 疫缺陷）体内，使该小鼠获得人的免疫系统。
*人源化单克隆抗
体
为什么要研究人源化单克隆抗体？
鼠源性单克隆抗体局限性： 1、不能有效地激活人体中补体和Fc受体相关的效应系统。 2、被人体免疫系统所识别，产生人抗鼠抗体（human antigen mouse antibody，HAMA） 3、在人体循环系统中很快被清除掉。
所以，必须通过人源化改造获得低免疫原性、高效性、 人源性单克隆抗体。
4、基因工程单克隆抗体——基因工程抗体 通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适
当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体。基因工 程技术可以获得完全人源化抗体。
1.嵌合抗体（Chimeric antibody)
用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由鼠的可变区和人 的恒定区组成的嵌合抗体。
1 .在肿瘤治疗方面的应用:
单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应。如 2005年我国开发出癌症治疗药——重组人源化抗人表皮生长因子受 体单克隆抗体(商品名：泰欣生)。泰欣生联合放疗治疗鼻咽癌的完 全缓解率比单纯放疗的患者提高30%以上。 2 .在器官移植中的应用:
近年来 ,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐渐增加。如 1986年批准进入美国市场的治疗性抗体类药物抗 CD3单抗即被用 于肾、 心脏、 肝脏移植排斥的逆转。