鼠源抗体的人源化设计
人源化单克隆抗体研究进展
人源化单克隆抗体研究进展人源化单克隆抗体是一种具有高度特异性和亲和力的生物药物，通过杂交瘤技术将鼠源单克隆抗体的可变区与人类抗体的恒定区进行交换，以减少免疫原性，提高治疗效果。
近年来，随着科技的不断进步，人源化单克隆抗体研究取得了显著的进展，为肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等治疗领域提供了新的思路和方法。
研究现状：人源化单克隆抗体方法、成果与不足人源化单克隆抗体研究主要包括抗体库的建立、抗体筛选和优化、以及抗体生产等多个环节。
目前，研究人员已成功建立了多种人源化单克隆抗体，并应用于临床试验，取得了一定的疗效。
例如，针对肿瘤治疗的人源化单克隆抗体药物能够特异性地识别肿瘤细胞，并通过激活免疫反应来杀死肿瘤细胞。
然而，人源化单克隆抗体研究仍存在一定的不足之处，如抗体药物的免疫原性、毒副作用等问题需要进一步解决。
研究方法：人源化单克隆抗体研究实验设计与数据分析人源化单克隆抗体研究的实验设计主要包括建立人源化抗体库、筛选和优化抗体，以及进行药效和毒理试验等。
在实验过程中，需要采集和处理大量的实验数据，并进行深入的统计分析和比对，以获得抗体的最佳配对组合和最佳治疗剂量等参数。
成果和不足：人源化单克隆抗体研究的成果与不足人源化单克隆抗体研究在肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等多个治疗领域取得了显著的成果。
例如，针对肿瘤治疗的人源化单克隆抗体药物已经成功应用于临床试验，并显示出较好的疗效和安全性。
在自身免疫性疾病和神经系统疾病治疗领域的人源化单克隆抗体药物也在研发和试验阶段。
然而，人源化单克隆抗体研究仍存在一定的不足之处，如抗体药物的免疫原性、毒副作用等问题需要进一步解决。
同时，抗体药物的生产成本较高，限制了其在临床上的广泛应用。
尽管人源化单克隆抗体研究取得了一定的成果，但仍存在许多问题需要进一步解决。
未来，研究人员需要进一步探索人源化单克隆抗体的作用机制和优化方法，以获得更高效、安全、低成本的药物。
同时，需要加强抗体药物的工艺研究，提高生产效率和降低生产成本。
人源化单克隆抗体的构建技术
人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。
其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。
抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。
本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。
关键词：人源化,单克隆抗体,构建从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。
单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。
然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。
因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。
随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。
人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。
从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展
从鼠源到全人源单克隆抗体制备技术及改造策略的研究进展摘要：近年来，单克隆抗体是生物制药领域研究和发展最快的领域之一，单克隆抗体具有地耐药性、高效性、专一性等多种优越特性而受到各界关注，随着单克隆抗体制备技术的不断出现，对其稳定性和亲和力提出了更高的要求，本项目从全人源单克隆技术出发，探讨其改造策略以及未来发展方向关键字：鼠源，全人源，单克隆抗体单克隆抗体是一种由人类通过采用各种化学技术或者人工方式制备，由单一b 受体细胞的单克隆抗体细胞产生的一种抗体。
其高度均一，且仅针对某一特定受体抗原上的表位。
单克隆免疫抗体的制备方法主要具有产物纯度高、交叉免疫反应少、制备时间和成本低、结构均一、特异性强等特点，其主要生物学机理功能主要特点是与抗原分子结合后不能产生间接免疫受体分子或直接阻断配体。
