抗体的人源化
什么是抗体人源化
什么是抗体人源化目前，用细胞工程制备人单抗在技术上和伦理上都存在一些难题，治疗性抗体的开发就集中在具有治疗前景的鼠源单抗上。
但是鼠源单抗对人体具有异源性反应，可诱发人抗鼠抗体效应（Human anti-mouse antibodies, HAMA反应），使得单抗的治疗效果明显滞后。
随着基因重组技术的发展和人们对抗体结构认识的深入，研究者们尝试对鼠源性抗体进行改造，致力于在保留与抗原结合的高亲和力的基础上，减少异源性抗体的免疫原性，推动抗体人源化研发的进程。
人源化抗体主要指以用基因克隆及DNA重组技术对鼠源单克隆抗体改造，重新表达产生的抗体。
其大部分氨基酸序列被人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。
嵌合抗体和CDR移植抗体根据人源化程度不同，单抗又可分为嵌合抗体（60%-70%人源化氨基酸序列）和CDR(complementarity-determining region)移植抗体（90%-95%人源化氨基酸序列）。
1、人-鼠嵌合抗体人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）：第一代人源化抗体。
其是在基因水平上将鼠源单克隆抗体的V区和人抗体的C区(variable region, 可变区)连接，在合适的宿主细胞内表达可得到人-鼠嵌合抗体。
嵌合抗体用于人体所产生的HAMA反应比鼠源单抗明显减弱；另外，人源C区(constant region，恒定区)可更有效地介导人体一些免疫反应，如CDC（complement-dependent cytotoxicity, CDC, 依赖补体的细胞毒性作用），ADCC（antibody dependent cell mediated cytotoxicity, 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）。
2、CDR移植抗体嵌合抗体虽然可以部分解决异种蛋白的排斥问题，但由于其还含有鼠源V区，依然有可能会诱发HAMA反应，干扰抗体疗效，诱发超敏反应，在临床上其应用会受到一定限制。
人源化抗体
人源化抗体人源化抗体主要指鼠源单克隆抗体通过基因克隆及DNA重组技术等进行改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，同时又降低了其异源性，有利应用于人体。
然而，即使通过嵌合抗体技术把C区替换，人源化抗体V区的互补决定区（CDR）和框架区（FR）也仍有可能诱导相当强的抗体反应。
因此，研究者开始着手将部分CDR和FR区也改造为人抗体序列，以便能进一步提高抗体的人源化程度，降低药物抗体反应发生的可能。
经过数年的研究和改进，人们已经创建并完善了以重构抗体、表面重塑抗体、去免疫化抗体和链替换抗体等为代表的多种人源化抗体技术。
人源化抗体技术重构抗体重构抗体是由异源抗体中和抗原结合相关的残基与人抗体重新剪接构建的抗体，包括互补决定区移植、部分互补决定区移植和特定决定区转移。
构建重构抗体的流程：①克隆分析亲本鼠单抗的V区基因，确定CDR和FR区；②通过数据库检索比对及辅助计算机分子模拟等，找出有最大同源性的人FR 区模板；③确定需要保留和改变的关键残基，经基因合成、真核表达、检测实际结合效果后，对需要保留和改变的关键残基进行相应的修正；④最终获得高亲和力的、具有与亲本鼠单抗相同抗原结合表位的人源化抗体。
表面重塑抗体表面重塑抗体是通过对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造而获得的人源化抗体。
表面重塑抗体的库构建流程：①首先在结构数据库中寻找鼠源的最大同源性蛋白，利用相应的软件并采用分子三维结构分析的方式确定表面残基的位置；②在公用数据库中寻找最大同源性的人抗体序列，在相应的表面残基位置上尝试替换为相应的人抗体残基（替换中要兼顾考虑被替换残基的侧链匹配情况和与CDR是否在空间上紧邻）；③确定替换后的残基种类，即可采用定点突变或基因合成等方法获得人源化后的表面重塑抗体V区基因；④克隆入相应的表达载体进行表达，并分析改造后的抗原结合情况。
去免疫化抗体去免疫化抗体的构建与前面介绍的其他人源化抗体技术类似，其技术流程主要分为以下5个步骤：①建立亲本鼠单抗的三位结构分子模型，通常需要在最大同源性已知三维结构抗体的三维结构模型的引导下，由相应的计算机软件完成；②利用相关的公用数据库，来寻找鼠单抗序列可能的人T细胞识别表位，也允许同时通过体外试验来确定可能的人T细胞识别表位；③通过以人胚系VH和VL基因为模板并与之比对，结合已有的不破坏原抗体结构和抗原结合位点的人源化抗体改造规律，确定需要被替换的残基；④通过分子模拟检验这些被替换的残基；⑤表达改造后的抗体，并检验改造的效果。
抗体的人源化课件
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双特异性抗体和双功能抗体
双特异性抗体和双功能抗体将一种抗体分 子与另一种抗体分子或功能分子如毒素、酶、 细胞因子、放射毒素等结合形成， 具有特异 性高，针对性强，用量少，副作用小的优点， 在肿瘤临床治疗中有着重要的意义。
