人源化抗体的制备策略
传染病病原体全人源化抗体的制备方法[发明专利]
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专利名称：传染病病原体全人源化抗体的制备方法专利类型：发明专利
发明人：李福胜
申请号：CN201210489839.7
申请日：20121127
公开号：CN103045607A
公开日：
20130417
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法。
该方法主要包括以下步骤：传染病病原体抗原的制备；传染病病原体抗体的荧光标记；传染病患者外周血B细胞的富集与纯化；标记的病原体抗原与抗原特异性B细胞的结合；流式细胞仪筛选抗原特异性的单个B细胞；单细胞RT-PCR 扩增抗体重链和轻链可变区基因；与重链和轻链恒定区连接构建人源抗体的真核表达载体；重组抗体在真核细胞中的高效表达与纯化。
本发明所制备的人源单克隆抗体既可以用于传染病的诊断，也可用于传染病的治疗。
申请人：李福胜
地址：456300 河南省安阳市文峰区彰德路紫竹花园12号楼1单元二楼西户
国籍：CN
代理机构：郑州大通专利商标代理有限公司
代理人：樊羿
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人源化单克隆抗体的构建技术
人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。
其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。
抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。
本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。
关键词：人源化,单克隆抗体,构建从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。
单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。
然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。
因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。
随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。
１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。
至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。
人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。
人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。
人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。
人源化抗体的制备策略
三、 完全人源化抗体
1. 抗体库技术 噬菌体抗体库技术的产生依赖于 3 项实验技术的发展: 一是 PCR 技术的发展使人们可以用一组引物 ( 免疫 球蛋白可变区中骨架部分的保守序列) , 通过 RT- PCR 直接从 B 淋巴细胞总RNA 克隆出全套免疫球蛋白可变 区基因, 从而使抗体库的构建简单易行; 二是噬菌体展示技术( 即将抗体通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在 噬菌体的表面, 进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体) 的建立, 实现了基因型和表型的统一, 提供 了 高效率的筛选系统, 这是噬菌体抗体库技术的核心; 三是从大肠杆菌分泌表达有结合功能的免疫球蛋白 分子片段。
二、 CDR 移植的人源化抗体
鼠源性抗体 V 区中的 FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化 抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。 为减少鼠源成分, 人们进一步用人的 FR 替代鼠 FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即 除 了 3 个 CDR 是 鼠 源 的 外 , 其 余 全部是人源结构, 又称 CDR 移植抗体( CDR- grafted antibody) 或改型抗体 ( reshaped antibody) 。
人源化抗体的制备策略有哪些
目录一、 嵌ຫໍສະໝຸດ 抗体 二、CDR 移植的人源化抗体
人源化单克隆抗体制备工艺
速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。
核糖体展示技术
1997 年Hanes 等在Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术的基础上 进行改进建立了核糖体展示技术。
基本ne,September 26, 2012
一、Molecular Modeling and Structural Analysis of D9 Fv
D9 VH and VL mRNA was extracted from D9 hybridoma cells, amplified by Reverse Transcription-PCR and then sequenced. The deduced amino acid sequences are shown here.
抗体药物市场销售额增势不减，世界各国纷纷投入巨资开发这座“金 矿”，全球医药巨头，如辉瑞、罗氏、诺华等更是不惜重金开发抗体 药物。国内方面，成都康弘的郎沐表现出色，2014年上市8个月实现销 售额1亿元，2015年销售额约3亿元。
在临床实践中，抗体药物也呈现愈发活跃的状态。美国詹森研究开发 有限责任公司副总裁威廉·R·斯特罗尔表示，过去十年间，多种抗体治 疗方法和新平台已被设计研发，未来抗体治疗的范围将进一步扩大。 “目前一些针对免疫肿瘤学的抗体已被研发，即将进入临床，为癌症 患者、免疫功能紊乱、代谢障碍等患者提供更多治疗方法。”
抗体的现状
从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年03月，欧美日 等主要市场共上市了61个抗体药物。2014年上市了6个抗体药物，2015 年上市了9个抗体药物，连续两年打破历史记录。2015年，61个抗体药 物合计销售额达到906亿美元，与2014年相比增长了8.2%。从销售数据 来看，前21位的抗体药物都超过了10亿美元。
抗体的人源化
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五、单域抗体和分子识别单位
