第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
（一）引起菌种退化变异的因素
❖ 遗传基因型的分离
丝状真菌、多细胞组成、有的单核、有的多核，遗传物质基础有多样性的复 杂性，为群体繁殖，往往出现遗传基因型的分离---数量遗传的自体调节现象。
感（真菌：106 cfu/mL孢子悬浮液；细菌：108 cfu/mL的菌液） ❖ 诱变效应的测定：直接法和浓缩法，培养后测定目的产物量 ❖ 诱变方法：单因子、复合诱变 ❖ 优良突变株的筛选方法：随机筛选或半理性化筛选
（三）诱变育种流程
第三节 菌种保藏与复壮
一、菌种的衰退
❖ 菌种衰退（degeneration） 生产菌种或筛选出来的较优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群 体某些形态特征及生理特征逐渐减退甚至完全丧失的现象。 由于菌种的自发突变使其典型性状，特别是产量性状发生负变的现象。
⑤ 液氮超低温保藏法（当前最理想的保存法）
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CICC保藏菌种
GIMCC保藏菌种
请从保藏原理、保藏适应对象、 保藏期及优缺点等方面对各种保藏方 法进行比较说明。
保藏方法
保藏原 理
适用菌种
斜面低温
保藏期
液体石蜡 油保藏
砂土管保 藏
冷冻真 空干燥
液氮超低 温
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优点
（三）纯种分离
（1）平板划线分离法 （2）稀释分离法 （3）涂布分离法 （4）毛细管分离法 （5）小滴分离法
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初筛和复筛
（1）初筛（定性——粗放！） ① 平板筛选 （变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈 ） ② 摇瓶发酵筛选
（2）复筛（定量——精确！） 1个菌株重复3～5瓶，精确分析 如酶活力单位、耐酒精程度等。
自 然 选 育
05年江南大学微生物(发酵)考研试题
资料显示，某些芽孢杆菌具有分解和利 用葡聚糖的能力，请设计方案从自然界中筛选 一产葡聚糖酶的菌株，并简要分析各主要步骤 的依据。
三、诱变育种
❖ 诱变育种：指人为地、有意识地将对象生物置于诱变因子中， 使该生物体发生突变，从这些突变体中筛选具有优良性状的 突变株的过程。 提高了菌种发生突变的频率和变异幅度，提高获优机率。
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溶磷细菌的平板筛选(5d)
高效溶磷的真菌菌株
青霉菌溶磷实验
（四）性能鉴定
❖ 生产性能测定
通常使用初筛和复筛的方法确定。直接从自然界分离得到的菌 株为野生型菌株。我们常将这些自然界中直接获得的新菌株称 为进一步育种工作的原始菌株或出发菌株。
❖ 毒性试验
若毒性大而且无法排除者应予以淘汰。
多粘类芽孢杆菌
酿酒酵母
粉状毕赤酵母
红葡萄浓缩汁中的酵母菌形态
产朊假丝酵母
黑曲霉
黑曲霉
青霉
米曲霉
蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等
根霉
绿色木霉
产生微晶纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
拟康氏木霉
产生纤维素酶，羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶，可完全水解纤维素。
第二节 菌种选育
一、新菌种的分离与筛选
样品 采集
富集 培养
分离 纯化
性能 鉴定
样品来源越 广泛，获得 新菌种的可 能性越大。
利用人工环 境，使样品 中目标微生 物成为优势 菌。
纯种分离的 常用方法有 平板划线分 离法、稀释 分离法和涂 布分离法。
一般生产性 能的测定通 过初筛和复 筛的方法来 确定。
❖ 广义—— 是指在菌种的生产性状尚未衰退前，就经 常有意识的进行纯种分离和生产性能的测定，从而 使菌种的生产性能逐步提高的一种措施。
❖ 狭义—— 指菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离 和性能测定的办法从衰退的群体中找出尚未衰退的 个体，以达到保持该菌种原有典型性状的一种措施。
❖ 复壮的方法