当前已有40多种单抗体克隆免疫抗体被广泛用于自身自体免疫功能性疾病、肿瘤和器官移植等各个方面，效果显著。
1全人源单克隆抗体制备技术自从1975年，KOHLER等人通过杂交瘤技术成功获得了具有抗原特异性的鼠源性单克隆抗体，从而开启了单克隆抗体开发的新纪元。
随着多年发展，单克隆抗体已经成为人们疾病诊治的重要工具。
而鼠源性抗体来源于小鼠，在对人体使用时，存在着诸多缺陷，为解决此类问题，全人源单克隆抗体被提出，是未来单克隆抗体的主要研究方向之一，目前使用较为广泛的全人源单克隆抗体制备技术有以下几种：1.1噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术至1990年成功实施以来，经过30年的发展，已经成为该领域应用最广的制备技术之一。
噬菌体抗体库技术的应用原理是使用PCR技术（聚合酶链式反应技术），将人体抗体编码的基因序列通过技术进行扩增，然后将抗体的基因序列插入到噬菌体中的适当位置，并通过建立一个噬菌体抗体库，让人体抗体和另一个噬菌体外壳上的蛋白进行相融，将两者互相融合的蛋白质形式展示在噬菌体的表面。
噬菌体抗体库技术将通过构建好的抗体库与抗原进行结合，并通过抗原与抗体的差异性相互结合的基因组原理，通过筛选，挑出一种能与目的抗原进行结合的噬菌体，在通过噬菌体基因测序，得到一种新的基因序列,并将其通过基因组技术应用于全人源抗体中。
鼠源单克隆抗体人源化进展
自1975年单克隆抗体杂交技术问世以来，鼠源单克隆抗体（mAb）被誉为神奇的子弹，广泛用于肿瘤检测与治疗。
然而，鼠源单抗作为异源性蛋白在人体内可诱鼠单抗人源化成为最早出现的基因工程抗体。
发抗鼠抗体的生成（HAMA），可产生毒性反应，并使mAb在体内消除加快，这严重影响了鼠单抗的治疗效果。
为解决这一难题，从80年代初期发展到现在，鼠单抗人源化经历了如下历程：恒定区人源化→可变区人源化→利用抗体库技术获得完全人源序列（如图）。
1．恒定区人源化--鼠/人嵌合抗体（chimeric antibody）由于异源性Ab的免疫反应约有90%是针对恒定区（C区），要降低mAb的抗原性，必须对Ab的恒定区进行人源化[1]。
其原理使从分泌某mAb的杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别出重排的功能性可变区（V区）基因，经基因重组与Ig恒定区基因相拼接，插入到适宜的表达载体中，构成鼠/人嵌合的轻重链基因表达质粒，经转染骨髓瘤细胞，通过筛选即可制备出鼠/人嵌合抗体。
这种嵌合抗体同鼠源抗体比较至少有以下两个优点：首先，它可以按需要对抗体的效应基因进行选择或剪切。
例如人Ig的同种型IgG1和IgG3对介导补体依赖及细胞介导的溶解作用具备优势，因而利用该技术可以拼接不同亚类的人C区基因，来改变抗体的效应功能，使原细胞毒性较低的IgG2a和IgG2b变成细胞毒性较高的IgG1和IgG3，增强抗体的免疫治疗功能，可用来杀死肿瘤细胞。
其次，在治疗中使用人而不是鼠mAb的同种型，大大减小了鼠源mAb作为异种蛋白对人体的免疫原性，它通过避免抗同种型抗体的产生，减少了HAMA的生成。
例如，当鼠对鼠Ig互补决定区（CDR）产生免疫耐受时，用鼠抗-淋巴细胞Ab可以激发抗独特型反应，但相对那些对可变区不耐受的动物来说，该鼠的抗独特型反应被推迟并很微弱[2]。
Lobulio 对鼠/人嵌合抗体在人体内的动力学和免疫反应的研究表明，鼠/人嵌合抗体在人体内的半衰期比mAb长6倍以上。
简介单克隆抗体技术及其人源化技术
简介单克隆抗体技术及其人源化技术摘要：单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。
鼠源性mAb由于可引起免疫反应而削弱其疗效，因而逐渐被人源化mAb所取代，甚至出现全人mAb取代人源化mAb的趋势。
本文主要介绍了全人mAb的生产方法之一，转基因小鼠技术，并对该项技术的应用作了些展望。
