免疫组化SABC法与SV法的比较
免疫组化方法
（五）、神经内分泌标记物： 嗜铬素A（Chromogranin, CgA）：
存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。 突触素（Synaptophysin, Sy）：
生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
（二）显示物：
主要有： 1、酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphoeroaidase, HRP)
AP与不同的底物作用，可形成不同颜色的终产物。 与萘酚（As-Mx）和快蓝（Fast blue）作用； 与快红（Fast red）作用。 缺点：形成的沉淀溶于有机溶剂。
三、主要方法： （一）、直接法： （二）、间接法：特点：是经过了第二抗体放大
效应 （三）、PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体
形成复合物，通过第二抗体的桥接与第 一抗体结合，然后以酶底物反应检出。
（四）、ABC法：
生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具 有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4 个生物素。当生物素标上特定的标记物质后or与 抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结 合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的 生物素的结合反应，而以适当方式显示。
2）、对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计。
垂体腺瘤 ACTH
乳腺癌 ER
乳腺癌 c-erbB-2
六、免疫组化在病理诊断及鉴别诊断 和研究中的 应用
（一）、中间丝免疫组化的意义： 中间丝有五种：
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结
免疫组化常用方法介绍及个人经验总结1 、定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。
2 、原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。
3 、分类1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。
与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。
3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。
4 、目前几种常用免疫组化方法简单介绍1）免疫荧光方法是最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。
免疫组化操作流程
免疫组化操作流程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH 调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。
b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N 的HCl配制。
6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7）封裱剂：a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；b、油和TBS(或PBS)配制。
8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；2）无水乙醇中浸泡5分钟；3）95%乙醇中浸泡5分钟；4）70%乙醇中浸泡5分钟；2、抗原修复用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
1）抗原热修复（1）高压热修复在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。
盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。
将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化PPT课件
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未封闭内源性过氧化物酶
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胃固有膜腺体
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3．假阴性反应：
⑴ 组织固定不当或固定时间过长； ⑵ 抗体效价过低或久置失效； ⑶ 组织中抗原被粘稠基质或分泌物阻隔； ⑷ DAB或H2O2的浓度不当。
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五、免疫组织化学在肿瘤诊断和鉴别诊断 中的应用
（一）在肿瘤诊断中应用免疫组织化学染色的原因： １在常规病理活检中,通常有５～１０％的疑难病例不能明确诊断。 ２形态结构相似的肿瘤可为不同的组织来源（如未分化癌和恶性