纯种分离 淘汰已衰退的个体 通过寄主体进行复壮
（二）富集培养
① 富集培养的目的 利用人工环境，使样品中目标微生物成为优势菌。
② 富集培养的方法 控制培养基的营养成分 控制培养条件
③ 富集培养的方式 分批培养（Batch culture ） 连续培养（Continuous culture ） 分批补料培养（Fed-batch culture ）
❖ 生物诱变因子
噬菌体、转座子等
（二）诱变基本方法及影响因素
❖ 诱变剂的选择：作用机理；突变谱 ❖ 诱变剂量选择：最适剂量（致死率70-80%时） ❖ 增效（变）剂：氯化锂（0.5%） ❖ 外部环境条件：如温度、氧气、pH、水分 ❖ 出发菌株的选择：生产菌株、野生菌株 ❖ 出发菌株的生理状态：细菌--对数生长期；幼年孢子；营养体；湿态敏
制作简单，不需 特殊设备，且不 需常移种
直立保存,不便 携带，不适石 蜡碳源或敏感 者
砂土管保 低温、缺氧、细菌芽孢,霉菌、
Hale Waihona Puke 藏缺营养放线菌的孢子
2-5年
简单易行
工作量大,费人 力，不适干敏 性无孢菌
冷冻真 空干燥
低温(-20℃以 下)、干燥、 缺氧
除少数不产孢 子只产菌丝体 的丝状真菌外 均可
5-10年
❖ 自发变异的产生
负向变异为多数，结果：目的代谢产物产量下降，生长逐步变弱变慢，孢子 形成能力低下等。
原因：长期保藏；频繁传代（例斜面保藏、发酵厂种子制备）；菌体在代谢 过程中产生具有诱变作用的物质；存在增变。
❖ 人工诱变导致的退化变异
基因突变（退化的根本原因） 连续传代（加速退化的直接原因）
（二）衰退的防止
NICPBP MCCC CACC IMB SIA
卫生部药品生物制品检定所
中国海洋微生物菌种保藏管理中 心
中国抗生素微生物菌种保藏中心
中国医学科学院医学生物学研究 所
四川抗生素研究所
IANP 石家庄华北制药厂抗生素研究所
CVCC NCIVBP
CFCC RIF
中国兽医微生物菌种保藏中心 农业部兽药监察研究所 中国林业微生物菌种保藏中心 中国林业科学院林业研究所
保藏期长，成活 率高
需特定设备、 操作繁琐,要求 严格
液氮超低 温
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超低温 (-150～196℃)
各类微生物
10年以上
保存时间长
需特殊设备， 操作复杂
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第四节 国内外主要菌种保藏机构
表 国内主要菌种保藏机构
单位简称
单位名称
单位简称
单位名称
CCCCM ACCC CICC CMCC CGMCC ISF
由葡萄糖制造果糖
医药、食用 酵母菌体蛋白 食品工业 食用、医药
柑橘罐头脱除苦味
分解单宁、酶精制、酒精发酵工业 同枯草杆菌蛋白酶 葡萄糖制造、酒精厂糖化、医药 腐乳生产 蛋白除葡萄糖、脱氧、食品罐头贮存 淀粉和食品加工、饲料 食用、化工 葡萄糖制造、酒精厂糖化、调色剂
枯草芽孢杆菌
戊糖片球菌
植物乳杆菌
❖ 突变：在自然状况下发生的突变—自然突变（10-6~10-9） ❖ 诱变：人为地利用物理或化学因素诱发的突变（10-4~10-5） ❖ 诱变剂：能够显著提高突变频率的物理或化学因素。
（一）常见诱变剂及作用基本原理
❖ 物理诱变因子
紫外线、X射线、快中子等
❖ 化学诱变因子
硫酸二乙酯（DES）、亚硝酸、 吖啶橙
（一）纯种分离
❖ 菌落纯
用稀释平板法或平板划线法，取得单细胞菌落，再通过菌落和菌的特征分析和 性能测定，获得具有原来性状或性状更好的菌株。
❖ 菌株纯（细胞纯）
只有菌丝的：在显微镜下用毛细管挑取只有一个核的菌； 有孢子的：在显微镜下用毛细管挑取单个孢子。 一般只要求达到菌落纯的水平——用于退化不太严重的情况。
缺点
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保藏方法
发酵工程原理与技术第二章
施加选择压力的分离方法
分批式富集培养（摇瓶培养） 重复移植几次后，接种已富集的培养物到固体培养基，可 将优势微生物分离出来。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
施加选择压力的分离方法
连续富集培养： 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。 改变限制性基质浓度可以控制两种菌的比生长速率。