关键词：单克隆抗体；人源化；转基因小鼠；Cre/LoxPAbstract:After its advent, monoclonal antibody has gone an uneven way to its present wide applications in clinical practices, during which the humanized antibody set an important milestone. Murine mAbs are trended to be replaced by humanized mAbs or even human mAbs as murine mAbs’ immuno-side effects may reduce therapeutic effects. The paper briefly introduces tansgenic mice technology as one of generating human mAbs methods as well as share some prospects.Key Words:Monoclonal Antibody(mAb); Humanization; Transgenic Mice; Cre/LoxP一、单克隆抗体背景介绍从1975年英国学者Milstein和德国学者Kohler利用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合[1]，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
鼠源抗体人源化基本流程
鼠源抗体人源化基本流程1.引言抗体是一类免疫球蛋白，具有识别和结合抗原的能力，广泛应用于医学和生命科学研究中。
然而，鼠源抗体在临床应用中存在一些问题，例如免疫原性反应和免疫复合物形成。
为了解决这些问题，人源化抗体的研究和开发成为热门领域之一。
本文将介绍鼠源抗体人源化的基本流程。
2.鼠源抗体人源化流程概述鼠源抗体人源化的基本流程主要包括以下步骤：2.1鼠源抗体选择首先，选择具有特定结合特异性的鼠源抗体作为起点抗体。
这些鼠源抗体通常是通过对抗原免疫小鼠，然后采集小鼠的脾细胞，通过杂交瘤技术获得的。
2.2人源抗体基因的构建为了实现鼠源抗体人源化，需要构建包含人源抗体基因的表达载体。
通常，将包含鼠源抗体的变异型重链和轻链基因分别与人源抗体F c区的基因连锁，形成完整的人源抗体基因。
2.3表达载体的转染和表达将构建好的人源抗体基因载体导入哺乳细胞表达系统，例如细胞株C H O或HE K293中。
通过转染技术，将表达载体转入这些细胞中，以实现人源抗体的表达。
2.4筛选和鉴定通过对转染细胞进行筛选，筛选出高表达人源抗体的细胞株。
然后，对所得到的人源抗体进行鉴定，包括抗原结合亲和力的测定和功能验证等。
3.鼠源抗体人源化基本流程详述3.1鼠源抗体选择在鼠源抗体人源化的流程中，首先需要选择适合的鼠源抗体作为起点。
选择的抗体应具有高特异性和亲和力，并且针对所需的靶标抗原。
这可以通过EL IS A、免疫组化等技术进行初步筛选。
3.2人源抗体基因的构建选定鼠源抗体后，需要构建人源抗体基因。
基本流程包括以下步骤：-3.2.1分离鼠源抗体基因：通过提取小鼠脾细胞中的DN A，通过PC R扩增鼠源抗体的变异型重链和轻链基因。
-3.2.2构建人源抗体基因：将鼠源抗体基因与人源抗体F c区的基因进行连接，形成完整的人源抗体基因。
连接可以通过D NA连接酶或重组酶进行。
3.3表达载体的转染和表达构建好的人源抗体基因载体需要通过转染技术导入表达系统中。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是一种重要的生物工程技术，通过对抗体进行基因工程改造，使其具备与人类抗体相似的结构和功能，从而增强其在治疗和诊断领域的应用。
抗体人源化的主要原理包括人源化基因设计、基因克隆、表达和纯化等步骤。
人源化基因设计是抗体人源化的关键步骤之一。
一般来说，人源化的抗体是通过将小鼠源抗体的可变区与人源抗体的框架区（FR）进行重组来实现的。
在设计人源化基因时，需要选择与小鼠源抗体可变区高度同源的人源抗体可变区作为替代。
这样，可以保留小鼠源抗体的结构和功能，同时减少人体免疫系统对抗体的排斥反应。
基因克隆是将人源化基因插入真核表达载体的过程。
首先，需要设计引物，引物的选择应根据人源化基因的序列设计，确保引物与目标基因的特异性和互补性。
然后，通过PCR反应扩增人源化基因，并经过酶切和连接等步骤，将目标基因插入真核表达载体。
最后，将重组的质粒转化到大肠杆菌中，经过筛选和测序，得到正确的克隆。
接下来，表达是指将基因在宿主细胞中转录和翻译成蛋白质的过程。
通常使用哺乳动物细胞作为表达宿主，如CHO细胞或HEK293细胞。
将重组的真核表达载体导入到宿主细胞中，通过细胞培养和优化培养条件，促使基因在细胞中进行表达。
