临床应用型人脐血间充质干细胞分离培养与鉴定
人脐血间充质干细胞体外分离、培养与鉴定
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定
人脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【摘要】目的：探讨人脐带华通胶间充质干细胞体外分离、培养、鉴定及冻存、复苏的方法。
方法收集健康足月新生儿脐带组织，采用组织块贴壁法分离、培养脐带间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞表面抗原，将细胞冻存3个月后复苏，鉴定复苏后细胞的特性。
结果组织块贴壁法获得脐带间充质干细胞成功率高；细胞表面高表达CD29、CD44、CD90和CD105，不表达造血干细胞表型CD34、CD45等；冻存后再复苏细胞活性高达80％～90％。
结论组织块贴壁法可以从人脐带华通胶中较好的分离、培养出间充质干细胞，为干细胞移植实验研究和临床治疗提供了理想的细胞来源。
%Objective To exploreisolating,culturing,identifying,freezing and thawing mesenchymal stem cells(MSCs)approach from Wharton j elly of human umbilical cord.Methods The MSCs were isolated from neonate umbilical cord,cultured by tissue explants adherent method.The surface markers were identified by flow cytometry.Passage cells,frozen 6 months, were thawed,then their biological characteristics were identified.Results MSCs were easily obtained from Wharton j elly of human umbilical cord via the proposed approach of tissue adherence.The flow cytometry analysis showed that MSCs expressed CD29,CD44,CD90 and CD105 positively,but negatively for CD34,CD45.The living cells of MSCs were 80%-90% after having been frozen and the thawed cells had the same characteristics as the previous.Conclusion MSCs can be successfully isolated from Wharton j elly of human umbilical cord by this method. The stem cells derived from Wharton j elly of humanumbilical cord may be a novel alternative source of human MSCs for experimental and clinical applications.【期刊名称】《河北医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】3页(P21-23)【关键词】脐带;间充质干细胞;胎血【作者】韩华;薛改;张俊勤;闫萍;李艳丽【作者单位】河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军白求恩国际和平医院药剂科，河北石家庄 050082;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;河北省人民医院妇产科，河北石家庄 050051;中国人民解放军第二六○医院病理科，河北石家庄 050041【正文语种】中文【中图分类】R394.2干细胞是一群具有自我更新和分化潜能的细胞，根据发育状态可以分为胚胎干细胞和成体干细胞。
人脐血间充质干细胞的体外培养
１１ 材 料 ．
无菌 条 件下 取 本 院 正 常 足 月剖 腹 产 胎
的 Ｍ ｓ ｃｋＴ ｅｅ ｕ Ｍ进行培养 ， ｎ 观察细胞贴壁延伸及原 代培养时间。⑤观察首次换液时间对细胞生长的影 响 ： 行 以上 研究 时 ， 进 分别 于接 种 后第 ２—７ｄ首 次 换液， 将换下的液体转人新瓶继续培养至少 ６ｄ 观 ， 察是否仍有贴壁细胞 ， 以确定首次换液时间。⑥观 察 不 同培 养基 对 细 胞 生 长 的影 响 ： ８份脐 血 ， 取 以
