人脐带血来源间充质干细胞的成脂分化

全科口腔医学杂志General Journal Of Stomatology2019 年1月 第6卷/第1期V ol.6, No.1 Jan. 2019146人脐带血来源间充质干细胞的成脂分化杨旭芳1，冯 华1，杨云芳2，陈 培1，李福娟3*（牡丹江医学院1.病理生理教研室；2.数学教研室；3.免疫与病原实验室，黑龙江 牡丹江 157011）【摘要】目的 本文利用Ficoll- Hypague 法自人脐带血中分离、培养及扩增出人脐带血来源间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells ，hUCBMSCs ）；并对其成脂分化能力进行鉴定。

方法 显微镜下观察各代hUCBMSCs 的形态学特点；利用流式细胞术检测各代hUCBMSCs 免疫学表型；取P3代细胞进行成脂肪分化，镜下观察细胞形态及是否出现脂滴。

结果 体外分离、培养出形态均一的hUCBMSCs ；流式结果显示hUCBMSCs 具有间充质干细胞的免疫学特征，即CD44、CD73、CD105阳性；成脂诱导后4天细胞形态发生变化，分别于诱导后1周、2周胞浆中出现明显脂滴。

结论 成功的从人脐带血中分离培养出了人脐带血来源间充质干细胞，其具有高效的成脂分化能力，未来在整形医学领域种子细胞的研究中将具有重要的意义。

【关键词】人脐带血来源间充质干细胞；成脂分化【中图分类号】R457.7 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8803.2019.1.146.02细胞治疗被认为是当前攻克难治性组织损伤修复的新型疗法[1]。

因为干细胞具备旺盛的增殖及多向分化能力等生物学特征，细胞治疗常常选其作为种子细胞。

常见的可用于细胞移植治疗的干细胞种类为胚胎干细胞、诱导的多潜能干细胞及骨髓、羊水等多种中胚层来源的组织中的间充质干细胞[2-3]。

但胚胎干细胞的来源受限及所面临的伦理学问题，诱导多潜能性干细胞获取的技术方法复杂，成体干细胞（间充质干细胞）则成为了优质的种子细胞来源，同其他来源的间充质干细胞相比，脐带血中间充质干细胞含量丰富，因细胞更为原始、来源无创（源于生产后废弃的脐带）、供体不会受到损伤，患者容易接受、无免疫原性，故不会引起排斥反应、无社会伦理问题等特点[4-5]，上述特点决定了人脐带血来源的间充质干细胞（human umbilical cord blood-derived stem cells ，hUCBMSCs ）较其他成体干细胞更具有临床应用价值，因此，hUCBMSCs 将会成为组织修复、整形治疗中极具优势的种子细胞。

1 材料与方法1.1 材料脐带血来源于附属医院产科。

低糖DMEM(Hyclone ，USA)，10%胎牛血清（Hyclone ，USA ），0.25%胰酶（Invitrogen ），Ficoll-pague 淋巴细胞分离液（华雅再生医学生物工程技术有限公司），抗CD44、CD73及CD105单克隆抗体购于BioLegend 公司。

1.2 方法1.2.1 脐带血标本采集选取我校附属第一医院妇产科足月自然产的健康孕妇，征求其同意，无菌操作获得脐带血50 mL ，轻摇血袋以防凝血，于2小时内送至实验室，4℃冰箱保存，12小时内进行分离培养。

1.2.2 hUCBMSCs 的分离与培养PBS 缓冲液与脐带血按照1:1混匀稀释，再与Ficoll-pague 淋巴细胞分离液（1.077 g/mL ）按1:1的体积将稀释液缓慢加于其上，2000 r/min 低温下离心20分钟，将云雾状的乳自色单核细胞层轻轻吸出。

PBS 洗涤细胞吸出液2次，1000 r/min 离心5分钟，用条件培养基（LG-DMEM 、10%FBS 、100units/mLpenicillin ，100μg/mLstreptomycin ）重悬位于最下层的片状沉淀[9]，调整细胞密度，每毫升约为1×106个，接种于6孔板中，放置于5%CO2、37℃的孵箱内培养，4天后半量换液，之后每隔3天换液一次，待细胞接近融合（长满80～90%）时，0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA 轻轻消化贴壁细胞，按1:3的比例进行传代培养，镜下观察各代次hUCBMSCs 的形态特点。