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重组Fab成功案例
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小分子抗体的优点：
1. 制备方法较其他基因工程抗体简单。 2.免疫原性要比原来的McAb弱得多。如果将改形抗体构
建成小分子抗体，更有可能消除其免疫原性。 3.由于分子量小，小分子抗体更容易通过血管壁，穿
透实体瘤，有利于肿瘤的治疗。 4.由于没有Fc段，不能与非靶细胞的Fc受体结合，更能
通过噬菌体呈现技术(phage display)产 生亲和力和特异性更强的ScFv。
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ห้องสมุดไป่ตู้
3. 重组单链ScFv抗体的应用
由于ScFv分子量小，免疫原性小，且易穿透 致密的肿瘤屏障，进入实体瘤周围的微循环，缺 乏Fc片段，去除Fc介导的受体结合，使得其 快 速地向肿瘤集中，因此通过与毒素基因重组，抗 体将毒素定位于靶细胞，对靶细胞进行特异 杀 伤。
一 . 概念
将小鼠抗体分子的互补决定区序列移植 到人抗体可变区框架中而制成的抗体。
此抗体可明显降低由鼠源单克隆抗体所 致的人抗鼠抗体反应。
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人源化抗体类型
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人－鼠嵌合抗体
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人－鼠嵌合抗体
1．恒定区人源化--鼠/人嵌合抗体制备原理：
使从分泌某mAb的杂交瘤细胞基因组中分离和鉴别 出重排的功能性可变区（V区）基因，经基因重组与Ig 恒定区基因相拼接，插入到适宜的表达载体中，构成 鼠/人嵌合的轻重链基因表达质粒，经转染骨髓瘤细胞， 通过筛选即可制备出鼠/人嵌合抗体。
抗体人源化思路
重组抗IL-1R人源化抗体制备思路：
1.制备生产高亲和力的抗IL-1R鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞株；→
2.杂交瘤细胞总RNA提取，用RT-PCR 技术克隆鼠源单抗可变区基因；→
3.IL-1R鼠源单克隆抗体可变区氨基酸序列的分析；→
4.IL-1R鼠源单克隆抗体相应可变区片段（Fv）的模型构建；→
5.人抗体接纳体构架氨基酸序列的分析和选择；→
6.人源化抗体的设计和实际构建；
（设计、构建策略：
①模板替换，使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR；
②表面重塑，对鼠CDR和FR表面残基进行镶饰或重塑，使类似于人抗体CDR
的轮廓或人FR的型式；
③补偿变换，对起关键作用的残基进行改变，以补偿完全的CDR移植；
④定位保留，人源化单抗以人FR保守序列为模板，但保留了鼠源单抗可变
区中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR和FR中的一些关键残基；）→
7.将构建的抗体重轻链基因电转化到CHO细胞中，制备获得抗IL-1R重组抗体；
8.通过体外和/或体内测定方式证实制备抗体具有高亲和力及高特异性；
9.获得产生抗IL-1R人源化抗体的单克隆细胞株。
抗体人源化是什么？
抗体人源化是什么？
抗体人源化，是重组抗体（单克隆抗体）生产制备实验研究的重要组成部分。
所谓抗体人源化，为从鼠源性抗体往人源性抗体发展的过程。
百余年前，抗体与抗原特异性结合、抗体被动免疫特性等原理的揭示，开辟了疾病诊断的新途径。
而1975年单克隆抗体技术的问世，加快了这一方法的广泛应用。
初期，临床上使用的单抗多数为鼠源性单抗，由于人和小鼠的种属特异性，鼠源性抗体的使用存在种种限制。
鼠抗体虽然对靶抗原是特异的，可以与靶抗原特异性结合，但它不能激活相应的人体效应系统，如抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)等，从而无法正常的发生抗原-抗体反应；此外，鼠抗体作为外源蛋白进入人体，会使人体免疫系统产生应答，产生以鼠抗体作为抗原的特异性抗体，即产生人抗鼠抗体(human anti．mouse antibody，HAMA)，通常异源蛋白在人体内会很快得到清除，半衰期很短。
由于鼠源性抗体在临床应用上存在种种限制，人们利用重组DNA技术对鼠源抗体进行人源化改造，使抗体人源化。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是指将动物来源的抗体（如小鼠抗体）转化为人源化的抗体，以增强其在人体内的稳定性和效力。
这一技术的研发和应用，为人类在治疗疾病方面带来了革命性的变革。
本文将介绍抗体人源化的主要原理，从基因工程的角度解释其实现方法。
抗体人源化的主要原理基于两个关键概念：可变区和框架区。
