土壤中的硝酸还原酶活性
硝酸还原酶
植物体内硝酸还原酶活力的测定 P56—59 硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键美，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐：NO3—＋NADH＋H+ →NO2—＋NAD++H2O产生的亚硝酸盐与对—氨基苯磺酸（或对—氨基苯磺酰胺）及α—萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。 生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度计法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即ug·g—1·h—1为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性好。 一、离体法 仪器与用具： 冷冻离心机；分光光度计；天平；冰箱；恒温水浴锅；研钵；剪刀；离心管；具塞试管（10ml）；移液管（5、2、1ml）；洗耳球。 试剂： 亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于去离子水定容至1000ml，然后再吸收5ml定容至1000ml，即为含亚硝态氮1ug/ml的标准溶液； 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液：Na2HPO4·12H2O 30.0905g与NaH2PO4·2H2O 2.4965g加去离子水溶解后定容至1000ml； 1%（W/V）溶液：1.0g对氨基苯磺酸溶于100ml 3mol/L HCl中（25ml浓盐酸加水定容至100ml即为3mol/L HCl）； 0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.0200g萘基乙烯胺溶于100ml去离子水中，贮于棕色瓶中； 0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液中； 0.025mol/L PH 8.7的磷酸缓冲液：8.8640g Na2HPO4·12H2O ，0.0570g K2HPO4·3H2O加去离子水溶解后定容至1000ml； 提取缓冲液：0.1211g半胱氨酸，0.0372g EDTA溶于100ml 0.025mol/L PH8.7的磷酸缓冲液中； 2mg/ml NADH溶液：2mg NADH溶于1ml 0.1mol/L PH 7.5 的磷酸缓冲液（临用前配置）。 方法： 1. 标准曲线制作
实验9 硝酸还原酶活性的测定
实验9 硝酸还原酶活性的测定 一、目的 学会植物组织中硝酸还原酶活性的测定方法。 二、材料用具及仪器药品 木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、洗耳球 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.5）、0.2mol/L KNO3）；磺胺试剂、a-苯胺试剂，NaNO2 标准溶液： a—萘胺试剂配制：0.2克a—萘胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml。 磺胺试剂配制：取1克磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水稀释至100ml. NaNO2标准溶液：1克NaNO2用蒸馏水溶解，定量至1000ml，然后吸取5ml，再加蒸馏水定量至1000ml，该溶液每ml含有NaNO25ug，用时稀释之。 磷酸缓冲液： 贮备液A：0.2mol/L NaH2PO4溶液（27.8g NaH2PO4·H2O配成1000ml）。 贮备液B：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（53.65g Na2HPO4·7H2O或Na2HPO4·12H2O 配成1000ml）取A液16ml+B液84ml，用水稀释至200ml 三、原理 硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮肥有关，它作用于NO—3还原于NO—2 NO—3+NADH+NO—2+NAD++H2O 产生的NO-2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定反应溶液中NO-2的含量的高低，即表明酶活性的大小。 NO-2含量的测定用磺胺（对氨基苯磺酸胺sulfanil—amide）比色法，这种方法非常灵敏，能测定每m10.5ug的NaNO2。 四、方法步骤 1．将新鲜叶片（蓖麻、烟草、木茨叶等）水洗，用吸水纸吸干水分，然后用1cm的钻孔器钻取的圆片，在天平上称取等量的叶圆片两份，每份0.5克，（或每份取50个叶圆片），分别置于含有下列溶液的三角瓶中，（1）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+蒸馏水5ml。（2）0.1mol/L磷酸缓冲溶液5ml+0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，叶圆片即沉于溶液中，（如果没有真空瓶，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶片一起倒入注射器内,，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使之真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使叶圆片中的空气抽去，并沉于溶液中），将三角瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸取反应溶液1ml，以测定NO-2含量。 注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可在反应溶液中加入30μmol/L 的 3—磷酸甘油醛或1.6——二磷酸果糖，能显著增加NO-2的产生。 2．NO-2含量的测定 保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，先加入磺胺试剂2ml，后加入一
