PCR反应体系与反应条件
PCR反应需要的条件
PCR反应需要的条件PCR（聚合酶链反应）是一种基因分析技术，可以在短时间内扩增DNA片段。
PCR 反应需要以下条件来成功进行：1. 反应液的准备•DNA模板：PCR反应需要一个DNA模板，其包含了要扩增的目标片段。
•引物：引物是设计用于扩增DNA片段的短DNA序列。
PCR反应通常需要两个引物，它们定位于目标DNA片段的两端。
•DNA聚合酶：PCR反应需要一种DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。
DNA聚合酶能够识别引物，并在其基础上合成新的DNA链。
•反应缓冲液：反应缓冲液提供了适合PCR反应的环境条件，包括适宜的pH值和离子浓度。
2. 温度控制PCR反应需要通过不同的温度来实现扩增的不同步骤：•Denaturation（变性）：将PCR反应混合液加热至94-98℃，使DNA双链解离成两条单链。
•Annealing（退火）：将反应温度降至45-70℃，使引物与目标DNA序列互相结合。
•Extension（延伸）：将反应温度升至72℃，DNA聚合酶在此温度下能够合成新的DNA链。
这个温度循环通常会重复多次，以实现DNA的指数级扩增。
3. 去污剂PCR反应需要一个无污染的环境。
在实验过程中，使用去污剂来处理实验用具、工作台和实验室空气，以减少DNA污染的可能性。
4. 优化条件PCR反应的成功与否还取决于一系列参数的优化，包括： - 引物的浓度：引物的浓度会影响到PCR的特异性和产物产量。
- 温度梯度试验：通过在一定范围内尝试不同的温度，可以确定最适合PCR反应的温度。
- 反应时间：PCR反应的时间需要根据所扩增的DNA片段的长度和目标浓度来确定。
综上所述，PCR反应需要适当的反应液、准确的温度控制、无污染的实验环境，以及对实验条件的优化。
只有在这些条件的合理控制下，才能成功地进行PCR反应，并扩增所需的DNA片段。
pcr熔解的反应条件
pcr熔解的反应条件英文回答：PCR (polymerase chain reaction) is a widely used technique in molecular biology for amplifying specific DNA sequences. The reaction conditions for PCR melting, also known as denaturation, are crucial for the success of the reaction.The denaturation step of PCR typically requires high temperatures to separate the DNA strands. The optimal temperature for denaturation is around 94-98°C. This high temperature breaks the hydrogen bonds between the DNA strands, causing them to separate into single strands.The denaturation step is usually carried out for a short period of time, typically 15-30 seconds. This ensures that the DNA strands are fully denatured without causing excessive damage to the DNA template.During the denaturation step, it is important to maintain a consistent and uniform temperature throughout the reaction. This can be achieved by using a thermal cycler, which is a specialized instrument that can rapidly heat and cool the reaction mixture.After denaturation, the reaction temperature is lowered for the annealing step. During annealing, the reaction mixture is cooled to a temperature that allows the primers to bind to the single-stranded DNA template. The annealing temperature is typically around 50-65°C, depending on the melting temperature of the primers.Once the primers have annealed to the template, the temperature is raised again for the extension step. During extension, the DNA polymerase synthesizes new DNA strands using the primers as a starting point. The extension temperature is usually around 68-72°C, which is the optimal temperature for most DNA polymerases.The extension step is typically carried out for a longer period of time, usually 1-2 minutes per kilobase ofDNA being amplified. This allows the DNA polymerase to synthesize enough new DNA strands to generate a significant amount of PCR product.Overall, the reaction conditions for PCR melting involve high temperatures for denaturation, followed by lower temperatures for annealing and extension. These temperature changes are essential for the successful amplification of DNA sequences.中文回答：PCR（聚合酶链反应）是分子生物学中广泛使用的一种技术，用于扩增特定的DNA序列。