在病理学外检工作中可用于对不同来源，HE难以诊断的的肿瘤进行确诊 和鉴别诊断。
其基本原理是应用抗原与抗体接触后可形成“抗原－抗体复合物”的化学 反应，以检测组织或细胞内抗原（或抗体）的技术。
2
Immunohistochemistry
Esophageal carcinoma
E-cad + in membrane Wu Ming-Yao et al.
图8
图9
图10 免疫组化结果： 肿瘤细胞Vimentin（+）
图11免疫组化结果：
肿瘤细胞（CD117+）
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抗原修复
从应用病理技术观点来看，福尔马林组织标本固定 术就像一把双刃剑：
福尔马林（10%甲醛溶液）是一经典的常规病理 诊断用组织样本固定剂，然而缺点是其对免疫组 织化学及原位杂交信号检测是有损害作用。
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
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（四）ABC法： 1981年美籍华人许世明发明了ABC法
Vector
口腔鳞癌组织中TLR4及NF-κB p65的表达和意义
口腔鳞癌组织中TLR4及NF-κB p65的表达和意义杨键;张国梁;关键【摘要】目的:讨论在口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinomas,OSCC)发生发展过程中Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)、核因子-κB p65(NF-κB p65)存在的作用.方法:采用免疫组化SABC法分别检测TLR4、NF-κB p65在11例癌旁正常组织和37例OSCC组织中的表达情况,讨论两者表达的相关性以及与OSCC中不同临床病理因素之间的关系.结果:TLR4、NF-κB p65的阳性率在OSCC组织中较癌旁正常组织高(P均＜0.05);TLR4、NF-κB p65的阳性率与OSCC组织的局部侵袭性、分化程度相关(P均＜ 0.05),NF-κB p65的阳性率还与淋巴结转移相关(P=0.023);TLR4、NF-κB p65在OSCC组织中的阳性率呈正相关(r=0.618,P=0.000).结论:TLR4、NF-κB p65对OSCC的发生发展有重要意义.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2016(039)002【总页数】3页(P47-49)【关键词】口腔鳞癌;核因子-κB p65;Toll样受体4;免疫组化【作者】杨键;张国梁;关键【作者单位】佳木斯大学研究生学院,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学附属第二医院,黑龙江佳木斯154002;佳木斯大学附属第二医院,黑龙江佳木斯154002【正文语种】中文【中图分类】R739.81口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinomas，OSCC)多发于鳞状上皮覆盖的部位，它的发病机制至今还未完全阐明。
90%左右的口腔颌面部恶性肿瘤为OSCC，并且近年来呈现逐渐上升且年轻化的趋势［1］。
它的致病因素复杂，不仅与外在因素如烟酒、物理、化学刺激相关，也与内在因素如精神、免疫、遗传相关。
法舒地尔对百草枯中毒大鼠肺组织肺纤维化α-SMA的影响
法舒地尔对百草枯中毒大鼠肺组织肺纤维化α-SMA的影响何旭娟;徐丽艳;朱立军;韩文文【摘要】目的观察法舒地尔在急性百草枯(PQ)中毒大鼠肺组织的干预作用及对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的影响.方法将72只SPF级SD大鼠随机分成正常对照组、法舒地尔对照组、PQ中毒组及法舒地尔干预组,分别于灌胃后7、14、28d活杀大鼠留取标本.观察大鼠的行为学改变、HE和Masson染色观察大鼠肺组织病理改变,实时荧光定量PCR及免疫组化法检测α-SMA的表达水平.结果光镜下,PQ中毒组大鼠急性肺损伤和纤维化明显,法舒地尔干预组大鼠肺组织损伤程度较中毒组减轻.与正常对照组比较,PQ中毒组大鼠肺组织7、14、28 d α-SMAmRNA及蛋白的表达量显著增高,于28 d时达峰值,差异有统计学意义(均P＜0.05);与同一时间PQ中毒组比较,法舒地尔干预组小鼠肺组织α-SMAmRNA及蛋白表达量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论法舒地尔可以减轻百草枯所致大鼠肺纤维化程度,其可能是抑制α-SMA的表达实现的.【期刊名称】《现代实用医学》【年(卷),期】2016(028)007【总页数】4页(P881-883,封3)【关键词】肺纤维化;α-SMA;百草枯;法舒地尔【作者】何旭娟;徐丽艳;朱立军;韩文文【作者单位】315040宁波,宁波市医疗中心李惠利医院;315040宁波,宁波市医疗中心李惠利医院;315040宁波,宁波市医疗中心李惠利医院;315040宁波,宁波市医疗中心李惠利医院【正文语种】中文【中图分类】R459.71.1 实验动物SPF级健康雄性SD大鼠72只，200～230 g，10周龄左右，杭州动物实验中心提供，动物合格证号为SCXK（浙）2014-0001。
1.2 实验材料注射用法舒地尔（红日药业股份有限公司，中国天津）；20%PQ 溶液（天海科技有限公司，山东济南）；-SMA抗体、免疫组化试剂盒（上海士锋生物科技有限公司）。
免疫组化abc法名词解释