土壤硝酸还原酶(Solid-Nitrate Reductase,S-NR)试剂盒说明书
货号：MS2938 规格：100管/48样土壤硝酸还原酶（Solid-Nitrate Reductase，S-NR）试剂盒说明书 微量法 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： S-NR催化土壤中硝酸盐还原为亚硝酸盐，是土壤硝态氮还原的关键酶。研究S-NR的活性对合理施肥，降低氮素的损失具有重要意义。 测定原理： S-NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋ +H 2 O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α- 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 试剂一：液体12mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体4mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体9mL×1瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）。 试剂四：液体9mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：标准品储备液1mL，-20℃保存。 0.1μmol/mL标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml 加蒸馏水定容至10ml。 样品处理： 新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。 测定步骤： 1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 第1页，共2页
96孔板中，540nm下读取各管吸光值。标准管和空白管只需测一次。每个测定管设一个对照管。 S-NR活性计算： ˉ的量为一个 S-NR活力单位。 单位的定义：每天每g土样中产生1μmol NO 2 S-NR（μmol /d/g）=C标准×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）×V反总÷W÷T =12×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管） C标准管：标准管浓度，0.1μmol/mL；V反总：反应体系总体积，0.3mL；T：反应时间，1h=1/24d；W：样本质量，0.06g。 第2页，共2页
硝酸还原酶(Nitrate Reductase,NR)活性测定试剂盒使用说明
硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒使用说明 可见分光光度法50管/24样产品简介： NR（EC1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。 NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 产品内容： 诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体20mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。 诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。
0.1umol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml试剂五加9.9mL 蒸馏水，充分混匀。 操作步骤： 一、样品测定的前处理： 1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理） 2、称取约0.1g样本，加入1mL提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心10min，取上清冰上放置待测。 二、NR测定操作： 1，分光光度计预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2，样本测定（在EP管中加入下列试剂） 试剂名称（μL）测定管对照管标准管空白管 样本100100 0.1μmol/mL NaNO2100 双蒸水500100 试剂一375375375 试剂二125125125 混匀后，37℃（哺乳动物）或25℃(其他物种）水浴30min 试剂三250250250250 试剂四250250250250 混匀，显色20min，4000g常温离心10min，取上清，540nm下比色。
食品添加剂硝酸盐亚硝…
食品添加剂硝酸盐亚硝酸盐的毒性和人体健康的危害 毒理与功能评价所陈新霞奚清丽王民生 常见的硝酸盐(nitrate)为硝酸钠，为白色细小结晶状粉末，稍带淡灰色或淡黄色，无臭，味略苦咸，易潮解和溶于水，其水溶液为中性，高热时分解为亚硝酸钠。硝酸盐广泛用作于食品加工业中的发色剂和防腐剂。 亚硝酸盐(nitrite)俗称“硝盐”，外观及滋味都与食盐相似，人们通常称为“工业用盐”。亚硝酸盐主要指亚硝酸钠，它是一种白色或淡黄色结晶状颗粒或粉末，无臭，味咸稍带苦味，易潮解，易溶于水，难溶于乙醇和乙酸，其水溶液的pH为9，能缓慢吸收空气中的氧而转变为硝酸钠。亚硝酸盐主要用于生产各种染料和某些有机合成、金属表面的热处理，也常在肉类制品中允许作为发色剂限量使用。 硝酸盐和亚硝酸盐广泛分布于自然环境，主要来源是含氮肥料的大量使用。食品、燃料、炼油等工厂排入环境和水体中的大量含氮废弃物和氮氧化物，经过生物、化学转换后均形成硝酸盐，而造成地表水和地下水的硝酸盐污染，在硝酸盐还原菌的作用下，硝酸盐还原成亚硝酸盐。无机、有机含氮肥料和农药的大量使用，导致土壤中硝酸盐富集化，菜根从土壤中获取养分的同时，也摄入了大量硝酸盐，一些蔬菜如卷心菜、花椰菜、胡萝卜、芹菜、菠菜等通常含有很高的硝酸盐（1000 ～3000mg／kg），一般成年人每天摄入的硝酸盐约100mg 。