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几个应注意的问题
（1）出发菌株 出发菌株应产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。
几个应注意的问题
（2）复合诱变因素的使用 野生型菌株用单一诱变因素有时能取得好效果；老
菌种单一诱变因素重复使用突变效果不高，可利用复合 因素、扩大诱变幅度，提高诱变效果。
青霉菌选育：先以氮芥处理很短时间而不引起突变， 再用UV处理，可使诱变频率大为提高。提高突变频率可 获得高产菌株。
诱变育种
诱变育种理论基础：基因突变。
自然突变：自然条件下出现的基因突变。
诱发突变：用各种物理和生物因素、化学 因素人工诱发的基因突变。
诱变剂处理使菌种发生突变频率和变异幅度提 高—获得特性优良变异菌株的几率高。
诱变育种主要步骤
出发菌株的诱变处理 和 突变体的筛选。
前进
出发菌株诱变处理
包括：
出发菌株的选择 诱变剂的选择 诱变剂量和处理时间的确定
几个应注意的问题
乙烯亚胺和UV复合处理，氯化锂和UV复合处理，都 用得较普遍，且有一定成效。
氯化锂本身无诱变作用，与一些诱变因子一起使用时 能促进突变。
几个应注意的问题
（3）剂量选择
变异率取决于诱变剂量，变异率和致死率之间有一 定关系。用致死率作为选择适宜剂量的依据。
合适剂量：同时增加变异幅度与正突变。
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮今天要和大家介绍的是食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮，这是食用菌生产过程中少不了的步骤。
一、菌种贮藏原理食用菌菌种是国家重要的种质资源。
菌种保藏是食用菌生产中的一项必不可少的环节。
食用菌和其他生物一样，都具有遗传性和变异性。
遗传性保证了子代遗传特征的相对稳定，为菌种贮藏提供了条件；变异性使子代的性状与亲本相比会发生某些改变，给菌种的保藏带来了困难。
食用菌菌种在长期的栽培和保藏过程中，由于传代次数过多或不利环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。
因此，要想在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就应该采取一定的措施，进行菌种保藏工作。
菌种保藏的目的是在特定条件下，降低菌种的代谢速度，使其处于休眠或半休眠状态，在一定的保藏期内，确保菌种的纯度，防止病虫害感染，以保持菌种的优良性状，当条件适宜时又可以重新恢复生长繁殖。
菌种保藏的基本原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等方法，以抑制菌丝生长，降低代谢速度，使菌丝处于休眠或半休眠状态，并保证菌种的纯度。
二、菌种复壮从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，进行分离、培养，从而达到恢复菌种优良性状的过程就叫菌种复壮。
在实际生产中，多是在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。
(一)菌种复壮原理生物以遗传变异为基础，通过自然选择和人工选择得以进化。
变异提供了选择的基础，选择保存了适应环境的个体，保存的个体使遗传特征得以遗传。
如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。
菌种复壮就是依据这个原理进行的。
(二)菌种复壮方法1.挑选健壮菌丝进行接种：每次转接菌种时都挑选健壮菌丝进行接种是防止菌种衰退的有效、简便的措施。
2.进行分离复壮：从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，通过分离进行复壮。
如菌丝分离，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。
菌种保藏、衰退及复壮（3）
菌种保藏、衰退及复壮（3）菌种保藏、衰退及复壮（3）来源：青岛海博三、菌种的复壮（一）复壮狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。
由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮是一种积极的措施，也是目前工业生产中积极提倡的措施。