随着基因的表达，抗体蛋白质会被合成和折叠成稳定的三维结构。
纯化是将表达的抗体蛋白质从细胞培养上清中提取和纯化的过程。
通常采用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等技术，根据抗体的特性和目的，选择合适的纯化方法。
通过这些纯化步骤，可以去除杂质和其他蛋白质，最终得到高纯度的抗体。
抗体人源化技术的主要原理是通过基因工程手段将小鼠源抗体改造成人源化抗体，使其在结构和功能上更接近人类抗体。
这样做的目的是为了减少抗体治疗中的免疫反应和排斥反应，提高抗体的治疗效果和安全性。
抗体人源化技术的发展为临床医学带来了革命性的突破，为疾病的治疗和诊断提供了更多选择和可能性。
总结起来，抗体人源化的主要原理包括人源化基因设计、基因克隆、表达和纯化等步骤。
抗体的人源化
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抗体导向酶-前药疗法 为了解决对恶性肿瘤化疗特异性差易对正常组织造 成破坏的问题而提出。 选用单抗导向原理，与前药专一性活化酶交联并选 择性地结合于肿瘤部位，使前药可区域特异性地在 肿瘤组织内转化为活性细胞毒分子，有效增加肿瘤 部位浓度降低正常组织中浓度。
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抗体治疗药物
目前的客观现实是：研究进展迅速，但未达到常规治疗的 应用阶段 障碍（原因）：抗体相对分子质量大，穿透力低，不能达 到靶部位或摄取量低。鼠源性抗体的排斥反应
一，放射性同位素标记的抗体治疗药物
二，抗癌药物偶联的抗体药物
三，毒素偶联的抗体药物
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抗体诊断试剂
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一、血清学鉴定用的抗体试剂
血清学鉴定是指用已知抗体来鉴定未知的抗原型， 主要用于疾病病原菌诊断和血型鉴定。包括： 鉴定病原菌的抗体试剂 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)的反向被动血 凝诊断试剂 妊娠诊断试剂
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一、放射性同位素标记的抗体治疗药物
优点：操作简便，用量少，能观察到药物在体内的 分布和药物动力学。放射性同位素标记抗体杀伤范 围较大，相对分子质量又小，更容易穿透到达肿瘤 部位。
缺点：有些同位素来源困难，需放射线保护和污物 处理。
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二、抗癌药物偶联的抗体药物
常用的抗癌药物：氨甲喋呤（methotrexate, MTX）、阿霉素(adriamycin,ADM) 丝裂霉素 (mitomycin, MMC)、环磷酰胺 (cyclophosphamide, CTX) 、新抑癌蛋白 (neocarzinostatin, NCS) 、正定霉素 (doxorubicin, DOX)等。
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鼠源抗体的人源化设计前言 (1)方法 (2)结果与讨论 (3)鼠源抗体筛选人源框架 (3)人源化抗体CDR的改造 (4)结论 (6)附录 (6)参考文献 (7)前言第一个人用抗体药物来自鼠源抗体，直到现在鼠源抗体仍然是抗体药物的一大来源[Pogson et al.,2016]。
由于鼠源抗体的免疫原性，一般会对其作人源化处理。
目前最通用的方法是将鼠抗的CDR序列移植到人源框架上[Hwang et al., 2005]。
通常CDR移植后的人源化抗体与抗原的亲和力会减弱，如何保持人源化抗体的亲和力是目前最大的技术瓶颈。
通过高通量的筛选方法可以得到适合CDR移植的人源框架，但是这种实验方法周期长，价格昂贵[Townsend et al.,2015]。
为了快速筛选出适合的人源框架，研究者利用序列比对和结构模拟的方法筛选出适合的人源框架，然后通过实验验证抗体与抗原的亲和力，减少了实验工作量，节约了成本和时间，未来会成为具有潜力的抗体人源化设计方法[Kurella et al., 2014;Choi et al.,2015;Choi et al.,2016]。