蔬菜中的硝酸盐，在腌制过程中极易被还原成亚硝酸盐。在食品加工中，硝酸盐和亚硝酸盐常作为肉制品的发色剂添加于食品原料中，以增加腌肉制品的色泽和抑制微生物的繁殖及毒素的产生，来延长保质期和提高腌肉的风味。 人体主要通过饮食摄入过多的硝酸盐与亚硝酸盐，这两种物质在我国A级绿色食品中不得使用。1994年联合国粮农组织和WHO规定了硝酸盐和亚硝酸盐的每日容许摄入量（ADI 值）分别为5mg／kg和0.2mg／kg。我国食品安全国家标准食品添加剂使用标准（GB2760-2011）规定，在肉制品中硝酸盐(硝酸钠，硝酸钾)的最大使用量不得超过500mg ／kg，亚硝酸盐的最大使用量不得超过150mg／kg。在肉制品中亚硝酸盐的最终残留量不得超过30mg／kg，肉罐头中不得超过50mg／kg。婴儿对硝酸盐和亚硝酸盐敏感，因此，欧共体建议亚硝酸盐不得用于婴儿食品，硝酸盐应限制使用。 硝酸盐与亚硝酸盐主要从消化道进入人体。含有大量硝酸盐的饮水、粮食、鱼、肉制品、蔬菜、渍酸菜、隔夜炒菜等食用后，在口腔可被唾液中硝酸盐还原酶还原成亚硝酸盐进入人体。 唾液腺可以浓缩富集硝酸盐并分泌到口腔中，唾液中的硝酸盐水平是血液中的20倍。Xia等比较了Sjogren综合征、腮腺良性肥大患者和健康成人的腮腺液、混合唾液、血液和尿液中硝酸盐、亚硝酸盐含量后发现，Sjogren综合征患者混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐的总量均明显低于健康对照组和腮腺良性肥大组，而Sjogren综合征患者尿液中硝酸盐、亚硝酸盐的总量均明显高于健康对照组。Xia等还通过建立小型猪腮腺破坏萎缩的动物模型来进行硝酸盐负荷实验研究，结果发现当双侧腮腺破坏后混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐含量明显降低，给予硝酸盐负荷后腮腺破坏组混合唾液中硝酸盐、亚硝酸盐升高的幅度明显低于对照组，而尿液中的硝酸盐含量却明显高于对照组。说明腮腺是机体硝酸盐代谢的重要器官,而机体维持高浓度的唾液硝酸盐含量可能与口腔抗菌作用有关。 唾液中的硝酸盐随吞咽运动进入胃中,在正常情况下在胃和十二指肠重吸收入血，经血循环回到唾液腺，再次分泌到唾液中，经历了从十二指肠→唾液腺→口腔→十二指肠的循环过程，这种循环使硝酸盐不断地在口腔被还原成亚硝酸盐，人体内80%亚硝酸盐都是从这个循环得到的。在病理情况下，如一些疾病导致胃酸过低时，胃液中的一些硝酸盐还原菌活性增强，也可使硝酸盐还原为亚硝酸盐。Hunault的研究表明硝酸盐在胃肠道高吸收，而在
土壤中反硝化细菌的分离
土壤中反硝化细菌的分离、纯化 邓晓娟查美玲曹娟芳 （江西师范大学生命学院南昌330022） 摘要： 关键词：反硝化细菌，反硝化作用，硝酸盐 Abstract: Key words: 氮素是水体污染中的一类重要的污染物，对人体健康和环境有极大的危害。近几十年来，规模日益扩大的水产养殖业造成水体中积累大量的鱼类粪便、残饵和死亡的动植物尸体，导致水体氮素含量严重超标，养殖生态环境遭到破坏，鱼虾病害频发，最终造成巨大的经济损失。硝化作用由亚硝酸盐细菌和硝酸盐细菌将氨化合物氧化为亚硝酸盐和硝酸盐；反硝化作用也称脱氮作用，由微生物在厌氧或微厌氧条件下将硝酸盐还原成氧化亚氮或氮气，因此，硝化作用与反硝化作用在维持自然界氨的平衡及氮的正常循环中扮演着非常重要的作用。 具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50多个属，约有150余种，绝大部分属于变形细菌纲(Proteobacteria)中的α和β簇群[]。反硝化细菌能将硝态氮或亚硝态氮还原成含氮气体或氮气，不过并不是所有的反硝化细菌都能进行完全的反硝化过程，编码亚硝酸盐还原酶的基因才是反硝化细菌的关键功能基因，在进行反硝化的分子生态学研究中也主要以nirS 或nirK基因作为分子标记。 传统上认为反硝化作用只有在厌氧或缺氧条件下发生，但是在水处理过程中也观察到好氧反硝化现象。尽管有人将好氧反硝化现象的发生归因于微环境中的厌氧条件，但是目前已有相当数量的好氧反[2]、Pseudomonas aeruginosa[l4,15]、Pseudomonas stutzeri [13,16,17] 、Alcaligenes sp．[18,19]。被分离并进行了深入研究，证实好氧反硝化细菌确实存在。本实验拟从花圃土壤中分离纯化反硝化细菌，对菌株进行初步鉴定，并对菌株的反硝化能力进行研究，旨在分离得到反硝化能力高的菌株，为实际应用提供依据。 1 材料 1.1培养基 富集培养基(即反硝化选择性培养基)：硝酸钾2g、硫酸镁0.2g、磷酸氢钾0.5g、酒石豫钾钠20g、蒸馏水1000ml；pH约7.2。 分离培养基：在富集培养基中琼脂即可。 纯化培养基：采用LB培养基。胰蛋白胨10g,酵母提取物5g/L，氯化钠10g,琼脂粉15g,NaOH调pH到7.2，加蒸馏水至1L。 1.2实验试剂 浓硫酸，水杨酸，硝酸钾，无菌水，革兰氏染液等。 1.3实验仪器 培养箱，超净工作台，可见分光光度计，移液管，试管，锥形瓶等。 2.方法 2.1分离纯化 土样1g加入到100ml的富集培养基中，30℃静置密闭培养2d后，l0倍稀释涂分离培
土壤亚硝酸还原酶(S-NiR)活性检测试剂盒说明书 可见分光光度法
第1页，共3页 土壤亚硝酸还原酶（S-NiR）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号：BC2990规格：50T/24S 产品内容： 试剂一：粉剂×1支，4℃保存。加入1mL蒸馏水溶解，4℃保存2周。临用前用蒸馏水稀释400倍，现用现配。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加15mL蒸馏水溶解，4℃保存2周。试剂三：液体15mL×1瓶。此溶液为饱和溶液，取上清使用即可。试剂四：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。试剂五：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：粉剂×1支，4℃保存。10mg亚硝酸钠，临用前加入1.45mL蒸馏水配成100μmol/mL的标准溶液。4℃保存2周。产品说明： 土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）是反硝化作用中的关键酶之一，它是由土壤反硝化细菌产生的一种还原酶类，可将NO 2- 还原为NO，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。 亚硝酸还原酶可将NO 2-还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO 2-减少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、30目（或更大）筛、冰和蒸馏水。测定操作： 1、样本处理：新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30-50目筛。