PCR的反应体系主要包括哪些
PCR的反应体系主要包括哪些PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学和遗传学研究中广泛应用的技术。
它是通过扩增DNA片段的方法，使得微量的DNA能够在体外得到大量复制。
PCR的反应体系主要包括以下几个关键组分：引物、DNA模板、聚合酶、缓冲溶液和dNTP。
引物PCR反应需要两种引物，称为前向引物和反向引物。
它们是用来定位要扩增的DNA 区域的短链RNA或DNA片段。
引物的设计是PCR反应中非常关键的一步，需要根据DNA序列的特点来选择适当的引物。
合理的引物设计可以提高扩增效率和特异性。
DNA模板PCR反应的DNA模板通常是从细胞或组织中提取出来的DNA。
模板可以是基因组DNA、cDNA或已知序列的DNA片段。
PCR通过基本的核酸配对准则，利用引物将所需的DNA片段扩增出来。
聚合酶PCR反应中所使用的聚合酶是一种特殊的酶，称为DNA聚合酶。
常用的DNA聚合酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。
聚合酶能够识别DNA模板上的引物结合位点，并在这个基础上合成新的DNA链。
它具有高度稳定的酶活性和较高的耐热性，使得PCR反应可以在高温条件下进行。
缓冲溶液缓冲溶液是PCR反应中的重要组分之一，它提供了适当的pH值和离子平衡条件，使反应能够在适宜的环境中进行。
缓冲溶液通常含有Tris-HCl、KCl等成分，以维持反应的稳定性和效率。
dNTPPCR反应需要四种脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs）作为合成新DNA链的原料。
这四种成分分别是脱氧腺嘌呤核苷酸（dATP）、脱氧鸟嘌呤核苷酸（dGTP）、脱氧胸腺嘧啶核苷酸（dTTP）和脱氧胞嘧啶核苷酸（dCTP）。
它们提供了构建新DNA链所需要的碱基。
反应条件PCR反应还需要适当的温度条件下进行。
常见的PCR反应温度是95°C的高温变性步骤、50-60°C的引物结合步骤和72°C的DNA链合成步骤。
这些温度可以使PCR反应能够在合理的时间内完成扩增。
PCR反应体系与反应条件
dNTP 、模板PCR 反应体系与反应条件标准的PCR 反应体系:10 X 扩增缓冲液4种dNTP 混合物引物 模板DNATaq DNA 聚合酶Mg2+加双或三蒸水至 10ul各 200umol/L 各 10? lOOpmol 0.1 ? 2ug2.5u1.5mmol/L 100ulPCR 反应五要素： 参加PCR 反应的物质主要有五种即引物、酶、和 Mg2+ 引物：弓I 物是PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA 互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互 补的 寡核苷酸链做引物，利用PCR 就可将模板DNA 在体外大量扩增。
设计引物应遵循以 下原则： ① 引物长度：15-30bp ，常用为20bp 左右。
② 引物扩增跨度： 以200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段③引物碱基：G+C 含量以40-60% 为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。
ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3' 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3' 端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1? lumol 或10? 100pmol , 以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA 聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
PCR的反应条件如何确定结果
PCR的反应条件如何确定结果1. 引言聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种重要的分子生物学技术，可以在体外快速扩增DNA序列。
其广泛应用于基因检测、检测病毒、研究疾病等领域。
PCR的反应条件的确定对于实验结果的准确性和可重复性具有重要意义。
2. PCR反应的关键参数2.1 温度PCR反应需要经历不同温度的周期，包括变性、退火和延伸阶段。
其中变性阶段需要高温使DNA两链分离，一般设定在90-95℃；退火阶段需要较低温度使引物与目标序列结合，一般设定在50-65℃；延伸阶段需要合适的温度使DNA聚合酶在引物的引导下合成新链，一般设定在70-75℃。
通过优化温度参数，可以提高PCR反应的特异性和敏感性。
2.2 引物浓度引物是PCR反应的关键组成部分，影响着扩增效率和特异性。
引物的浓度直接影响着PCR反应中特定片段的扩增情况。
一般来说，引物的浓度应该控制在0.1-1μM之间。
如果引物浓度过高，可能会导致非特异性扩增，而引物浓度过低则可能会降低PCR反应的效率。
2.3 DNA模板浓度DNA模板浓度对PCR反应的结果也有重要影响。
如果DNA模板浓度过高，可能会导致酶的竞争，从而降低PCR的效果。
相反，如果DNA模板浓度过低，则可能会影响PCR的灵敏度和特异性。
一般来说，较高的DNA模板浓度可以提高PCR反应的效率和灵敏度，但也应避免出现过度扩增。
2.4 Mg2+浓度Mg2+是PCR反应中DNA聚合酶所需的辅因子，对其活性和结构稳定性有重要影响。
适当的Mg2+浓度能够提高PCR反应的效率和特异性。
一般情况下，Mg2+浓度应控制在1-2mM之间。
如果Mg2+浓度过高，可能会导致非特异性扩增；反之，如果Mg2+浓度过低，则可能会影响PCR的效果。
3. PCR反应条件的优化为了确定PCR反应的结果，首先需要确定一个适合的PCR反应条件。
下面介绍几种常用的PCR反应条件优化策略：3.1 温度梯度PCR温度梯度PCR是一种常用的PCR反应条件优化方法，通过在一次PCR反应中设置不同的反应温度，可以快速确定最适合的退火温度。
(最新整理)PCR反应体系
模板
➢ 单、双链DNA均可。 ➢ 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、
DNA结合蛋白类。 ➢ DNA模板使用量一般为20-200ng。 ➢ 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 ➢ RNA模板注意保证其防止RNA降解。
其他成分
➢ RNasin（RNase Inhibitor）的作用：RNA酶 抑制剂，抑制RNA酶的活性。