免疫组化abc法名词解释
免疫组化ABC法是一种用于检测蛋白质在组织切片中表达的方法。
这种方法通常用于病理学研究和临床诊断中。
ABC法的全称是Avidin-Biotin Complex法，它利用了生物素和亲和素之间的特异性结合来实现对蛋白质的检测。
在ABC法中，首先需要利用一种特异性的抗体来与待检测的蛋白质结合。
这个抗体通常被称为一抗，它可以识别并结合到特定的蛋白质上。
接下来，将生物素标记的二抗加入样本中，这些二抗能够与一抗结合。
然后，将含有酶的生物素-链霉素复合物（ABC）加入样本中，这个复合物可以结合到二抗上。
最后，加入染色底物，这样就可以通过显色反应来观察蛋白质的表达情况。
ABC法的优点包括灵敏度高、特异性好、操作简便等，因此被广泛应用于免疫组化实验中。
然而，也需要注意到ABC法在操作过程中可能存在的非特异性结合和背景信号的问题，需要进行严格的实验控制和数据分析。
总的来说，免疫组化ABC法是一种重要的实验技术，它通过利
用生物素和亲和素的结合特性，能够有效地检测组织切片中蛋白质的表达情况，对于研究和诊断具有重要意义。
免疫组化实验流程及常见问题
免疫组化实验流程及常见问题1 免疫组化概念原理2 免疫组化染色步骤目录3 结果分析4 常见问题分析※免疫组化原理PART 1免疫组化概念原理※免疫组化样本种类免疫组化概念原理免疫组化学（immunohistochemistry，IHC）应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对定量的研究样本种类：组织标本和细胞标本两大类，包括石蜡切片（IHC-P）和冰冻切片(IHC-P)，细胞片(ICC)。
※实验步骤流程图※样本取材固定PART 2免疫组化染色步骤※实验步骤讲解实验流程图种器官，优先取消化器官，其次取中枢神经系统器官(脑，脊髓等)，皮肤、肌肉等可放到最后取。
3.组织块大小：未经灌注的标本组织厚度不要超过1cm 。
5.固定液量：固定液体积为组织的10倍，且组织能在容器内自由移动，不贴壁不沉底，并做好清晰标记。
4.固定液：针对不同的标本特点及实验目的一定要选用正确的固定液，4%多聚甲醛，有致密外膜Carnoy 液，活检用Bouin 。
7.固定温度：常温即可，无需冷藏，切勿冷冻结冰，否则固定液结冰形成冰晶严重破坏组织形态结构6.固定时间：6-24h最佳，固定越久所需修复强度越大，容易出现非特异性。
取材及固定切片选择要保存简单--- 选石蜡片!要速度快---选冰冻片!要结构漂亮---选石蜡片!抗原不稳定---选冰冻片!抗原稳定---石蜡片冰冻片皆可!组织形态结构保存完好顺序：新鲜组织立即投入固定液内固定石蜡切片>组织-80°冷冻后投入固定液内固定石蜡切片>新鲜组织立即投入固定液内固定冰冻切片>组织-80°冷冻后直接冰冻切片。
切多厚?脱蜡步骤石蜡片3-8um ， 一般4-5um;冰冻片5- 15pm,一般8μm水温40-45 ℃, 组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起怎么捞片?烤多久?37 ℃ 过夜或 60 ℃ 1-2h 注意:使用防脱处理的玻片实验步骤切片烤片实验步骤：灭活1内源性过氧化物酶在血管瘤、肝、胎盘、阑尾炎,坏死区域和急性炎症组织含量较高 2显色系统为过氧化物酶 (HRP )系统，该步骤建议一定要做3碱性磷酸酶 (AP )系统以及免疫荧光，该步骤可以不做4在灭活时,如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用 3%H2O2溶液难以完全阻断，可以用0.5%高碘酸溶液室温条件孵育10min实验步骤柠檬酸盐缓冲液( PH6.0 )和EDTA( PH8.0或9.0)修复液经验证，对于大多数的抗体来说后者使用效果更优固定时间越久，修复强度越强旧标本修复强度强于新鲜标本3修复液的选择1 抗原修复方式4消化酶的选择需格外注意的各种消化酶的最佳工作PH值2消化酶的选择抗体选择1单抗和多抗各有优势，按需选用2 一抗4°C孵育效果最佳，备选37 ℃ 1-2h 3二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配，推荐驴，山羊,绵羊等种属4二抗/SABC -般37 ℃孵育30 min 封闭1 5%BSA是最常用2血清，效果最全面3封闭血清与抗同源，与一抗不能同源封片1 DAB显色用中性树胶封片2免疫荧光建议用抗荧光衰减封片剂3 AEC显色用水溶性封片剂显色1 DAB显色液现用现配2建议镜下控制反应时间3根据显色时间反向优化实验条件※抗原定位※结果分析方法PART 3结果分析抗原定位胞膜型表达胞核型表达胞质型表达胞膜-质型表达胞核-质型表达抗原定位查数据推荐：01 Option here02Option here 评分法:通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度( 0-3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围进行评分(1-4分为0-25%、26 -50%、51-75%、76-100%) ，最终可以分数想加，再进行比较阳性着色细胞计数法:在40X光镜下,随机选择不重叠的3-5个视野，人工或机器计数阳性着色细胞和总细胞数，比较阳性细胞比率图片软件分析:通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用图片分析软件进行分析，然后进行统计分析即可H-SCORE分析:设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。
病理学技术-免疫组织化学技术
显示系统