2、操作步骤： （1）可见分光光度计预热30min，波长调至540nm。蒸馏水调零。 （2）将标准溶液用蒸馏水稀释为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125μmol/mL的标准溶液。（3）加样表： 无机质管空白管1对照管测定管标准管空白管 风干土样（g）--0.10.1-- 蒸馏水（μL）-200200--- 试剂一（μL）200--200-- 试剂二（μL）200200200200-- 混匀后，25℃反应3h 试剂三（μL）200200200200--充分震荡30s，10000rpm，4℃，离心10min-- 上清液（μL）400400400400-- 标准品（μL）----400- 试剂四（μL）400400400400400400 试剂五（μL）400400400400400400 蒸馏水（μL）300300300300300700充分混匀，室温放置15min后测定540nm各管吸光值，分别记为A无机质管、A空白管1、A对照管、A 测定管、A标准管和A空白管2，计算ΔA测定=（A无机质管-A空白管1）-（A测定管-A对照管），ΔA标准=A标准管-A空白管2。无机质管、空白管1、空白管2只需做1-2次。 3、S-NiR计算: （1）标准曲线的绘制： 以标准溶液的浓度为x轴，以标准溶液对应的ΔA为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b,将ΔA 测定带入标准方程得到x（μmol/mL）。 （2）S-NiR的计算： ˉ的量为一个酶活力单位。 酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO 2 S-NiR（U/g土样）=x×V反应÷W÷T= 4.8×x÷W T：反应时间，3h=1/8d；V反应：反应体系体积，0.6mL；W：土样质量，g。 第2页，共3页
硝酸还原酶的测定方法
硝酸还原酶的测定方法 硝酸还原酶活性的测定原理硝酸还原酶是植物氮素代谢作用中关键性酶，与作物吸收和利用氮简单易行，在一般条件下都能做到。红色的偶氮染料。反应液的酸度大则增加重氮化作用的速度，但降低偶联作用的速度，颜色比较稳定。增加温度可以增加反应速度，但降低重氮盐的稳定度，所以反应需要在相同条件下进行。这种方法非常灵敏，能测定每ml含0.5μg的NaNO2。仪器药品721型分光光度计真空泵（或注射器）保温箱天平真空干燥器钻孔器三角烧瓶移液管烧杯0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.5（见附表2）。0.2mol/L KNO3：溶解20.22g KNO3于1000ml 蒸馏水器中。磺胺试剂：1g磺胺加25ml浓盐酸，用蒸馏水器稀释至100ml。α—萘胺试剂：0.2gα—萘胺溶于含1ml浓盐酸的蒸馏水器中，稀释至100ml。NaNO2标准溶液：1g NaNO2用蒸馏水器溶解成1000ml。然后吸取5ml，再加稀释成1000ml，此溶液每ml含有NaNO2 5μg，用时稀释之。操作步骤 1. ．将新鲜取回的叶片（蓖麻、烟草、向日葵、油菜、小麦、棉花等均可）水洗，用吸水纸吸干，然后用钻孔器钻成直径约1cm的圆片，用洗涤2梍3次，吸干水分，然后于台天平上称取等重的叶子圆片两份，每份约0.3—0.4g（或每份取50个圆片），分别置于含有下列溶液的50ml三角烧瓶中：(1)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 5ml；(2)0.1mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.5)5ml 0.2mol/L KNO3 5ml。然后将三角烧瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气，放气后，圆片即沉于溶液中（如果没有真空泵，也可以用20ml注射器代替，将反应液及叶子圆片一起倒入注射器中，用手指堵住注射器出口小孔，然后用力拉注射器使真空，如此抽气放气反复进行多次，即可使圆片中的空气抽去而沉于溶液中）。将三角烧瓶置于30℃温箱中，使不见光，保温作用30分钟，然后分别吸注意取样前叶子要进行一段时间的光合作用，以积累碳水化合物，如果组织中的碳水化合物含量低，会使得酶的活性降低，此时则可于反应溶液中加入30μg3—磷酸甘油醛或1，6—二磷酸果糖，能显著增加保温30分钟结束时，吸取反应溶液1ml于一试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟，用比色计进行比色测 3. ．绘制标准曲线与重氮化作用及偶联作用的速度有关，温度、酸浓度等都影响显色速度，同时也影响灵敏度，但如果标准与样品的测定都在相同条件下进行，则显色速度相同，彼此可以比较。吸取不同浓度的NaNO2溶液（例如5、4、3、2、1、0.5μg/ml）1ml于试管中，加入磺胺试剂2ml及α—萘胺试剂2ml，混合摇匀，静置30分钟（或于一定温度的水俗中保温30分钟），立即于分光光度计中进行测定，测定时的波长为520nm，比色，读取吸光度或透光率。然后，以吸光度为纵坐标，NaNO2浓度为横坐标。于毫米方格纸上绘制吸光度—浓度曲线。实验作业1．试比较不同植物的酶活性。2．试比较取样前植物处于照光或黑暗条件下酶活性的不同。参考文献1．陈薇、张德颐：1980。植物组织中硝酸还原酶的提取测定和纯化，植物生理学通讯，1980(4)：45—49。2．周树、郑相穆：1985。硝酸还原酶体内分析方法的探讨，植物生理学通讯，1985(1)：47—49。3．Hageman,R.H.and D.P. ．Hucklesby:1971.Methods in Enzymology,23A:491—503. 4．Radin.J.W.:1973.Plant Physiology,51:332—336. 5．Snell,F.D.and C.T.Snell:1949.Colorimetric Methods of Analysis,Vol.II,802—807 （华东师范大学张志良）参考资料：硝酸还原酶活性的测定一、材料用具及仪器药品木茨叶或菠菜叶子、蓖麻叶、721型分光光度计、真空泵（或注射器）、保温箱、天平、真空干燥器、钻孔器、三角瓶、移液管、烧杯、