１ ｎ分 离 ， 获 得 的单 个核 细胞 均分 ， １×１ ５ｍｉ 将 以 ０／
ｍｌ１×１ 。 ｌ １×１ ｍｌ１×１ ｍｌ 种 于 Ｆ Ｓ包 、 ０ｍ 、 ０／ 、 ０／ 接 Ｂ
性， 为其在组织工程方面的应用进行初步探索。
１ 材பைடு நூலகம் 与方 法
被 的培 养 瓶 中 。首 次 换 液 时 间 ３ｄ 用 含 １％ Ｆ Ｓ ， ０ Ｂ
液面清晰， 稀释脐血与淋 巴细胞分离液的柱高 比为
３— ： 。用 Ｆｃ ｌ 以适 当 的 速 度 及 时 问 离 心 ， ５】 ｉ 法 ｄ 取 中间界面 白膜层 ， Ｐ Ｓ后 吹 打 ， １５０ｒｍｉ 加 Ｂ 以 ０ ／ ｎ离
心 ５ｍ ｎ弃上清 ， ｉ， 共洗涤 ２次， 后加入培养基 ； 以一 定密 度接 种于 培养 瓶 中 ， ３ 置 ７℃ 、 积 分数 为 ５％ 体 的 Ｃ Ｏ 饱和湿度的孵箱中培养， 细胞到 ８％融合时 ０ 用 ０２ ％胰 酶和 ００ ％ 乙二胺 四乙酸 （ ： ） ．５ ．４ １１ 消化 ， １ ： 传代培养。 ２ １２ 方法 ①不 同离心速度及时间分离脐血单个 ．
以往 研究 ¨ 表 明 ， 血 中存 在 间 充 质 干 细 胞 脐
“三阶段法”分离培养与鉴定人脐血间充质干细胞
Ａ ｂ ｔａ ｔ ｓｒ ｃ ：Ｏ ｂ ｅ ｔｖ Ｔｏ ｃ ｌｕｒ ｎ ｄ ｎ ｉｙ ｈｕ ａ ｍ ｂ ｌｃ １ｃ ｒ ｏ ｄ Ｍ ＳＣｓ （ ｅ ｅ ｈｙ ａ ｔ ｍ ｅ ｌ ） ｉｃ ｉ ｅ ｕ ｔ ｅ ａ ｄ ｉ ｅ ｔｆ ｍ ｎ ｕ ｉｉａ ｏ ｄ ｂｌ ｏ ｍ ｓ ｎｃ ｍ ｌｓ ｅ ｃ ｌｓ
ｔ ｈ ｈｉｄ ｇ ｎ ｒ ｔｏ ｏｒ ｉ ｅ ｔｆ ｎ ． Ｒｅ ｕ ｔ Ｔｈｒ ｅ ｇ ｏｕ ｆ Ｍ ＳＣｓ ｗｅ ｅ ｓ ｐ ｒ ｔ ｄ ｆｏ ４ ｇｒ ｕ ｏ ｔ ｅ ｔ ｒ ｅ ｅ ａ ｉｎ ｆ ｄ ｎ ｉｙｉ ｇ ｓ ｌｓ ｅ ｒ ｐｓ ｏ ｒ ｅ ａ ａ ｅ ｒ ｍ ｏ ｐｓ ｏｆ ｓ ｍｐｌｓ ａ ｅ ．Ｂｙ ｌ ｗ ｃ ｔ ｍ ｅ ｒ ａ ｌ ｓ ｓｎｇ ， ｃ ｌｓ ｘ ｅ ｓ ｄ ｆｏ ｙ ｏ ｔ ｙ ｎａ ｙ ｉ ｉ ｅ ｌ ｅ ｐｒ ｓ ｅ Ｍ ＳＣｓ ｕｒａ ｅ ａ ｋ ｒ ｏ ＣＤ２ ｓ ｆ ｃ ｍ ｒ ｅ ｓ ｆ ９， ＣＤ４ ａ ４ ｎｄ ＣＤ１ ｏ ｉｉ ｅ ｙ ａ ｐ ｓ ｔｖ ｌ ｎｄ ＣＤ３ ｇａ ｉ ｅ ｙ Ｔｈｅｒ ｓ ｌ ｆｔ ｆｅ ｅ ｉ ｔｏｎ ｏ ｓ ｅ ｂｌ ｓ —ｉ ｅ ｌ ｅ ｉ ｅ ｒ ｍ ０５ ４ ｎｅ ｔｖ ｌ ． ｅ ｕ ｔｏ ｈｅｄｉｆ ｒ ｎｔａ ｉ ｆｏ ｔ ｏ ａ ｔｌｋｅｃ ｌｓｄ ｒｖ ｄ ｆ ｏ ｈｕｍａ ｍ ｂ ｌｃ ｌｃ ｒ ｏｏ ｓ ｐ ｉｉ ｅ ａ ｓ ｎｕ ｉｉａ ｏ ｄ ｂｌ ｄ ｗａ ｏｓｔｖ ｌｏ． Ｃｏ ｌ ｉ ｎ Ｗ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｌ ｎ ｆ ｅ ｔｖｅｙ ｓ ｐ ｒ ｔ ＳＣｓ ｎｃｕｓｏ ａ ａ ｉｙ ａ ｄ ｅ ｆ ｃ ｉ ｌ ｅ ａ ａ ｅ Ｍ ｆ ｏｅ ｐｐ ｏ ｃ ． ｒ ｍ ｍａ ｌ ｌＣｏ ｄ Ｂｌ ｏ ｈｒ ｅ ｐ ｓ ｓａ ｒ ａ ｈ ｃ Ｋｅ ｒ ｓ：ｈｕｍａ ｍ ｂ ｌｃ ｌｃ ｒ ｏ ｄ；ｍ ｅ ｅ ｈｙ ａ ｔ ｍ ｅｌ ；ｉ ｉｒ ｕ ｔ ｒ ｙ ｗｏ ｄ ｎｕ ｉｉａ ｏ ｄ ｂｌ ｏ ｓ ｎｃ ｍ ｌｓ ｅ ｃ ｌｓ ｎ ｖ ｔｏ ｃ ｌｕ ｅ
脐带血间充质干细胞体外分离_纯化及培养
脐带血间充质干细胞体外分离、纯化及培养陈 镭1,惠国桢2,栾文忠1,苗宗宁3,王 玲3,陆 华3,吴智远2,芦 奕2(1.天津医科大学,天津,300070; 2.江苏省无锡市第三人民医院细胞实验室,江苏无锡,214019;3.苏大学附属第一医院神经外科,江苏苏州,215006)摘 要:目的 研究脐带血(HUCB)中含有的间充质干细胞(M S Cs)体外分离、纯化及培养条件,探究其作为种子细胞应用于实验和临床的可行性。
方法 无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带血,经肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esen cult T M 作为培养基进行培养和纯化获得贴壁细胞层,用流式细胞仪检测M SCs 表面抗原。