（1）单域抗体:由VH(VL)单个可变区组成的，只有 抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特 异结合能力也强。
（2）分子识别单位（MRU）:是由单个CDR区构成的 小分子抗体，亲和力较低。
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多功能抗体及其制备
一、双功能抗体
二、多功能抗体 三、抗体融合蛋白
抗体的人源化
基因工程抗体
基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为 平台，制备的生物药物总称。 由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对 人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从 而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因 此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备 抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。
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Ig分子的结构模式图
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原理： 抗体同抗原结合的功能：决定于抗体分子的可变区 （V） 同种性免疫源性：决定于抗体分子的稳定区（C）。
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一、人—鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
在基因水平上将鼠源单 克隆抗体可变区和人抗 体恒定区连接起来并在 合适的宿主细胞中表达， 这种抗体称为人－鼠嵌 合抗体
Fv
ScFvPage Fra bibliotek1515
三、Fab和Fv抗体
（1）Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用 下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗 原的活性。
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（2）Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中 改成人源的，就成为了镶面抗体
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是一种生物技术手段，用于将动物源性抗体转化为人源性抗体，以提高其在临床应用中的效果和安全性。
这一技术的主要原理是通过基因工程方法将动物免疫系统中产生抗体的基因导入到人体细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的人源性抗体。
抗体是人体免疫系统中的重要组成部分，其能够识别并结合到入侵体内的病原体或异常细胞，从而触发免疫反应，清除这些病原体或异常细胞。
然而，由于动物源性抗体与人体内抗原的差异，使用动物源性抗体在临床应用中存在一些问题，如免疫原性反应、抗体产量低、抗体结构与功能的不稳定等。
为克服这些问题，科学家们开展了抗体人源化的研究。
首先，需要从动物中提取抗体基因，通常是通过免疫动物模型来获得。
然后，利用基因克隆技术将这些抗体基因导入到人源细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的抗体。
这一过程主要包括以下几个步骤：1. 抗体基因的选择和克隆：从动物的淋巴细胞中提取抗体基因，通常是通过PCR技术扩增目标基因。
然后，将扩增的基因序列进行纯化和克隆，得到抗体基因的克隆片段。
2. 基因导入和表达：将抗体基因导入到人源细胞中，通常是通过转染等技术实现。
导入后，细胞会利用其自身的机制进行基因的表达和蛋白质的合成，从而产生人源性抗体。
3. 抗体的筛选和优化：通过筛选和优化的方法，从转染的细胞中筛选出产生目标抗体的细胞株。
同时，可以通过基因工程方法对抗体的结构和功能进行优化，以提高抗体的亲和力和稳定性。
4. 抗体的大规模生产：一旦获得了产生目标抗体的细胞株，就可以进行大规模的抗体生产。
通常采用的方法是利用细胞培养技术，将产生目标抗体的细胞株培养在培养基中，通过细胞的分裂和增殖，大量产生目标抗体。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程方法将动物免疫系统中产生抗体的基因导入到人体细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的人源性抗体。
这一技术的应用广泛，不仅可以用于治疗各种疾病，如肿瘤、感染性疾病等，还可以用于研究和诊断。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是一种重要的生物技术，它可以将动物源性抗体转化为人源性抗体，从而提高抗体的稳定性和效力。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组，从而得到具有人源性的抗体。
抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质分子，它们在人体的免疫系统中起着重要的作用。
传统上，抗体是从动物体内提取的，如小鼠、兔子等。
然而，这些动物源性抗体在临床应用中存在一些问题，如免疫原性反应、免疫复合物形成等。
因此，研究人员开始探索将动物源性抗体转化为人源性抗体的方法。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组，从而得到具有人源性的抗体。
具体来说，抗体人源化的过程包括以下几个步骤：1. 克隆动物源性抗体的基因序列。
这一步骤通常通过PCR技术从动物体内提取的抗体细胞中扩增出抗体基因序列。
2. 选择人源性抗体的框架区域。
人源性抗体的框架区域是指抗体分子中不参与抗原结合的区域，它们具有较高的稳定性和低的免疫原性。
因此，选择人源性抗体的框架区域可以提高抗体的稳定性和降低免疫原性。
3. 将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组。
这一步骤通常通过PCR技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行连接，从而得到具有人源性的抗体。
4. 通过表达和纯化技术得到抗体。
将重组后的抗体基因序列导入表达系统中，通过表达和纯化技术得到具有人源性的抗体。
抗体人源化的主要优点是可以提高抗体的稳定性和效力，降低免疫原性反应和免疫复合物形成等问题。