土壤亚硝酸还原酶(Solid-Nitrite reductase ,S-NiR )
货号：MS2922 规格：100管/48样土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase ，S-NiR） 试剂盒说明书 微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用中的关键酶之一，参与亚硝酸盐至NO的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。 测定原理： 亚硝酸还原酶可将NO 2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO 2 —减 少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。 自备实验用品及仪器： 天平、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。 试剂的组成和配制： 试剂一：液体4mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加4mL蒸馏水溶解。 试剂三：液体4mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解） 试剂四：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解）试剂五：液体10mL×1瓶，4℃避光保存。 工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。 样品处理： 新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。 测定操作表： 计算公式： 第1页，共2页
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 标准曲线：y = 1.5562x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A 标准管-A空白管）。 ˉ的量为一个酶活力单位。 酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO 2 S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷1.5562×V标÷W÷T = 0.617×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04mL；W：样本质量，g。 b. 使用96孔板测定的计算公式如下 标准曲线：y = 0.7781x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A 标准管-A空白管）。 ˉ的量为一个酶活力单位。 酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO 2 S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷0.7781×V标÷W÷T = 1.234×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.04mL； W：样本质量，g。 注意事项： 1.配制好的工作液3天内使用完。 2.若吸光值超过 1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以 稀释倍数。 3.严格控制显色时间，否则会对结果有影响。 4.标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。 5.A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-1.5。 第2页，共2页
硝酸还原酶的测定
硝酸还原酶的测定 一、实验目的和要求 掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理 硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐: --产生的NO可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO含量的增加，即表示该酶活22 性的大小。 装 -NO含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸(或对–氨基苯磺酰2 订 胺)反应产生重氮，再与α–萘胺(或萘基乙烯二胺)偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮 线化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。三、主要仪器设备 1、实验仪器分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液 3、实验材料在15-25? 蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。 四、操作方法和实验步骤