1.2.3 流式细胞仪检测hUCBMSCs 表面标志0.25%胰酶-0.02%EDTA 消化收集不同代次细胞，每例样本细胞数为2×105个左右；细胞重悬于1mL0.01M PBS 中洗涤2次，1500 r•min-1，10分钟；弃去PBS ，与一抗孵育液（一抗稀释度为1：100）常温下孵育30分钟；0.01M PBS 洗涤2次后，分别与FITC －二抗（稀释度为1：50）4℃避光孵育30分钟；0.01MPBS 洗涤2次后，弃去PBS ，再加入300 μl 0.01M PBS 重悬细胞，用于流式细胞仪分析。

1.2.4 hUCBMSCs 成脂定向分化消化收集细胞，调整细胞密度为1×105•mL-1,接种于24孔板，实验分两组，即非诱导组（对照组）与成脂诱导组，24小时后成脂诱导组换为脂肪诱导培养基[7]（LG-DMEM ，10%FBS ，1μmo•L-1地塞米松，50μmol•L-1吲哚美辛，0.5mmoL•L-13-异丁基-1-甲基黄嘌呤；10 μmoL•L-1胰岛素），每3天更换培养液1次，分别于诱导1和2周后，0.1moL•L-1 PBS 洗涤，4%多聚甲醛固定20分钟，显微镜下观察照相。

2 结 果2.1 hUCBMSCs 的形态学特点倒置显微镜下可见：hUCBMSCs 形态均一，细胞胞体狭长，呈现成纤维细胞样，细胞接近融合时，则呈现鱼群样或漩涡样排列。

2.2 hUCBMSCs 表面标志利用流式细胞术对P3、P6和P10代hUCBMSCs 的免疫学基金项目：黑龙江省卫生厅科研项目（2011-324）；牡丹江医学院科学技术项目研究（2011-02）作者简介：杨旭芳（1974-），女，黑龙江牡丹江人，博士，副教授，主要从事干细胞组织工程学研究通讯作者：李福娟（1979-），女，黑龙江牡丹江人，实验师，硕士，主要从事免疫学和病原生物学研究2019 年1月第6卷/第1期V ol.6, No.1 Jan. 2019全科口腔医学杂志General Journal Of Stomatology147标志进行了动态检测分析，结果可见各代hUCBMSCs均表现为CD44、CD73及CD105阳性，且均在94%以上，见图1。

图1 流式细胞术动态检测表面标志2.3 hUCBMSCs成脂分化hUCBMSCs成脂肪诱导4天后，可见细胞的长梭形外观消失，呈现为类圆形或多边形改变，1周后，泡样小脂滴出现于多数细胞胞浆中，且随诱导时间延长胞浆内脂滴数量增加。

见图2。

图2 hUCBMSCs成脂分化3 讨 论再生医学是一门研究如何促进创伤后组织再生及功能重建的新兴学科，主要通过干细胞治疗与组织工程来维持、修复、再生或改善损伤组织，改善器官功能，当前该研究领域急需要解决的难题之一就是种子细胞的来源问题[6]。

为了能够提供更可靠，具有优势的种子细胞，我们利用密度梯度离心法[7]分离hUCBMSCs。

本实验成功分离获得了的hUCBMSCs，流式细胞术结果可见hUCBMSCs具有典型的间充质干细胞的表面标志，即CD44、CD73与CD105阳性；体外扩增的hUCBMSCs，P10代内均可见间充质干细胞的特异性标志物的表达；P3代hUCBMSCs可高效的定向分化为脂肪细胞。

综上所述，本方法获得的hUCBMSCs纯度高，具备典型的间充质干细胞的生物学特点，未来可成为整形医学领域优质的种子细胞来源。

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对不做药敏试验的患者，可优先考虑使用羟基喜树碱、盖诺治疗。

参考文献[1] 单彬彬,杨卫华,郗彦凤,等.耐药基因检测联合三磷酸腺苷-肿瘤体外药敏试验指导肺鳞状细胞癌二线化疗的临床研究[J].肿瘤研究与临床,2016,28(7):447-451.[2] 罗唯师,罗国轩,张阳,等.体外药敏试验指导恶性脑胶质瘤化疗的临床效果及意义[J].吉林医学,2016,34(1):163-164.[3] 周影.八种化疗药物组合对人类宫颈癌细胞体外药物敏感试验研究[D].苏州大学,2015.本文编辑：吴 卫（上接141页）。