免疫过氧化酶染色的多种方法中，其主要的不同点在于显色 系统的差异，常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸 酶(AP)及葡萄糖氧化酶(GOD)等，通过图像分析还可达到定 量的目的。
免疫组化染色方法的类别
直接法 间接法 PAP法 ABC法 LSAB法 一步法（EPOS法） 二步法（Envision法）
免疫组化应用中的注意事项
(二)对假阳性的原因有： ①抗体与多种抗原有交叉反应；
②抗体与组织中的某些成分的非特异性结合；
③内源性酶的显色；
④肿瘤或病变中有其他组织残留，尤其是肿瘤中 残余少量的正常组织，而正常组织此时又有一定 程度的增生或萎缩时，易将其误认为肿瘤成分
特定的定位：特定的组织；特定的细胞； 特定的细胞内的部位；
着色的不均一性：分布上不均一；着色强 度的不均一；
颗粒性显色：DAB显色剂应为棕黄到棕褐 色
假阴性的原因分析及对策
抗原的丢失 标本固定不及时、固定过久，浸蜡时间、温 度过高，均可将抗原性破坏 抗原的遮蔽 福尔马林固定石蜡包埋后，其抗原性因分子 交联而被遮蔽 修复抗原，包括蛋白酶消化、微波加热处理
它能结合一抗和酶分子，起到载体的作用。
一步法多聚物载体试剂是多聚物结合特异 性一抗和辣根过氧化酶，二步法多聚物载 体试剂是一种能与二抗相联结的由HRP标 记的多聚物。
一步法（EPOS）及两步法（Envision）比较
免疫组化染色结果的判 断及异常着色的原因分析及其对策
免疫组化染色结果的判断 特异性着色具备特点：
免疫组化的优点
由于免疫组化的应用，在现代医学的基础和临床研究中发挥着 重要的作用，对疾病，尤其是对肿瘤的诊断、鉴别诊断及发病 机制的研究提供了强有力的手段，已经使组织和细胞中所属具 备抗原性的成分均可以用来制备出相应的抗体，然后进行组织 和细胞中相应抗原的定位显示。
免疫组化SABC法操作流程表
免疫组化SABC法操作流程注意事项1.片子着色不均匀的原因如下：1.脱蜡不充分。
可以60 ℃烤20 min，立即放入新鲜的xylene1；2.水化不全。
应经常配制新鲜的梯度乙醇；3.抗体没混匀。
用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；4.抗体孵育时，切片放倾斜；5.抗体孵育后PBS冲洗不充分。
6.制片厚薄不均匀等问题。
染片盒不平，切片倾斜。
2.切片染色后背景太深，不易区分特异性与非特异性着色？o抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。
这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制；o一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；o内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高，需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；o非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；o DAB显色时间过长或浓度过高；o PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色；o标本染色过程中出现干片，易增强非特异性着色。
试剂配制3%过氧化氢甲醇：30% H2O2 10ml + 纯甲醇90ml→充分混匀0.3%过氧化氢甲醇：30% H2O2 1ml + 纯甲醇99ml→充分混匀免疫组化专用PBS（pH7.2—7.6）：Na Cl 8.5g+磷酸氢二钠（无水）2.8g+磷酸二氢钠（无水）0.4g溶于双蒸水并定容至1000毫升。
然后测pH值使之在7.2—7.6。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
0.3%Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)：Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），分子量为646.86（C34H62O11）。
它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。
贮存液：30% Triton X-100：Triton X-100 28.2ml + 0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4) 72.8ml，37℃水浴中2～3h工作液：0.3%Triton X-100 ：30% Triton X-100 2ml用0.1mol/L PBS(pH7.3)或0.05mol/l TBS(pH7.4)定容至200ml。
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博士德免疫组化SABC法与SV法的比较
发布时间：2011-12-08 22:38 点击次数： 186
免疫组化
SABC法与SV法的比较
SABC法：ABC代表的是亲和素－生物素－过氧化物酶复合物。利用抗生物素分别
连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。SABC（链霉亲和素生物素过氧化物酶复合
物）就是StreptAvidin Biotin Complex的英文缩写。这一方法集中体现了目前最先进的免
疫组化所必必具备的高敏感性、特异性及操作快速、简便的所有特征。
基本原理：亲和素（Avidin）存在于鸡蛋中，分子量67000。是一种碱性蛋白质，具