可变区决定了抗体的特异性，而框架区则决定了抗体的稳定性和结构。
在动物来源的抗体中，可变区和框架区通常相互关联，难以分离。
为了实现抗体人源化，需要对这两个区域进行调整和优化。
人源化抗体的设计通常涉及到克隆和表达人类免疫球蛋白基因。
其中，免疫球蛋白基因是一种编码抗体的基因，包括了可变区和框架区。
通过克隆和表达人类免疫球蛋白基因，可以获得人类免疫球蛋白。
为了使人源化抗体具有与动物来源抗体相似的特异性和效力，需要将动物来源抗体的可变区与人类免疫球蛋白基因的框架区进行重组。
这一步骤需要利用基因工程技术，将动物来源抗体的可变区和人类免疫球蛋白基因的框架区进行融合。
通过这种方式，可以将动物来源抗体的特异性与人类免疫球蛋白的结构相结合，实现抗体人源化。
在抗体人源化的过程中，还需要考虑到抗体的亲和力和稳定性。
亲和力是指抗体与靶标结合的紧密程度，而稳定性则是指抗体在人体内的耐受性和长期效果。
为了增强抗体的亲和力和稳定性，可以通过点突变和序列优化的方法进行改良。
点突变是指通过人工改变抗体分子中的一个或多个氨基酸残基，以增强其与靶标的结合能力。
序列优化则是指通过人工改变抗体分子的氨基酸序列，以增强其稳定性和生物活性。
抗体人源化的主要原理可以总结为：克隆和表达人类免疫球蛋白基因，重组动物来源抗体的可变区和人类免疫球蛋白基因的框架区，通过点突变和序列优化的方法进行改良，以获得具有高亲和力和稳定性的人源化抗体。
抗体人源化技术的发展和应用，为药物研发和临床治疗提供了新的途径。
相比于动物来源的抗体，人源化抗体在人体内的稳定性和效力更高，副作用更少。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是一种生物技术手段，用于将动物源性抗体转化为人源性抗体，以提高其在临床应用中的效果和安全性。
这一技术的主要原理是通过基因工程方法将动物免疫系统中产生抗体的基因导入到人体细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的人源性抗体。
抗体是人体免疫系统中的重要组成部分，其能够识别并结合到入侵体内的病原体或异常细胞，从而触发免疫反应，清除这些病原体或异常细胞。
然而，由于动物源性抗体与人体内抗原的差异，使用动物源性抗体在临床应用中存在一些问题，如免疫原性反应、抗体产量低、抗体结构与功能的不稳定等。
为克服这些问题，科学家们开展了抗体人源化的研究。
首先，需要从动物中提取抗体基因，通常是通过免疫动物模型来获得。
然后，利用基因克隆技术将这些抗体基因导入到人源细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的抗体。
这一过程主要包括以下几个步骤：1. 抗体基因的选择和克隆：从动物的淋巴细胞中提取抗体基因，通常是通过PCR技术扩增目标基因。
然后，将扩增的基因序列进行纯化和克隆，得到抗体基因的克隆片段。
2. 基因导入和表达：将抗体基因导入到人源细胞中，通常是通过转染等技术实现。
导入后，细胞会利用其自身的机制进行基因的表达和蛋白质的合成，从而产生人源性抗体。
3. 抗体的筛选和优化：通过筛选和优化的方法，从转染的细胞中筛选出产生目标抗体的细胞株。
同时，可以通过基因工程方法对抗体的结构和功能进行优化，以提高抗体的亲和力和稳定性。
4. 抗体的大规模生产：一旦获得了产生目标抗体的细胞株，就可以进行大规模的抗体生产。
通常采用的方法是利用细胞培养技术，将产生目标抗体的细胞株培养在培养基中，通过细胞的分裂和增殖，大量产生目标抗体。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程方法将动物免疫系统中产生抗体的基因导入到人体细胞中，使其能够产生与动物源性抗体具有相同抗原特异性的人源性抗体。
这一技术的应用广泛，不仅可以用于治疗各种疾病，如肿瘤、感染性疾病等，还可以用于研究和诊断。
抗体人源化的主要原理
抗体人源化的主要原理抗体人源化是一种重要的生物技术，它可以将动物源性抗体转化为人源性抗体，从而提高抗体的稳定性和效力。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组，从而得到具有人源性的抗体。
抗体是一种能够识别和结合特定抗原的蛋白质分子，它们在人体的免疫系统中起着重要的作用。
传统上，抗体是从动物体内提取的，如小鼠、兔子等。
然而，这些动物源性抗体在临床应用中存在一些问题，如免疫原性反应、免疫复合物形成等。
因此，研究人员开始探索将动物源性抗体转化为人源性抗体的方法。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组，从而得到具有人源性的抗体。
具体来说，抗体人源化的过程包括以下几个步骤：1. 克隆动物源性抗体的基因序列。
这一步骤通常通过PCR技术从动物体内提取的抗体细胞中扩增出抗体基因序列。
2. 选择人源性抗体的框架区域。
人源性抗体的框架区域是指抗体分子中不参与抗原结合的区域，它们具有较高的稳定性和低的免疫原性。
因此，选择人源性抗体的框架区域可以提高抗体的稳定性和降低免疫原性。