结果 来源于脐血的单个核细胞经体外培养贴壁后出现破骨样及间充质样的细胞,间充质细胞为成纤维样的细胞形态,并表达M SCs 相关的抗原(CD 29、CD 44、CD 166),但不表达造血细胞抗原(CD 34、CD 45),这与源于骨髓的M SCs 一致。
结论 脐带血来源的M SCs 能在体外培养、扩增,而用于满足实验和临床的需要。
关键词:脐带血;间充质干细胞;体外培养中图分类号:R 329 2 文献标识码:A 文章编号:1672 2353(2004)01 0012 03THE ISOLATION PURIFICATION ANDCULTURE OF HUCA MSCsCHEN Lei,HUI Guo zen,RUAN Wen zong,MIAO Zong ning,WANG Ling,LU HUA,W U Zhi yuan,LU Li(1.T ianj in M edical Univer sity ,T ianj in,300070;2.Cell Dep ar tment,T hir d H osp ital of W ux i ,W ux i ,Jiangsu ,2140001;3.Dep ar tment of Neurosur gery ,First A f f iliated H osp ital of Suz houUniversity ,Suz hou,Jiangsu ,215006)ABSTRAC T Objective:To investig ate the isolation,purification and culture of hum an umbilical cord blood(HUCB)mesenchymal stem cells(M SCs)in vitro,and to observe the feasibility of using M SCs as seed cells in experiment and clinic.Methods:HUCB w ere collected from full term deliveries scheduled for cesarean section,all specimens w as obtained sterilely w ith preservative free heparin,the cord blood mononuclear cell w as isolated by lymphocyte separation medium,and puri fied and culture with M esencult T M medium and acidic environment to produce adherent layer,the surface antig en ex pression of MSCs was detected by flow cytometry.Results:The UCB derived mononuclear cells,when set in culture,gave rise to adherent cells,w hich ex hibited either an osteo clast or mesenchym al like phenoty pe,cells w ith the M SCs displayed a fibroblast like morpholog y and ex pressed several MSCs related antigens (CD 29,CD 44,CD 166),but did not ex press haematopoi etic cells antigens(CD 34,CD 45),which w as identical to human bone marrow derived M SCs.C on clusion:M SCs in H UCB can culture and expand in vitro,which could be regarded as an alternative source of MSCs for experimental and clinical needs.KEY WORDS umbilical cord blood;mesenchymal stem cells;culture in v itro脐带血(human umbilical cord blood,HUCB)是胎儿出生时脐带内及胎盘近胎儿一侧血管内的血液,含有丰富的干细胞和祖细胞,其主要包含造血干细胞和间充质干细胞(mesenchy mal stem收稿日期:2003-12-16基金项目:国家自然科学基金资助项目(30271325)、江苏省自然科学基金资助项目(BK2001170)作者简介:陈镭(1965-),男,天津市人,在读博士研究生。