（二）菌种复壮的主要方法1、纯种分离法通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。
常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。
例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。
另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。
它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。
后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。
对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。
2、宿主体内复壮法对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。
例如，苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。
如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。
根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。
3、淘汰法将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
10菌种的衰退复壮和保藏_PPT课件
菌种保藏的具体方法
2.隔绝空气保藏法： 该法保藏的原理主要是通过限制
氧的供应以削弱微生物的代谢作用， 故不适用于厌氧菌。
石蜡油保藏法 橡皮塞密封保藏法 琼脂柱穿刺封口保藏法
武汉鑫华生环保科技有限公司 武汉金海通生物科技有限公司
菌种保藏的具体方法
3.干燥保藏法：断绝对微生物的水分供应，能 使微生物的代谢活动强度明显减弱。
最后，衰退还表现在抗不良环境条件 （抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱 等。
菌种的衰退是一个由量变到质变的逐 步演变过程，必须及时采取有效措施 进行复壮。
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菌种的复壮
1.纯种的分离： 通过纯种分离可把退化菌种中的一部
分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来， 经过扩大培养就可恢复原菌株的典型性状。 粗放的方式：只能达到“菌落纯”的水平， 即从种的水平来说是纯的。 较精细的方式：单细胞或单孢子分离方法。 它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水 平。
菌种的保藏
菌种是国家的重要自然资源，菌 种保藏是微生物学的重要基础工作。 菌种保藏的目的是使之不混乱、不死 亡、不污染，并稳定保持原有特性。 农业微生物学国家重点实验室－－
国内唯一的、代表我国农业微生 物科研领域最高水平的实验室。
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菌种保藏的具体方法
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常见活菌制剂成品的 保存条件及适宜储存时间？
成品种类 冻干乳酸菌 冻干红假单胞菌 液态乳酸菌 液态红假单胞菌 复合芽孢杆菌粉 粪肠球菌
保存条件
密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉
工业微生物菌种的衰退 复壮与保藏
工业微生物菌种的衰退复壮与保藏工业微生物菌种的衰退.复壮与保藏⒈ 菌种衰退的原因菌种衰退的原因有两个方面：一是菌种保藏不妥；二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。
此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。
菌种的衰退会使微生物个体和群体特征的各个方面发生变化，其中最重要的是使所需产物的生产产量下降、营养物质代谢和生长繁殖能力下降、发酵周期延长、抗不良环境条件的性能减弱等。