➢ UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU 的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成 的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高 温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG 酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。
其他成分
➢ 反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指 导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。
PCR反应体系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
01 PCR buffer
PCR
02 Taq酶
反 应
03 dNTPs
非特异性 产物减少 扩增
导致错配 产物减少
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
引物及探针
➢ 引物是人工合成的一段寡核苷酸序列。一般为20 个碱基。
➢ 引物的序列与模板结合的特异性是决定PCR反应 结果的关键。
➢ 探针是人工合成的在两端分别标记荧光基团的一 段寡核苷酸序列。
pcr标准反应体系
pcr标准反应体系PCR标准反应体系。
PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
PCR标准反应体系是PCR技术中非常重要的一环，它的稳定性和准确性直接影响到PCR扩增的结果。
本文将介绍PCR标准反应体系的组成和影响因素。
PCR标准反应体系由DNA模板、引物、酶、缓冲液、dNTPs和水组成。
其中，DNA模板是待扩增的DNA片段，引物是用于识别目标DNA序列的寡核苷酸片段，酶是用于DNA合成的酶，缓冲液用于维持反应体系的pH值，dNTPs是四种脱氧核苷酸，用于DNA合成，水则是PCR反应的溶剂。
这些组分的比例和质量都会对PCR反应的效果产生影响。
首先，DNA模板的质量和浓度会直接影响到PCR扩增的效果。
如果DNA模板的质量不好或者浓度过低，会导致PCR扩增产物稀少或者根本无法扩增。
因此，在进行PCR反应前，需要对DNA模板进行质量和浓度的检测，以确保PCR反应的准确性和稳定性。
其次，引物的设计和浓度也是影响PCR反应的重要因素。
引物的设计需要考虑到目标DNA序列的特点，如GC含量、碱基序列等，以确保引物能够特异性地识别目标DNA序列。
引物的浓度过高或者过低都会影响到PCR反应的效果，因此需要进行引物的优化实验，确定最佳的引物浓度。
酶是PCR反应中的关键因素之一，不同的酶具有不同的特性，如热稳定性、扩增速率等。
选择合适的酶对PCR反应的效果至关重要。
同时，酶的浓度也需要进行优化实验，以确定最佳的酶浓度。
缓冲液的选择和pH值的调节可以影响PCR反应的特异性和效率。
不同的缓冲液具有不同的缓冲能力和离子强度，因此需要根据实验需求选择合适的缓冲液。
同时，缓冲液的pH值也需要进行调节，以确保PCR反应在最适宜的pH条件下进行。
dNTPs是PCR反应中必不可少的组分，它们是DNA合成的基本原料。
因此，dNTPs的质量和浓度也会对PCR反应产生影响。
需要注意的是，dNTPs的浓度过高或者过低都会影响到PCR反应的效果，因此需要进行优化实验，确定最佳的dNTPs浓度。
高中生物选修三pcr技术
高中生物选修三pcr技术
PCR技术是一种在分子生物学领域广泛应用的技术，它可以扩增DNA片段。
以下是高中生物选修三PCR技术相关的内容：
1. PCR反应原理：PCR反应利用DNA聚合酶对DNA序列进行复制和扩增。
主要分为三个步骤：变性、退火和延伸。
2. PCR反应体系：PCR反应需要的试剂包括DNA模板，引物（前向引物和反向引物），Taq DNA聚合酶，dNTPs和缓冲液等。
3. PCR反应步骤：
（1）变性：将DNA模板加热至95℃，使其解旋成两条单链。
（2）退火：降温至引物的退火温度，使引物与模板互补结合。
（3）延伸：加入Taq DNA聚合酶和dNTPs，开始扩增DNA片段。
4. PCR应用：PCR技术可以用于基因克隆、基因表达分析、基因诊断等领域，例如DNA指纹鉴定、疾病基因检测等。
5. PCR优化：PCR反应条件对扩增效率有很大影响，需要根据实验目的和样品特点进行优化，如引物设计、反应体积、温度梯度等。
希望这些信息对你有所帮助。
如有任何疑问，请随时询问。
PCR技术
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（3）GC的含量 GC的含量
一对引物的GC含量和Tm值应该协调， 引物的GC含量和Tm值应该协调， G+C一般占40-60%。 G+C一般占40-60%。 根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T） 可估计 根据公式Tm=4（G+C）+2（A+T）,可估计 引物的Tm值 引物的Tm值。
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（4）两引物间避免有互补序列，尤其避免3’端 ）两引物间避免有互 序列，尤其避免3’端 的互补 的互补重叠。 一般来讲，引物自身连续互 一般来讲，引物自身连续互补碱基不能 超过3个，一对引物间也不易多于四个连续 个，一对引物间也不易多于四个连续 碱基的互补 碱基的互补性。
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三、PCR的反应 三、PCR的反应体系和方法
PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互 补,延伸需将反应温度升至中温( 72℃),在Tap多聚酶的 作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中 温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的 基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使 基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙 锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的 DNA带。
4
引物
DNA聚合酶 DNA聚合酶
DNA聚合酶 DNA聚合酶
引物
特定DNA 特定DNA片段 DNA片段
1983年
