蛋白质表达的基本原理及其在生物系统中的作用
生物化学 5-基因表达调控
个基因或一些功能相近的基因表达（生物体内基因表达）的开启、
关闭和表达强度的直接调节。
它是生物在长期进化过程中逐渐形成的精确而灵敏的生存 能力和应变能力，是生物赖以生存的根本之一。
二、基因表达的方式
（一）组成性表达(constitutive gene expression)
指不大受环境变动而变化的一类基因表达。其中某些基因表 达产物是细胞或生物体整个生命过程中都持续需要而必不可少的， 这类基因可称为管家基因(housekeeping gene)，这些基因中不少
性。
• 当有葡萄糖存在时， cAMP浓度较低， cAMP与CAP 结合受阻，lac操纵子表达下降。
（4）协调调节
Lac阻遏蛋白负性调节与cAMP正性调节两种机制协调合作 • 无乳糖，无诱导物时，转录作用被I表达的阻遏蛋白所阻断。 • 有诱导物时，诱导物与阻遏蛋白结合，使其变构，从操纵基
因上解离出来。
调节基因
β －半乳糖苷酶
2、阻遏蛋白 的负性调节
没有乳糖存在时，lac操纵子处于阻
遏状态。I序列表达的lac阻遏蛋白与
O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序 列结合，抑制转录启动。
有乳糖存在时，lac 操纵子可被诱导。
别乳糖作为诱导剂分子结合阻遏 蛋白，使蛋白构象变化，导致阻 遏蛋白与O序列解离，发生转录
基因产物特异识别、结 合其它基因的调节序列， 调节其它基因的开启或
关闭称为反式调节
基因产物特异识别、 结合自身基因的调 节序列，调节自身 基因的开启或关闭 称为顺式调节
DNA
a
A A
反式调节
b
mRNA
蛋白质A
C
c
DNA
mRNA
顺式调节
生物化学第十三章 基因表达调控
第十三章基因表达调控一、基因表达调控基本概念与原理：1．基因表达的概念：基因表达（gene expression）就是指在一定调节因素的作用下，DNA 分子上特定的基因被激活并转录生成特定的RNA，或由此引起特异性蛋白质合成的过程。
2．基因表达的时间性及空间性：⑴时间特异性：基因表达的时间特异性(temporal specificity)是指特定基因的表达严格按照特定的时间顺序发生，以适应细胞或个体特定分化、发育阶段的需要。
故又称为阶段特异性。
⑵空间特异性：基因表达的空间特异性（spatial specificity）是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因的表达在不同的细胞或组织器官不同，从而导致特异性的蛋白质分布于不同的细胞或组织器官。
故又称为细胞特异性或组织特异性。
3．基因表达的方式：⑴组成性表达：组成性基因表达（constitutive gene expression）是指在个体发育的任一阶段都能在大多数细胞中持续进行的基因表达。
其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素的影响。
这类基因通常被称为管家基因（housekeeping gene）。
⑵诱导和阻遏表达：诱导表达（induction）是指在特定环境因素刺激下，基因被激活，从而使基因的表达产物增加。
这类基因称为可诱导基因。
阻遏表达（repression）是指在特定环境因素刺激下，基因被抑制，从而使基因的表达产物减少。
这类基因称为可阻遏基因。
4．基因表达的生物学意义：①适应环境、维持生长和增殖。
②维持个体发育与分化。
5．基因表达调控的基本原理：⑴基因表达的多级调控：基因表达调控可见于从基因激活到蛋白质生物合成的各个阶段，因此基因表达的调控可分为转录水平（基因激活及转录起始），转录后水平（加工及转运），翻译水平及翻译后水平，但以转录水平的基因表达调控最重要。
⑵基因转录激活调节基本要素：①顺式作用元件：顺式作用元件（cis-acting element）又称分子内作用元件，指存在于DNA分子上的一些与基因转录调控有关的特殊顺序。
分子生物学常用实验方法原理介绍
分子生物学常用实验方法原理介绍一、GST pull-down实验基本原理:将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。
此方法简单易行,操作方便。
注：GST即谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)二、足印法（Footprinting）足印法（Footprinting）是一种用来测定DNA-蛋白质专一性结合的方法，用于检测目的DNA序列与特定蛋白质的结合，也可展示蛋白质因子同特定DNA片段之间的结合。
其原理为：DNA和蛋白质结合后，DNA与蛋白的结合区域不能被DNase（脱氧核糖核酸酶）分解，在对目的DNA 序列进行检测时便出现了一段无DNA序列的空白区(即蛋白质结合区)，从而了解与蛋白质结合部位的核苷酸数目及其核苷酸序列。