本文采用自主开发的抗体人源化设计程序，对已知的鼠源抗体进行人源化设计，结果表明计算的方法可以筛选出序列同源性靠后但是亲和力更高的人源化框架。
方法抗体阻断蛋白-蛋白相互作用的受体和配体结构已知（图1）。
配体与抗体结合的区域重叠在受体和配体结合的区域（图2），所以鼠源的抗体可以有效阻断受体和配体的相互作用[Apgar et al.,2016]。
通过鼠源抗体的人源化设计可以最大限度减少抗体的免疫原性。
首先使用鼠源抗体（PDBID为5F3B）的序列在人源框架库中搜索排名靠前的序列作为候选序列，然后将人源序列同源建模到鼠源抗体的骨架上，保留鼠源CDR的序列，然后计算同源模型的能量，判断人源化抗体的稳定性。
人源化CDR突变体采用相同的策略，不同之处在于替换鼠源CDR 序列为突变体序列，并且保留抗原的结构。
图1蛋白受体和配体复合体结构图1中，黄色为配体结构，紫色为受体结构片段（PDBID：1NYU）图2受体和配体以及抗体的复合体结构图2中，黄色为配体结构，紫色为受体结构片段，绿色和青色为鼠源抗体重链和轻链。
鼠源抗体的PDBID为5F3B。
结果与讨论鼠源抗体筛选人源框架使用鼠源抗体的序列在人的抗体框架库中筛选序列相似性靠前的框架，如图3所示，鼠的H链（5F3BH）可以找到相似性靠前的HM855688和AM940223两个框架，其中AM940223与实验使用的人源H链（5F3HH）完全一样。
鼠的L链（5F3BL）可以找到相似性靠前的5个框架，没有出现与实验完全一样的人源L链（5F3HL）。
实验并没有选择序列相似性排第一的人源框架（HM855688_X59318），而是排名靠后的人源框架（如图3所示，5F3HH_5F3HL与AM940223_X59318的相似性很高）。
以上结果表明，鼠源序列相似性最高的人源框架并不一定是最合理的。
由此可见，利用序列相似性筛选人源框架并不能保证成功。
合理的筛选标准应该能够表示抗体的稳定性，成药性等。
其中抗体的稳定性可以用能量来表示，能量越低越稳定。
如图3所示，AM940223_X59318的能量最低（能量取反），该人源框架最稳定（见附表1）。
所以，通过能量筛选出的人源框架与实验最接近。
图3人源化框架的序列相似性和能量图3中，横坐标表示与鼠抗H链序列相似性排前两位的人源框架，以及与鼠抗L链序列相似性排前5位的人源框架。
纵坐标表示序列相似性以及链内能量（能量取反，见附表1）。
其中5F3HH_5F3HL是实验使用的人源化框架，AM940223_X59318是计算筛选出的最稳定的人源化框架。
人源化抗体CDR的改造为了减小人源化抗体中CDR的免疫原性，研究者通过突变CDR来获得与人源CDR相似的序列。
这种突变虽然减少了鼠源CDR的免疫原性，但是同时也减小了抗体的与抗原的亲和力。
实验的方法可以实现高通量筛选亲和力强的人源化CDR 突变体，但是工作量大，成本高，时间长。
计算的方法已经被用于类似的研究，可以加速筛选到高亲和力并且低免疫原性的人源化抗体。
我们使用CDR构象模拟的方法，计算了不同CDR突变体的亲和力，结果表明计算得到的结合能与抗体抗原亲和力高度相关（如图4，5所示，数据见附表2）。
图4不同人CDR突变体的亲和力与计算的结合能相关性图4中，横坐标表示用Biacore方法测得不同CDR突变体与靶蛋白的亲和力，纵坐标表示以鼠源抗体（5F3B）为模板，计算得到的不同CDR突变体与靶蛋白的结合能。
图5不同人CDR突变体的亲和力与计算的结合能相关性图5中，横坐标表示用ELISA方法测得不同CDR突变体与靶蛋白的亲和力，纵坐标表示以鼠源抗体（5F3B）为模板，计算得到的不同CDR突变体与靶蛋白的结合能。
结论综上所述，我们提供了一种基于同源建模能量的抗体稳定性指标用于筛选鼠源抗体的人源化框架，以及基于抗体抗原结合能的亲和力判定方法。
计算的结果与实验高度相关。