、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.51g，另一组是对照苗0.50g，叶片各剪为0.5~1cm的碎片，压1 实。 2、两组中各加入15ml的酶促反应液。 3、真空抽取10min，充分交换细胞内外液。 4、加盖在30?的保温箱中保温20min。 5、去除材料，用移液管取4ml反应液，加入2ml磺胺，加入2ml苯基，放置15min。 6、比色:在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 7、空白管:4mlH2O +磺胺溶液2ml+萘基乙烯二胺溶液2ml ,室温放置15min同样在540nm的波长下分光光度测定亚硝酸的OD值。 五、实验数据记录和处理 称重: 处理苗0.51g;对照苗0.50g OD值:处理苗0.513A;对照苗0.050A - NO含量标准曲线:Y=257.29X- 4.8262(X=OD值;Y=NO2含量(nmol)) 2---有标准曲线得出NO的含量:处理苗:C NO=127.16nmol 对照苗:C NO=8.038nmlo 222--1-1硝酸还原酶活力(nmol NO?g?h)= 根据OD值从标准曲线上查得的NO2(nmol)× 3 × 15/4/m2 -1-1-1-1 --硝酸还原酶活力:处理苗=2805 nmol NO?g?h 对照苗=180.855 nmol NO?g?h22 六、实验结果与分析 1、实验结果分析:实验表明用硝酸钾处理的苗比用氯化铵处理的苗硝酸还原酶活力更强～而且根据测出 的亚硝酸的含量～处理苗是对照苗的10倍左右～远比旁边几组的高～因为可能是因为在取材的时候～取了粘有培养液的根部～但并没有用蒸馏水洗去吸附在上面的硝酸根、亚硝酸根～或者根部的硝酸还原酶活性更多,猜测,。 2、诱导时如用NaNO3 替代KNO3结果会如何，为什么,
硝酸还原酶(Nitrate Reductase,NR)活性测定试剂盒说明书
货号：QS1800 规格：50管/24样硝酸还原酶（Nitrate Reductase，NR）活性测定试剂盒说明书 分光光度法 正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义： NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。 测定原理： O；产生的亚硝酸NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +N AD＋ +H 2 盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α- 萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在 540 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制： 诱导剂储备液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体4mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体15mL×1瓶，4℃保存，（如出现结晶析出，60℃-90℃水浴溶解后使用）； 试剂四：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 试剂五：标准储备液1mL，-20℃保存。 诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL 蒸馏水，充分混匀。 0.1μmol/mL的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取 0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。 样品测定的前处理： 组织的前处理： （1）取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（一般不要诱导处理，预测定结果没有活性则需要诱导处理） （2）按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 细菌或培养细胞的前处理： 先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 测定步骤： 第1页，共2页
实验报告 硝酸还原酶活性的测定word文档良心出品
首都师范大学生命科学学院实验报告 实验题目硝酸还原酶活性的测定 一、实验原理 硝酸还原酶是植物氮素作用中的关键性酶，硝酸还原酶作用于 NO 使之还原为 NO 。 NO -+ NADH + H + — NO 2- + NAD + + H 2O 产生的NO 可以从植物组织渗透到外界溶液中，积累在溶液中。因此，测定反 应液中NO 含量的增加即表明酶活性的大小。 NO 含量的测定----磺胺法 NO 2-与磺胺和-萘胺在酸性条件下生成粉红色化合物，用比色法在520nm 下读 取光密度值。 —、实验用品 1. 材料：完全营养的小麦苗，缺氮培养的小麦苗 2. 仪器和用具：722型分光光度计，剪刀，真空泵，电子天平，温箱，烧杯，移液 枪，tip 头(两种规格：1000卩I ，200卩I ) 三、实验步骤 1. 分别配制反应液于小烧杯中 (1) 0.1M 磷酸缓冲液5ml +蒸馏水5ml (2) 0.1M 磷酸缓冲液 5ml + 0.2MKNQ 5ml 2. NO 2- 的获得 (1) 称取新鲜叶片0.5g 共四份,剪成小片，分别置于小烧杯内的反应液中。 (2) 在真空干燥器中抽气20min,使叶片沉于溶液底部，溶液即可渗入组织内取代其 中的空气， 内部产生的NO 可渗透到外部溶液中。 3.将小烧杯转到30 r 温箱,使其不见光,保温20min 。 4.用5卩g/ml NaNQ 母液配制标准梯度溶液 5、4、3、2、1、0.5、0.1、 0 卩 g/ml 。 5.吸取不同浓度的NaNOmI 于试管中，加入磺胺试剂2ml 及a -萘胺试剂2ml ，混 合均匀，在60r 水浴中保温20min ，于比色杯中，在520nm 下进行比色，读取光 密度，然后做出光密度一浓 度曲线，以光密度为纵坐标， 体步骤及结果如下表和下图所示。 课程名称植物生理实验 实验时间2010331 成绩 姓名唐倪文 班级_3 学号 1090800032 NaNO 浓度为横坐标。具