有对生物素近乎于共价键的结合力。链霉亲和素是一种从链霉菌（Streptomyces Avidinii）
培养物中所提取的蛋白质，分子量47000，不含糖链，等电点IP=6.0-6.5。和亲和素一样，
也有四个生物素结合位点，亲和力高达10-15M。和亲和素相比，链霉亲和素更为完美。
现在经过改进的亲和素等电点IP可以达到7.0，明显地消除了原碱性蛋白特征所引起的非
特异性吸附。
生物素是一种水溶性维生素（即维生素H），分子量244。生物素活化后，可以标记
抗体和酶而不影响其活性。链霉亲和素—酶复合物可以起到放大信号的作用，这是SABC
具有高度敏感性的基础。
SV（Super Vision）两步法：是用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成
类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚合物，替代传统方法中的二抗和三抗。这种聚合物拥有强
大的信号放大能力，同时有很强的组织细胞渗透力，经检测其灵敏度高于同类产品，特别
是针对核抗原，其渗透性特别强，适合免疫组化的应用。此系列检测试剂与传统的三步法
比较具有简单，快速，高敏感，低背景等特点。
原理示意图：
用聚合标记方法将过氧化物酶连接到二抗上，形成类似于章鱼的超大分子抗体-酶聚
合物
现对这两种方法进行比较：
一．材料
所选试剂：
即用型SABC（过氧化物酶）试剂盒（博士德货号SA1021，SA1022）
即用型SV（HRP辣根过氧化物酶）试剂盒（博士德货号SV0001，SV0002）
DAB（黄色，博士德货号AR1022）
Mayor`s苏木素（博士德货号AR0005）
所选一抗：
KCA3.1（BA1788）；PCNA（BM0104）；Vimentin（BM0135）
注：抗体来源均为博士德公司
所选组织片：乳腺癌石蜡切片，肠癌石蜡切片，切片厚度为5微米
二．操作步骤
SABC法：
1.切片脱蜡至水
2.新鲜配置3%H2O2,室温10分钟,灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗2分钟三次
3.微波修复：将切片放入盛有PBS缓冲液（PH7.2-7.6）的杯子中，在微波炉里加热
煮沸，微波炉中静置５分钟，拿出室温冷却６分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却
4.滴加5%BSA封闭液,37℃反应30分钟。甩去多余液体,不洗
5.滴加一抗，4℃反应过夜。所配一抗的浓度为1µg/ml
6.PBS缓冲液（PH7.2-7.6）洗1０分钟×3次，滴加生物素化二抗IgG（抗兔或抗鼠）
37℃反应30分钟
7.PBS缓冲液（PH7.2-7.6）洗1０分钟×3次，滴加试剂SABC，37℃反应30分钟
，
PBS洗3０分钟×3次
8. DAB室温显色,镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤
9. 滴加苏木素轻度复染60秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和Na2HPO4溶液中2分钟，取
出后洗涤，３７℃恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。
SV法：
1.切片脱蜡至水
2.新鲜配置3%H2O2,室温10分钟，灭活内源性酶，然后用蒸馏水冲洗2分钟三次
3.微波修复：将切片放入盛有PBS缓冲液（PH7.2-7.6）的杯子中，在微波炉里加热
煮沸，微波炉中静置５分钟，拿出室温冷却６分钟，再微波续热至沸腾后完全室温冷却
4.滴加5%BSA封闭液，37℃反应30分钟。甩去多余液体，不洗
5.滴加一抗，4℃反应过夜，所配一抗的浓度为1µg/ml
6.PBS缓冲液（PH7.2-7.6）洗1０分钟×3次，滴加HRP标记二抗IgG （抗兔或抗
鼠）37℃反应30分钟，PBS缓冲液（PH7.2-7.6）洗30分钟×3次
7.DAB室温显色,镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤
8. 滴加苏木素轻度复染60秒，蒸馏水洗涤后浸入饱和Na2HPO4溶液中2分钟，取
出后洗涤，３７℃恒温箱干燥过夜，中性树胶封片。
三.结果比较
四．结论
SABC法的特点：
1.稳定性好：链酶亲和素结合生物素的亲和常数是抗原结合抗体反应的百万倍，二者
结合形成复合物的解离常数很小。因此，SABC法在实际应用中，稳定性高，减少了操作
误差，提高了检测的精确度
2.特异性高：链酶亲和素与生物素间的结合具有极高的亲和力，其反应呈高度特异性。
因此，SABC法的多级放大作用不仅可以提高检测的灵敏度，同时还避免了非特异性干扰
3.高敏感性：生物素容易与蛋白质和核酸类等生物大分子结合，形成生物素衍生物结
构，该结构具有保持大分子物质的原生物活性功能，同时，每个链酶亲和素分子有四个生
物素结合部位，可以多价形式同时结合生物素化的大分子衍生物和酶标记物。因此，SAB
C法具有多级放大作用，使其在免疫组化实验时大大地提高检测方法的灵敏度
SV法的特点：
1.背景染色低：由于不用亲和素，避免了内源性生物素干扰，减少了假阳性、降低了
背景染色
2.操作简便快速：仅需进行两次抗体孵育，更为简单、快速
3.核抗原染色强：多聚酶紧密连接在免疫球蛋白分子上，由于没有惰性多聚物骨架总
体分子量相对较小，克服了大分子复合物穿透力弱、核抗原不易染色的缺点
4.敏感性较高：显色结果可以达到比较满意的效果
总结上述特点，SABC法与SV法各有优势，可根据自身的实验条件选取合适的实验
方法