三、染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，利用该技术不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰以及转录因子与基因表达的关系。
染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA 片段沉淀下来。
染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA的纯化及鉴定。
四、基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术基因芯片指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。
现代分子生物学
蛋白质组学基本概念
蛋白质组
指一个细胞、组织或生物体在特定时间和空 间下表达的所有蛋白质的总和。
蛋白质组学
研究蛋白质组的结构、功能和相互作用的科 学，旨在揭示生物体内蛋白质的表达、修饰 和调控机制。
蛋白质组测序技术及应用
蛋白质组测序技术
包括质谱技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂 交系统等，用于鉴定和定量蛋白质组中的蛋 白质。
信号转导不仅影响细胞短期内的功能，还参与调控细胞长期的生命过 程。
06
现代分子生物学实验技术
基因克隆与表达技术
01
02
03
基因克隆基本步骤
包括目的基因获取、载体 选择、基因与载体连接、 转化宿主细胞、筛选阳性 克隆等。
基因表达系统
包括原核表达系统和真核 表达系统，用于生产重组 蛋白或进行基因功能研究。
细胞培养与转染技术
细胞培养基本条件
提供适宜的温度、湿度、pH值和营养成分，维持细胞正常生长和 增殖。
转染方法
包括化学转染、物理转染和病毒转染等，将外源基因导入细胞内。
细胞培养与转染技术应用
用于基因功能研究、药物筛选、细胞治疗等。
显微成像技术在分子生物学中应用
光学显微镜
观察细胞形态、细胞分裂、细胞 运动等基本生命活动。
应用前景
分子生物学在医学、农业、工业等领域具有广泛的应用前景。例如，在医学领域，分子生物学可用于疾病诊断、 治疗和预防；在农业领域，可用于作物遗传改良和病虫害防治；在工业领域，可用于生物制药、生物燃料和生物 环保等方面。
02
基因与基因组学
基因结构与功能
基因结构
基因由编码区和非编码区组成，编 码区包含外显子和内含子，外显子 负责编码蛋白质，内含子则在转录 过程中被剪切掉。
蛋白质组学研究内容和相关技术
一、什么是蛋白质组？与基因组差别？蛋白质组学的主要研究内容及技术体系？答：蛋白质组：Proteome，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。
基因组：Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。
可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。
因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
二者区别：蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域，它们之间既为互相补充又能互相帮助，但二者之间仍有一些区别：蛋白质组：多样性，无限性，动态性，空间性，互相作用。
基因组：同一性，有限性，静态性，周期性，孤立性。
蛋白质组学的主要研究内容：（1）表达蛋白质组学(expressionproteomics)：是对蛋白质组表达模式的研究，即检测细胞、组织中的蛋白质，建立蛋白质定量表达图谱，或扫描表达序列(EST)图谱。
在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性，对寻找疾病诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究等具有重要作用。
（2）细胞图谱蛋白质组学(cellmapproteomocis)：是对蛋白质组功能模式的研究，即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置和鉴定蛋白质复合物组成等，便于研究蛋白质在细胞内的行为、运输及蛋白质相互作用网络关系，它对确定蛋白质功能和疾病诊疗的靶位极有价值。
蛋白质组学技术体系：（1）蛋白质组学分离技术，在整个蛋白质组学的研究中，分离技术是最基础的部分。
蛋白质相互作用
荧光共振能量转移 (FRET)
原理：FRET在蛋白质相互作用研究的 基本原理是分别将bait蛋白、prey蛋 白与相应的供体荧光基团(如ECFP)和 受体荧光基团(如 EYFP)融合
优点：能检测到瞬时、较弱的蛋白质 相互作用；能同时检测到两蛋白的细 胞分布和作用位点。 缺点：光谱可能存在重叠，影响实验 结果