土壤亚硝酸还原酶(Solid-Nitrite reductase ,S-NiR )试剂盒说明书
货号: QS2922 规格：50管/24样 土壤亚硝酸还原酶 （Solid-Nitrite reductase，S-NiR）试剂盒说明书 可见分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 土壤亚硝酸还原酶是反硝化作用中的关键酶之一，参与亚硝酸盐至NO的还原反应，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。 测定原理： 亚硝酸还原酶可将NO 2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO 2 —减 少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。 自备实验用品及仪器： 天平、可见分光光度计、水浴锅、低温离心机、1mL玻璃比色皿。 试剂的组成和配制： 试剂一：液体10mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10mL蒸馏水溶解。 试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解） 试剂四：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以70-80℃加热溶解） 试剂五：液体25mL×1瓶，4℃避光保存。 工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以1:1的比例混合。 样品处理： 新鲜土样自然风干或37度烘箱风干，过30~50目筛。 计算公式： 标准曲线：y = 1.5562x+ 0.0088，R2 = 0.996；x为标准品浓度（μmol/mL），y为吸光值（A 第1页，共2页
标准管-A空白管）。 ˉ的量为一个酶活力单位。 酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO 2 S-NiR（μmol /d /g土样）=[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088] ×V标÷1.5562÷W÷T = 3.084×[A空白管-(A测定管-A对照管) -0.0088]÷W T：反应时间，1h=1/24d；V标：标准液体积，0.2mL； W：样本质量，g。 注意事项： 1.配制好的工作液3天内使用完。 2.若吸光值超过3，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀 释倍数。 3.严格控制显色时间，否则会对结果有影响。 4.标准曲线线性范围为0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。 A空白管-（A测定管-A对照管）线性范围为0.02-3。 第2页，共2页
土壤硝酸还原酶(Solid-Nitrate Reductase,S-NR)试剂盒使用说明
土壤硝酸还原酶（Solid-Nitrate Reductase，S-NR）试剂盒使用说明 分光光度法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 货号:BC3100 规格：50管/24样 产品内容： 试剂一：液体10mL×1瓶，-20℃保存。 试剂二：液体4mL×1瓶，-20℃保存。 试剂三：液体12.5mL×1瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60度水浴溶解后使用）。 试剂四：液体12.5mL×1瓶，4℃保存。 试剂五：标准品储备液1mL，-20℃保存。 0.1μmol/mL标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml加蒸馏水定 容至10ml。 产品说明： S-NR催化土壤中硝酸盐还原为亚硝酸盐，是土壤硝态氮还原的关键酶。研究S-NR的活性对合理施肥，降低氮素的损失具有重要意义。 S-NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ+NADH+H＋→NO2ˉ+NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。 自备实验用品及仪器： 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 测定操作
1mL带盖离心管 试剂名称 测定管对照管标准管空白管风干土样（g）0.10.1 0.1μmol/mL标准液（μL）100 蒸馏水（μL）500600试剂一（μL）375375 试剂二（μL）125125 混匀后，盖盖后37℃水浴60min，8000g25℃离心10min，取上清液。 上清液（μL）400400400400试剂三（μL）250250250250试剂四（μL）250250250250混匀，显色20min后，4000g，25℃离心10min，用蒸馏水调零，540nm下读取各管吸光值。标准管和空白管只需测一次。每个测定管设一个对照管。 注意事项 1、试剂一、试剂二和试剂五在冰上放置，用完立即放回-20℃。 2、标准管和空白管只需测一次。每个测定管设一个对照管。 S-NR活性计算： 单位的定义：24h每g土样中产生1μmol NO2ˉ的量为一个S-NR活力单位。 S-NR（U/g）=标准品浓度（0.1μmol/ml）×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷反应时间（1/24h）×反应总体积（0.5mL）÷样本质量（0.1g）=12×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）
土壤亚硝酸还原酶(S-NiR)活性检测试剂盒说明书 微量法