此外，抗体人源化还可以减少动物实验的使用，从而降低动物伦理问题和成本。
总之，抗体人源化是一种重要的生物技术，它可以将动物源性抗体转化为具有人源性的抗体，从而提高抗体的稳定性和效力。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组。
随着生物技术的不断发展，抗体人源化技术将在临床应用中发挥越来越重要的作用。
全人源化单抗(Fully Human Monoclonal Antibody)
全人源化单抗（Fully Human Monoclonal Antibody）人源化 mAb 基本上解决了鼠抗体的最重要问题——免疫原性，但是人源化过程仍很繁复且费用昂贵，它需要广泛的计算机模型设计，即使如此，大量反复试验仍不可避免，因为要试验各种氨基酸置换以测定对目标选择性和结合亲和力的有害作用。
而全人源化单克隆抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体完全人源化的目的。
目前生产完全人源化抗体的方法主要包括抗体库技术和人源性抗体转基因小鼠技术两种。
抗体库技术抗体库技术包括噬菌体抗体库技术和核糖体展示技术。
噬菌体抗体库技术：是利用噬菌体表达外源基因的一项新技术，是将抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因与噬菌体的外壳蛋白Ⅲ（PⅢ）或外壳蛋白Ⅷ（PⅧ）基因随机重组，继而感染大肠杆菌，后经增殖并在噬菌体表面以抗体片段 Fab 或单链抗体可变区（ScFv）一外壳蛋白的融合蛋白形式表达。
这种噬菌体颗粒可以特异识别抗原，又能感染宿主菌进行再扩增，经过“吸附一洗脱一扩增”过程，就能筛选并富集特异性抗体。
所构建的抗体库称为全套抗体库，从中筛选到的抗体称为噬菌体抗体。
其最大特点是实现了直接将基因型和表型联系在一起，可以快速而高效地从大量克隆中筛选出表达特异性的抗体核糖体展示技术：将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的 DNA 在体外进行转录与翻译，由于对 DNA 进行了特殊的加工与修饰，如去掉3′ 末端终止密码子，核糖体翻译到 mRNA 末端时，由于缺乏终止密码子，停留在 mRNA 的3′末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA 三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在 ELISA 微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的 mRNA 进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR 产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。
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鼠源性抗体 V 区中的 FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化 抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。 为减少鼠源成分, 人们进一步用人的 FR 替代鼠 FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即 除 了 3 个 CDR 是 鼠 源 的 外 , 其 余 全部是人源结构, 又称 CDR 移植抗体( CDR- grafted antibody) 或改型抗体 ( reshaped antibody) 。
人源化抗体的制备策略有哪些
目录
一、 嵌合抗体 二、CDR 移植的人源化抗体
三、完全人源化抗体
1. 抗体库技术 2. 转基因小鼠技术
一、 嵌合抗体
应用 DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组, 再将重 组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物, 选用适当 的抗生素或制剂进行筛选, 再用与传统技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的 细胞株。
谢 谢 T
H A N K
Y O U
三、 抗体库技术的产生依赖于 3 项实验技术的发展: 一是 PCR 技术的发展使人们可以用一组引物 ( 免疫 球蛋白可变区中骨架部分的保守序列) , 通过 RT- PCR 直接从 B 淋巴细胞总RNA 克隆出全套免疫球蛋白可变 区基因, 从而使抗体库的构建简单易行; 二是噬菌体展示技术( 即将抗体通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在 噬菌体的表面, 进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体) 的建立, 实现了基因型和表型的统一, 提供 了 高效率的筛选系统, 这是噬菌体抗体库技术的核心; 三是从大肠杆菌分泌表达有结合功能的免疫球蛋白 分子片段。
2 转基因小鼠技术
通过基因敲除技术使小鼠自身的基因失活并导入新基因, 创造出携带人体抗体重、轻链基因 簇 ,而 自 身 抗 体 基 因 失 活 的 转 基 因 小 鼠 。 这 种 转 人 抗 体 基 因 小 鼠( human antibody mouse, HuMab) 所携带的人 DNA 片段具 有 完备的功能, 可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟。
转基因小鼠制备的人抗体, 其功效优于其他技术生产的抗正常人体蛋白单抗。 小鼠识别抗 原和动员抗原的抗体系统仍保持完整, 容易把人体蛋白识别为异物。 此外, 由于抗体是体内 产生的, 经历了正常装配和成熟过程, 从而保证成品具有较高的靶结合亲和力。 但转基因小 鼠也存在一些缺陷, 即转基因通常有体细胞突变和其他独特的序列, 导致不完整的人序列; 而 且, 由 于抗体是在小鼠体内装配, 因而产生的单抗具有鼠糖基化的模式,所以这些单抗最终并 不是全人源化的。
噬菌体抗体库将基因型和表型统一于一体, 将选择能力与扩增能力偶联起来, 具有强大的筛选功能, 能 够在体外模拟体内的抗体生成过程, 使抗体工程技术进入了一个新的时代。 噬菌体抗体库技术的发展 使体外不经过免疫获得抗体成为可能。 由于它发生于体外, 因此不依赖体内抗原识别和提呈系统, 在理 论上可以产生抗任何物质的抗体。目前噬菌体抗体库技术也存在不足之处, 如从未经免疫动物的抗体 库获得的抗体亲和力不高、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容不足以涵盖一些动物的抗体多样 性等。 因此, 大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键。