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
相互作用区域是蛋白质相互作用的结构基础
1. PDZ结构域
2. LIM结构域
Interaction Domain-Structral basis for protein interaction
免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
原理：利用抗体和抗原之间 特异性的识别和结合，通过亲 和纯化，分离出抗原蛋白和单 克隆抗体。 优点：保留蛋白质的修饰 和结合状态，同时所需的样本 量较少。 缺点：Co-IP特异性较低
双分子荧光互补 ( BiFC)
原理 ：将荧光蛋白分成两个无独 立功能的片段，分别与 bait 蛋白和 prey 蛋白融合表达。 优点：能简单方便地通过观察荧 光鉴定蛋白质相互作用 缺点：不能实时反应蛋白质的结 合和分离情况。
临界值内。如果两个结构域中至少有五个原子的距离在 5 Å 之内，那么这两个结构域之间存在相互作用。
Full Atom Contact (FAC) PSIMAP 方法 Sampled Atom Contact (SAC) PSIMAP
最精确
节约时间和搜索空间
Bounding Box Contact (BBC) PSIMAP
9
简答题简述 一蛋白质的生物合成
一. 简答题简述一蛋白质的生物合成：1,氨基酸的活化与搬运——氨基酰TRNA的合成，氨基酸的氨基和羧基反应性不强，需要活化，活化反应：氨基酸先与氨基酸TRNA合成酶形成中间产物再接到TRNA的氨基臂（3'末端CCA-OH上）2，蛋白质合成过程中，核蛋白体循环，肽链合成的起始，在蛋白质起始因子作用下形成起始复合物70SMRNAFMETTRNAFMET3.肽链的延伸，包括进位，转肽，移位，需要延长因子，GTP等的参与。
a对应MRNA上第二CODON的AA-TRNA进A位b在肽基转移酶的催化下，P位的fMET转移到A位的TRNA上，与A位的氨基酸残基的氨基宿和，P位空TRNA掉下，cA位的二肽酰-TRNA移到P位，空出A位，如此，第三四个N个氨基酸的AA-TRNA继续与肽链合成，4肽链合成终止，终止因子识别终止密码，促进P位上肽链水解释放及TRNA的释放，离开RRNA。
终止因子再促进亚基解聚，30S.50S又用于新链合成二. 阐述原核生物DNA复制全过程：1,起始，a识别起始位点，复制开始时，蛋白DnaA识别起始位点，解链酶及引物酶协助识别并结合到模版的起始位点开始引物合成，b松旋酶，解旋酶与复制起点结合，解开双螺旋形成两条局部单链，单链结合蛋白也随即结合到单链cRNA引物合成，RNA聚合酶以DNA链为模版合成RNA引物主导链合成一个底物2.延伸在DNA聚合酶iii的催化下，以模板链3'—5'的核苷酸顺序互补的原则。
在RNA引物的3'-OH末端逐个连接上DNMP直至合成整个前导链和冈崎片段3.终止，aRNA引物的切除和缺口的填补，5'端或冈崎片段5'端的引物由聚合酶i切除并填补bDNA片段连接由DNA连接酶连接三. 什么是操纵子，用原核生物的操纵子模型解释合成酶的阻遏原理操纵子基因表达的协调单位.具有共同控制区和调节系统。
乳糖操纵子（Lacoperon）乳糖不存在,R（I）f repressor结合于Operater,挡住RNA聚合酶的通路，无法转录乳糖为碳源时，乳糖—诱导物，与repressor结合成复合物，不能结合于0,让RNA聚合酶通过操纵区部位，移到结构基因，转录开始。
绿色荧光蛋白(GFP)的基因克隆及表达
绿色荧光蛋白（GFP）的基因克隆及表达摘要绿色荧光蛋白（GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
采用PCR技术，对实验室提供的质粒pEGFP-N1中的目的基因进行扩增。
所得PCR产物和质粒pET-28b经过BamH I和Nde I双酶切后，用琼脂糖凝胶电泳法检测酶切产物的酶切情况并回收凝胶，再利用T4DNA连接酶将目的基因与载体连接起来，得到重组质粒。
将重组质粒导入克隆菌E. coli DH5a中培养扩增，提取阳性菌落质粒进行重组子鉴定，进而导入表达菌E. coLi BL-21大肠杆菌感受态细胞中，经IPTG诱导目的基因表达产生绿色荧光蛋白。
关键词：绿色荧光蛋白 PCR 基因克隆表达1.前言1.1绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）绿色荧光蛋白是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光[1]。
1.2 GFP 的结构GFP中央是一个圆柱形水桶样结构，如图二。
长420 nm，宽240 nm，由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-GLy自身环化和氧化形成。
1.3 GFP的研究应用GFP可标记细胞和蛋白质，具有广泛的应用前景。
GFP及其突变体已被广泛应用于基因表达调控、蛋白质空间定位、生物分子之间相互作用、转基因动物]2[等方面。