附录附表1人源化框架与鼠抗的序列相似性以及计算的能量HM855688_V01576188.522181.494-1335.87-1170.72HM855688_Y14865188.522181.4436-1333.14-1162.41bHM855688_X63398188.522180.9864-1335.87-1156.875F3HH_5F3HL185.748185.4072-1339.78-1172.53AM940223_X59318185.748186.4776-1339.73-1180.94AM940223_M64855185.748186.4284-1339.78-1173.34AM940223_V01576185.748181.494-1339.78-1170.72附表2鼠抗及其人源化版本的亲和力以及计算的结合能Construct Biacore KDa)ELISA IC50a)BiacoreΔGb)ELISAΔGb)ΔEC)RK351.0/1.4 2.500.61-15.91-12.64-48.4 RK351.0/1.557.00 5.94-14.05-11.28-47.2 RK351.2/1.0N/A N/A-5.00-5.0059.76 RK351.3/1.0N/A N/A-6.00-6.0056.82 RK351.4/1.0284.00 1.71-13.10-12.03-41.2a)Apgar et al.Beyond CDR-grafting:Structure-guided humanization of framework and CDR regions of an anti-myostatin antibody.MAbs.2016,8(7):1302-1318.:DOI:10.1080/19420862.2016.1215786.b)ΔG=-RTln(1/KD),ΔG=-RTln(1/IC50)c)以5F3B为模板计算得到的结合能参考文献1.Apgar JR,Mader M,Agostinelli R,Benard S,Bialek P,Johnson M,Gao Y,Krebs M,Owens J,Parris K,Andre MS,Svenson K,Morris C,Tchistiakova L.Beyond CDR-grafting: Structure-guided humanization of framework and CDR regions of an anti-myostatin antibody.MAbs.2016,8(7):1302-1318.DOI:10.1080/19420862.2016.1215786.2.Pogson M.Parola C.,Kelton WJ.,Heuberger P.,Reddy ST.Immunogenomic engineering of aplug-and-(dis)play hybridoma mun.2016,7:12535doi:10.1038/ncomms12535.3.Hwang WYK.,Almagro JC.,Buss TN.,Tan P.,Foote e of human germline genes in a CDRhomology-based approach to antibody humanization.Methods.2005,36:35-424.Townsend et al.,Augmented Binary Substitution:Single-pass CDR germlining and stabilizationof therapeutic antibodies.PNAS.2015,112(50):15354–153595.Kurella VB.,Gali R.Structure guided homology model based design and engineering of mouseantibodies for humanization.Bioinformation.2014,10(4):180-186.6.Choi Y.,Hua C.,Sentman CL,Ackerman ME.,Bailey-Kellogg C.Antibody humanization bystructure-based computational protein design.mAbs.2015,7(6):1045-1057,DOI:10.1080/19420862.2015.10766007.Choi Y.,Ndong C.,Griswold KE.,Bailey-Kellogg putationally driven antibodyengineering enables simultaneous humanization and thermostabilization.Protein Engineering, Design&Selection.2016,29(10):419-426,doi:10.1093/protein/gzw024。