Mullis的构思 Mullis的构思
5
94℃变性
5050-65℃退火
XX℃延伸
6
DNA聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的 Klenow片段，缺点： ①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每 次循环都要重新加入。 ②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生 模板和引物之间的碱基错配，PCR产物特异 性较差，合成的DNA片段不均一。 由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变 性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完 成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序 添了不少困难。
PCR技术
7. 水：
去离子水，补足整个反应体积。
四、PCR反应体系：
常用30μl
各种成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的储备液
浓度进行核算。 10×buffer： 1×30×1 / 10 = 3μl
MgCl2:
dNTPs: 引物 P：
1.5×30×1 / 25 = 1.8μl
一、PCR的定义
四、PCR反应体系
二、PCR的原理
五、PCR反应条件优化
三、PCR的成分和作用
六、PCR技术的主要用 途
一、PCR的定义：
PCR（polymerase chain reaction) ：聚合酶链 式反应，又称体外DNA扩增技术。 近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的 技术。 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好 以及快速简便等，广泛应用于微生物学、考古学、 法医学及体育等领域，并已普及到许多普通实验室， 大大简化了传统的分子克隆技术，从而比较容易地 对目的基因进行分析、鉴定。
⑵ 复性温度和时间：
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。 复性温度的选择，可根据引物的长度和 G+C含量确定，长度 在15 ～ 25 bp 之间时，复性温度 Tm = 4 (G+C) +2 (A+T) 计算
得到，一般位于40 ～ 60℃，30 ～ 60 s。
复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异 性越低。 一般情况下选择55 ℃ 30″，足以使引物与模板之间完全结合。
二、PCR的原理：
用于扩增位于两段已知序列之间的 DNA片段，类
似于天然DNA的复制过程。
以拟扩增的 DNA分子为模板，以一对分别与模板 5′ 末端和 3′ 末端互补的寡核苷酸片段为引物，在 DNA 聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着 模板链延伸直至完成新的 DNA 合成，重复这一过程，
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PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液 10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
催化一典型的PCR反应约需酶量2。
5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。
HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。
多次冻融会使dNTP降解。
在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。
浓度过低又会降低PCR 产物的产量。
dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。
SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质
结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。
提取
的核酸即可作为模板用于PCR反应。
一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR 扩增。
RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，
要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR 反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。
Mg 2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。
在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至4 0 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延
伸。
对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性，65℃左右退火与延伸(此温度Ta q DNA酶仍有较高的催化活性)。
①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。
一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。
此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失
败。
②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。
变性后温度快速冷却至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA 比引物
复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。
退火温度与时间，取决于引物的长度
、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数循环次数决定PCR扩增程度。
PCR循环次数主要取决于模板D NA的浓度。
一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。