3. 将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组。
这一步骤通常通过PCR技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行连接，从而得到具有人源性的抗体。
4. 通过表达和纯化技术得到抗体。
将重组后的抗体基因序列导入表达系统中，通过表达和纯化技术得到具有人源性的抗体。
抗体人源化的主要优点是可以提高抗体的稳定性和效力，降低免疫原性反应和免疫复合物形成等问题。
此外，抗体人源化还可以减少动物实验的使用，从而降低动物伦理问题和成本。
总之，抗体人源化是一种重要的生物技术，它可以将动物源性抗体转化为具有人源性的抗体，从而提高抗体的稳定性和效力。
抗体人源化的主要原理是通过基因工程技术将动物源性抗体的变异区域与人源性抗体的框架区域进行重组。
随着生物技术的不断发展，抗体人源化技术将在临床应用中发挥越来越重要的作用。
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五、单域抗体和分子识别单位
（1）单域抗体:由VH(VL)单个可变区组成的，只有 抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特 异结合能力也强。
（2）分子识别单位（MRU）:是由单个CDR区构成的 小分子抗体，亲和力较低。
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多功能抗体及其制备
一、双功能抗体
二、多功能抗体 三、抗体融合蛋白
抗体的人源化
基因工程抗体
基因工程抗体是以基因工程技术等高新生物技术为 平台，制备的生物药物总称。 由于目前制备的抗体均为鼠源性，临床应用时，对 人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从 而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生，因 此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备 抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。
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Ig分子的结构模式图
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原理： 抗体同抗原结合的功能：决定于抗体分子的可变区 （V） 同种性免疫源性：决定于抗体分子的稳定区（C）。
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一、人—鼠嵌合抗体（chimeric antibody）
在基因水平上将鼠源单 克隆抗体可变区和人抗 体恒定区连接起来并在 合适的宿主细胞中表达， 这种抗体称为人－鼠嵌 合抗体
Fv
ScFvPage Fra bibliotek1515
三、Fab和Fv抗体
（1）Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用 下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗 原的活性。
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（2）Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
将鼠单抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基中 改成人源的，就成为了镶面抗体
3. 表位印迹选择
表位印迹选择是一种与高效筛选噬菌体抗体库技术 相结合的人源化抗体的方法，可以通过数轮筛选得 到完全人源的抗体
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小分子抗体
小分子抗体是完整免疫球蛋白的一部分，分子量比 较小。 小分子抗体包括 Fab 、 Fv 或 ScFv 、单域抗体及最小 识别单位等几种。
Fv
ScFv
连接肽
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四、单链抗体（single chain antibody SCA 或single chain FV,SCFV）
单链抗体：具有有分子量小、穿透力强、免疫原性 小特点，可与效应分子相连接构建新功能的抗体分 子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。