菌种的退化不同于培养过程中由环境条件变化引起的表面的、暂时的变化，而是由个别、少数菌体细胞衰退后逐渐导致整个菌株衰退的一个从量变到质变的遗传变异过程。
菌种连续传代是菌种发生衰退的直接原因。
由于连续传代使菌种经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是在不断地变化，与处于休眠状态的菌种相比，细胞的自发突变率要高得多。
因此，菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。
培养基灭菌升、降温的不同，培养基存放时间的不同，采用老龄菌和多核菌丝传代等都比较容易引起菌种衰退。
菌种的保藏主要是通过控制低温、干燥、缺氧等条件，使微生物营养体或休眠体处于不活泼的状态，维持最低代谢水平，尽可能保证活力和不发生变异。
但是，各种菌种的保藏法对阻止菌种变异的效果不尽相同，用效果较差的条件保藏菌种时，菌种就较易发生衰退。
此外，保藏操作不当也会影响保藏效果，甚至导致菌种的变异。
菌种自身突变引起菌种衰退。
菌种的自发突变和回复突变是引起菌种自身衰退的主要原因。
微生物细胞在每一世代中的突变概率一般为10-8～10-9，保藏在0～4 ℃时这一突变概率更小，但仍然不能排除菌种衰退的可能。
诸如对营养缺陷型菌种未充足供给所需营养物，菌种就会发生突变而丧失已有的特性。
菌种的回复突变是指突变菌株因遗传组成的自身修复，使原有的遗传障碍解除，代谢途径发生变化，从而恢复原有的特性，表现出原育种过程中已获得的优良性状的退化。
第二章 微生物菌种选育
• 优良的菌种是发酵工业的基础和关键，是 显著改善和提高产品种类、产量以及质量 的先决条件。 • 菌种选育，就是要利用微生物的遗传变异 的特性，采用各种手段，改变菌种的遗传 性状，使其符合工业生产的需要。
本章主要内容
• 第一节 微生物发酵工业的菌种类型及来源 • 第二节 微生物发酵高产菌种选育 • 第三节 菌种的退化和菌种保藏
土样的采集方法
使预被分解的物质成为唯一的碳源或氮源 pH7.0～7.5适于细菌和放线菌，pH4.5 ～6适于霉 菌和酵母 40℃利于放线菌孢子萌发，却不利于细菌生长 限制通入氧气使厌氧菌数量增加
采用平板划线法和稀 通过压力（高温、高压、抗生素）使非目的的 释法，以时间为变量， 类群比例减少 进行纯种分离
从一些发酵制品中分离目的菌株，如酒醪中 分离淀粉酶或糖化酶的产生菌，从酱油中分 离蛋白酶产生菌，从噬菌体污染的发酵液中 分离抗噬菌体的发酵菌株等。
三、菌种微生物的选择性分离
• 菌株的分离和筛选分为以下几步：
采 样 富 集 分 离 筛 选
各种生境下的土壤是 微生物菌种最全面的 来源 人为控制条件使所期 待的目的菌种占据优 势
是单产高的营养缺陷型突变菌株或调节突变菌株或野生菌株，最 好还是抗噬菌体能力强的菌株
菌种纯粹，不易变异退化，以保证稳定性
菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括 抗生素、激素、毒素等），以保证安全
类型：包括细菌、酵母菌、霉菌和放线菌等类群，还有担子菌及藻类等
一、工业发酵常见的微生物种类
担子菌就是人们常说的菇类（mushroom）微生物。
担子菌资源的利用正引起人们的重视，如多糖、 橡胶物质和抗癌药物的研发。
6、藻类（alga）
第二章 菌种制备.
以微生物的自然变异作为基础 的生产选种机率并不很高，一个 基因的自然突变频率仅10-6-10-10 左右。
确定出发菌株
↓ 菌种的纯化选优 ↓←出发菌株的性能鉴定 同步培养 ↓
二、微生 物的诱变
育种
制备单细胞（或单孢子）悬液
↓←活菌浓度测定
（一）诱变育种的一般步骤和方法
诱变剂的选择与确定诱变剂量的预试验 ↓
第二章 菌种制备
微生物的菌种制备
在微生物工业应用中， 微生物菌种工作主要包 括以下四方面：
① 菌种的分离筛选：挑选符合生产要求的菌种，这 是选种工作的任务。
② 菌种培育： 改良已有菌种的生产性能，使产品 的质和量不断提高，或使它更适应于工艺的要求，这是 育种工作的任务。
③ 菌种的保藏： 一切生产菌种都要使它避免死亡 和生产性能的下降，这是菌种保藏工作的任务。
斜面种子(初筛)
高产纯化株 摇瓶复筛 斜面种子
高产菌株
沙土管菌株
筛选：将分离培养后的各型单菌落接斜
面培养，成熟后接入摇瓶，测定其发 酵生产能力的过程。
初筛：以迅速筛出大量的达到初步要 求的分离菌落为目的，以量为主。
复筛：则是精选，以质为主，也就是 以精确度为主。
优点：简单易行
缺点：效率低、进展慢
2、原生质体融合育种