基于新型功能荧光蛋白的光学分子成像技术的发展，为在活细胞乃至活体动物内研究基因表达和蛋白质功能提供了更多的选择空间。
GFP还用于观察微生物、发育机理研究、细胞筛选、免疫学等方面。
本实验是利用实验室提供的质粒pEGFP-N1,其结构如图三所示。
其上有所用酶的酶切位点。
信号肽及其在蛋白质表达中的应用
第九章 生物分子网络与通路
负调控
转录调控网络-2
转录调控网络-检测技术
ChIP是一项比较流行的研究转录因子与启动子相互
结合的实验技术。
CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法 已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选； CHIP-SEQ新一代测序技术。
基本流程
转录调控数据库
TRANSFAC数据库——MATCH软件
网络的基本概念
网络定义 有向网络与无向网络 加权网络与等权网络 二分网络
网络中的路径与距离
网络定义
网络定义：通常可以用图G=（V,E）表示网络。 其中， V 是网络的节点集合，每个节点代表一个生 物分子，或者一个环境刺激； E 是边的集合，每条边代表节点之间的相互关系。 当V中的两个节点v1与v2之间存在一条属于E的边e1 时，称边e1连接v1与v2，或者称v1连接于v2，也称作 v2是v1的邻居。
有向网络与无向网络
根据网络中的边是否具有方向性或者说连接一条边 的两个节点是否存在顺序，网络可以分为有向网络 与无向网络，边存在方向性，为有向网络，否则为 无向网络。
生物分子网络的方向性取决于其所代表的关系。
如调控关系中转录因子与被调控基因之间是存在顺 序关系的，因此转录调控网络是有向网络，而基因 表达相关网络中的边代表的是两个基因在多个实验 条件下的表达高相关性，因此是无向的。
人体经络网络 思考：如果 说经脉图就 是一个网络 的话，那么 网络的节点 应该是什么？ 网络的边又 应该是什么？
人体穴位就是该网络的节点，其医疗功能不同且相 互联系。 经络理论和针炙是网络科学初创时期有文字记载的 最早的人体生物网络模型及成功的医学应用。
发展历史-2
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蛋白质表达的基本原理及其在生物系统中的
作用
蛋白质是生物体内最为重要的分子之一，它在生命过程中扮演着重
要的角色。
蛋白质的表达是指生物体内基因通过转录和翻译的过程，
合成出相应的蛋白质分子。
本文将探讨蛋白质表达的基本原理以及蛋
白质在生物系统中的作用。
一、蛋白质表达的基本原理
蛋白质表达过程中涉及到两个关键的步骤：转录和翻译。
1. 转录
转录是指在细胞核内，DNA序列被转录成RNA分子的过程。
在DNA指导下，核酸聚合酶将DNA的信息转录成信使RNA（mRNA）。
这个过程包括三个步骤：起始、延伸和终止。
起始阶段，RNA聚合酶
与DNA的起始位点结合；延伸阶段，RNA聚合酶在DNA模板链上运动，合成与DNA互补的RNA链；终止阶段，RNA聚合酶在终止信号
的作用下，终止转录。
2. 翻译
翻译是指在细胞质内，mRNA上的遗传信息被翻译成氨基酸序列的
过程。
这个过程涉及到mRNA、核糖体和tRNA等多种分子的参与。
在翻译过程中，mRNA的信息由核糖体逐个三联密码子地识别，然后
与特定的tRNA分子结合。
tRNA携带着相应的氨基酸，当它与mRNA
上的三联密码子互补配对时，氨基酸就被加入到多肽链上，形成新的
肽键。
这个过程一直进行到整个mRNA被翻译完毕，最终生成一个完整的蛋白质。
二、蛋白质在生物系统中的作用
蛋白质在生物系统中具有多种重要的作用。
1. 结构支持
蛋白质在细胞和组织的结构中起着支持和保持稳定功能。
例如，胶原蛋白是皮肤和骨骼中的重要成分，它赋予皮肤弹性和组织的韧性。
纤维蛋白是肌肉中的主要组成部分，它提供肌肉的收缩功能。
2. 激素调控
一些蛋白质被称为激素，它们在生物体内发挥调节和控制的作用。
例如，胰岛素是一种蛋白质激素，调节血糖水平。
生长激素能够促进生物体的生长和发育。
3. 酶催化
许多生物化学反应需要酶的催化作用才能进行。
酶是一类特殊的蛋白质，它能够降低反应的活化能，从而加速反应的进行。
例如，胃蛋白酶在胃中催化食物的消化，DNA聚合酶在DNA复制中起到关键的作用。
4. 免疫防御
抗体是一类特殊的蛋白质，它们能够识别和结合外来的抗原分子，
从而触发免疫反应。
这种特异性识别和结合的能力使得抗体能够防御
细菌、病毒等病原体的入侵。
5. 运输传递
一些蛋白质能够在生物体内进行物质的运输和传递。
例如，血红蛋
白能够结合氧气，在循环系统中将氧气从肺部输送到身体其他部位。
载脂蛋白则负责在血液中运输脂质。
综上所述，蛋白质表达是生物体内基因转录和翻译的结果。
蛋白质
在生物系统中扮演着多种重要的作用，包括结构支持、激素调控、酶
催化、免疫防御以及运输传递等。
了解蛋白质的表达原理和作用机制，有助于我们深入理解生物体内的生命过程。