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其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白 而酶-抗体型融合蛋白（即抗体酶，abeneyme）在 药物治疗中应用前景广阔。它可在靶向位置上将前 体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害， 此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。抗体和酶的 融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药物，提高 了肿瘤区域药物的浓度，降低了对正常细胞的毒性。
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小分子抗体有很多优点:
可以用细菌发酵生产，成本低;
分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒 素或酶标抗体等。
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Fab
单区抗体
最小识别单位
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一、双功能抗体
双功能抗体就是双特异性抗体（biospecific antibody，bisFvs） 一种非天然性的抗体，其结合抗原的两个臂具有不 同的特异性。具有与两种抗原位点结合的能力。
VLA-linker-VHB
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应用：
（1）治疗作用：
一条链针对抗原，一条针对免疫球蛋白，可与Ig 结合，恢复抗体的全部功能。 （2）免疫诊断：
例：全血凝集试剂
免疫阻断抗体、细胞免疫组化抗体
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二、多功能抗体
在单链抗体（ScFv）基础上发展了结合性能良好的 多聚体：二聚体、三聚体和四聚体等。 优点： 克服了ScFv在体内清除过快的不足 高亲和性能，可同时与细胞膜上相邻的两个或多个 靶抗原结合
将 鼠 单 抗 的 CDR 区 移 植 到人单抗的骨架区，就 可能使人单抗获得同鼠 一样的抗体特异性，并 可以最大限度地降低鼠 单抗的异源性，这样就 得到了改行抗体。这种 改 造 过 的 抗 体 也 称 CDR 移植抗体
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鼠单抗可变区人源化抗体
1. 改形抗体
2. 表面氨基酸残基的人源化――镶面抗体
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抗体工程
抗体研究进展的三个阶段：
1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，特点：用 抗原免疫动物来获得多克隆抗体
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三、抗体融合蛋白
抗体融合蛋白：从广义讲应属于双功能抗体范畴 （1）配基—配基型融合蛋白，如 CD4-Fcγ. （2）配基—Ig型嵌合抗体，如 IL-2-Ig （3）配基—FV型嵌合蛋白，如 CD4-FVCD3 (4) 受体—FV型融合蛋白
（5）酶—抗体型融合蛋白（abeneyme,抗体酶）
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鼠源性单克隆抗体
优点：鼠单抗对人而言有较强得免疫原性，可以产 生较强的人抗鼠抗体（HAMA）反应
缺点：生产成本比较高，难以大规模普及应用
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改造鼠源性单克隆抗体的目的：
一是降低免疫原性 二是降低相对分子量，增加组织通透性
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基因工程抗体优点
降低抗体的免疫原性。通过基因工程改造技术，可 以最大程度地降低抗体的鼠源性，降低甚至是消除 人体对抗体的排斥反应 穿透力强。基因工程抗体分子一般比较小，更容 易到达病灶的核心部位 可以根据需要，制备多用途的新型抗体 成本降低。可采用原核细胞、低等真核细胞和植 物等多种系统表达
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构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区 基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表 达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记 等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、 CHO细胞)构中表达。
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二、改形抗体(Reshaping antibody)