原生质体融合育种
细胞（A+B—）
细胞（A—B+）
脱壁处理
脱壁处理
原生质体（A+B—）
原生质体（A—B+）
菌种复壮
防止菌种衰退的方法
（1）控制传代次数 （2）选择合适的培养条件 （3）利用不同类型的细胞进行传代 （4）选择合适的保藏方法
（1）控制传代次数
基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中， 繁殖越颇繁，复制的次数越多，基因发生 变化的机会也就越多。因此应该尽量避免 不必要的接种和传代，把传代次数控制在 最低水平，以降低突变机率。一般情况下， 斜面每移植一代，霉菌、放线菌、芽孢杆 菌在低温下可保藏半年左右，酵母可保藏3 个月左右，无芽孢细菌可保藏1个月左右。 为此，生产菌种每移植一代，最好同时移 植较多的斜面，以供一段时间生产之需， 这样移植次数就可减少。
菌种的衰退、复壮与鉴定
文
震
微生物菌种的衰退与复壮
微生物具有生命活动能力，其世代时间一 般是很短的，在传代过程中易发生变异甚 至死亡，因此常常造成工业生产菌种的退 化，并有可能使优良菌种丢失，所以，如 何保持菌种优良性状的稳定是研究菌种保 藏的重要课题。
菌种的衰退
菌种退化通常是指在较长时期传代保藏后， 菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐 渐减退或消失的现象。
发酵工业菌种鉴定
细胞形态与习性水平 细胞组分水平 蛋白质水平 基因与核酸水平
经典分类鉴定
形态学特征 生理生化特征 血清学试验与噬菌体分型 氨基酸顺序与蛋白质分析
现代分类鉴定方法
微生物遗传型 DNA碱基组成 核酸分子杂交 遗传重组特性分析 RNA特性分析
现代分类鉴定方法
细胞化学成分特征分类 细胞壁化学组分 脂肪酸组成与磷脂成分分析 酯类及多胺的分析 醌类及多胺类的分析 可溶性蛋白的质朴分析
在发酵生产中常用营养缺陷型突变株，如 缺陷型发生回复突变就会使产量水平下降。 如粘质赛氏杆菌(Serratia marcescens)H2892菌株生产力为18g/L组氨酸，经5次传 代后因回复突变型增多，产量下降至4g/L。
微生物菌种及其复壮与保藏
❖ 适用：除了一些不产孢子的丝状真菌外。
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❖1.安剖瓶：2% 盐酸浸泡7-10h。 装入标签， 塞上棉花，灭菌备用。
❖ 2．保护剂：选择适合的种类。
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保护剂
减少细胞的 损伤和死亡
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维持细胞 的构型
重新培养 适宜溶解
3.菌种制备
成长良好，健壮
业 繁殖, 假丝….
生
产
常 ❖啤酒酵母----酿酒、细胞色素C、单细胞蛋
用 的
❖
白、 甘油、琥珀酸
微 ❖假丝酵母----面包、石油脱蜡、饲料
生 物
❖ 类酵母----脂肪酶
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工 业
❖3.霉菌:丝状真菌
生
产 ❖生产菌种:根霉,毛霉,犁头霉,红曲霉,
常 青霉等 用
的
微 ❖产品:酶制剂; 抗生素;有机酸;甾体激
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液氮超低温法
❖ 保护剂：甘油，二甲基亚砜，糊精，血清蛋 白等。
❖ ❖ 不同微生物的保护剂不同，需实验确定。 ❖ 甘油10-20%，二甲基亚砜5-10%
❖ 安剖瓶的选择：95料或GG17的玻璃管制 成。
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❖ 菌种制备和冻结保藏：孢子或菌丝体。-35 ℃以前控制降温速度。
❖恢复培养:38-40 ℃ 水中 ❖ 注意防护：防冻，防爆。
子菌，如大型食用真菌和药用真菌以及镰刀菌、 红曲霉等. ❖ 注意：保藏温度，液体石蜡需灭菌和除水
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（三）.干燥保藏法
沙土
❖麦麸
硅胶
适于:能产生孢 子或芽孢的微 生物
适合产孢子 的霉菌和放 线菌
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适合丝状 真菌和酵
母菌