土壤亚硝酸还原酶（S-NiR）活性检测试剂盒说明书微量法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。货号：BC2995规格：100T/48S 产品内容： 试剂一：粉剂×1支，4℃保存。加入1mL蒸馏水溶解，4℃保存2周。临用前用蒸馏水稀释400倍，现用现配。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加15mL蒸馏水溶解，4℃保存2周。试剂三：液体15mL×1瓶。此溶液为饱和溶液，取上清使用即可。试剂四：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。试剂五：液体15mL×1瓶，4℃避光保存。 标准品：粉剂×1支，4℃保存。10mg亚硝酸钠，临用前加入1.45mL蒸馏水配成100μmol/mL的标准溶液。4℃保存2周。产品说明： 土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase，S-NiR）是反硝化作用中的关键酶之一，它是由土壤反硝化细菌产生的一种还原酶类，可将NO 2- 还原为NO，它的活性反映了生物降解过程中氮素的转化效率，为氮素转化规律的研究提供一定的依据。 亚硝酸还原酶可将NO 2-还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO 2-减少，即540nm处吸光值的变化可反应土壤中亚硝酸还原酶的活性。自备实验用品及仪器： 可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、30目（或更大）筛、冰和蒸馏水。测定操作： 1、样本处理：新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干，过30-50目筛。 2、操作步骤：
（1）可见分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至540nm。蒸馏水调零。 （2）将标准溶液用蒸馏水稀释为0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125μmol/mL的标准溶液。（3）加样表： 无机质管空白管1对照管测定管标准管空白管2 风干土样（g）--0.050.05-- 蒸馏水（μL）-100100-- 试剂一（μL）100-100-- 试剂二（μL）100100100100-- 混匀后，25℃反应3h 试剂三（μL）100100100100-- 充分震荡30s，10000rpm，4℃，离心10min-- 上清液（μL）100100100100-- 标准品（μL）----100- 试剂四（μL）100100100100100100 试剂五（μL）100100100100100100 蒸馏水（μL）-----100充分混匀，室温放置15min后吸取200μL于微量玻璃比色皿或96孔板中测定540nm各管吸光值，分别记为A无机质管、A空白管1、A对照管、A测定管、A标准管和A空白管2，计算ΔA测定=（A无机质管-A空白管1）-（A测定管-A对照管），ΔA标准=A标准管-A空白管2。无机质管、空白管1、空白管2只需做1-2次。 3、S-NiR计算: （1）标准曲线的绘制： 以标准溶液的浓度为x轴，以标准溶液对应的ΔA为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b,将ΔA 测定带入标准方程得到x（μmol/mL）。 （2）S-NiR的计算： ˉ的量为一个酶活力单位。 酶活单位定义：每g土样每天还原1μmol NO 2 S-NiR（U/g土样）=x×V反应÷W÷T= 2.4×x÷W T：反应时间，3h=1/8d；V反应：反应体系体积，0.3mL；W：土样质量，g。 注意事项
硝酸还原酶(NR)提取液
硝酸还原酶(NR)提取液 简介： 硝酸还原酶(Nitrate reductase，NR)是一种氧化还原酶，可分为参与硝酸盐同化的同化型还原酶和催化以硝酸盐为活体氧化的最终电子受休的硝酸盐呼吸异化型(呼吸型)还原酶。硝酸还原酶是植物氮素代谢中氮素同化的关键酶，该酶与作物吸收利用氮肥有关，对作物的产量和质量有影响，因此可以把硝酸还原酶的活力当作营养诊断养、农田施肥或作物育种的生理生化指标。 Leagene 硝酸还原酶(NR)提取液主要用于裂解植物组织，提取样品中的丙酮酸脱羧酶。该试剂仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、蒸馏水 2、离心管或试管 3、匀浆器或研钵 4、低温离心机 操作步骤(仅供参考)： 1、取植物组织清洗干净，切碎，置于冰箱。 2、配制硝酸还原酶提取工作液：取出硝酸还原酶提取液液和PMSF，恢复至室温，混合，混匀，即配即用，不易久置，否则蛋白酶抑制剂PMSF 的效率会有所下降。 3、加入预冷的硝酸还原酶提取工作液，冰浴情况下充分匀浆或研磨。 4、离心，留取上清液即为硝酸还原酶粗提液，保存，用于硝酸还原酶的检测或其他用途。计算： 组织或植物粗酶液获得率(ml)=上清液体积(ml)/组织或植物质量×100% 注意事项：编号 名称CS0471 Storage 试剂(A):硝酸还原酶提取液500ml 4℃避光试剂(B):PMSF 1ml -20℃使用说明书1份
1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即使用，应存于-20-80℃。 2、硝酸还原酶容易失活，提取和测定时均应操作迅速，尽量在4℃操作。 3、如果测定植物样本，取样最好在晴天进行，最好提前一天施些硝态氮肥，取样部位应 一致。 4、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。 5、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用丙酮酸脱羧酶提取工作液稀释样品后重新测 定。 6、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 有效期：12个月有效。 相关： 编号名称 CS0001ACK红细胞裂解液(ACK Lysis Buffer) DC0032Masson三色染色液 DF0135多聚甲醛溶液(4%PFA) NR0001DEPC处理水(0.1%) NR0002Trizol(总RNA提取试剂) PS0013RIPA裂解液(强) TC1167植物总糖和还原糖检测试剂盒(硝基水杨酸法)