人脐血间充质干细胞来源的外泌体_分离鉴定及生物学特性_张娟
中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH5955www.CRTER.org张娟，女，1988年生，河北省玉田县人，汉族，内蒙古医科大学免疫学在读硕士，医师，主要从事干细胞的基础与临床应用研究。
通讯作者：王彩生，硕士，主任医师，内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031并列通讯作者：魏来，博士，教授，北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.009 []中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05955-06 稿件接受：2014-07-31Zhang Juan, Studying for master’s degree, Physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Wang Cai-sheng, Master, Chief physician, Faculty of Graduate Studies, Inner Mongolia Medical University, Hohhot 010110, Inner Mongolia Autonomous Region, China; the Second Hospital of Hohhot City, Hohhot 010031, Inner Mongolia Autonomous Region, ChinaCorresponding author: Wei Lai, M.D., Professor, Peking University People’s Hospital, Peking University Hepatology Institute, Beijing Key Laboratory of Hepatitis C and Immunotherapy for Liver Diseases, Beijing 100044, ChinaAccepted: 2014-07-31人脐血间充质干细胞来源的外泌体：分离鉴定及生物学特性张 娟1，刘 峰2，张 薇2，丛 旭2，王彩生1，3，魏 来2(1内蒙古医科大学研究生学院，内蒙古自治区呼和浩特市 010110；2北京大学人民医院，北京大学肝病研究所，丙型肝炎和肝病免疫治疗北京市重点实验室，北京市 100044；3呼和浩特市第二医院，内蒙古自治区呼和浩特市 010031)文章亮点：1 研究发现间充质干细胞是通过旁分泌有效生物学活性物质外泌体在细胞间进行信息传递，进而通过某种机制发挥组织损伤修复作用。
临床研究用人间充质干细胞质量评价
临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
脐血间充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究
ｏ ｓ ｔ ｅ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ａ ｎ ｄ ａ ｄｉ ｐ ｏ ｇ ｅ ｎ ｉ ｃ ｄＩ ｆ ｆ ｅ ｒ ｅ ｎ Ｉ Ｉ ａ ｌ ０ ｎ ｐ ｏ ｔ ｅ ｎ ｔ ｉ ａ １ ｗｉ ｔ ｈ ｐｒ ｏ ｐ ｅ ｒ ｃ ｏ ｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｉ ｎ ｖ ｉ ｔ ｒ ｏ ．Ｍｅ ｔ ｈ ｏｄ ｓ Ｕｍ ｂ ｉ ｌ ｉ ｃ ａ Ｉ
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基础研 究 ・
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论著 ・
脐血 问充质干细胞的分离培养鉴定及诱导分化研究
潘丽杰 ， 陈 妍， 袁 杰
（ 哈 尔滨 医科大学附属 口腔 医学院口腔预防保健科 黑龙江 哈 尔滨 １ ５ ０ ０ ０ １ ）
［ 摘要］ 目的 ： 分 离培 养 人 脐血 间 充质 干 细胞 （ｈ ｕ ｍ ａ ｎ ｕ ｍ ｂ ｉ ｌ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｏ ｒ ｄ ｂ １ ｏ ｏ ｄ － ｄ ｅ ｒ ｉ ｖ ｅ ｄ ｍ ｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍ ａ ｌ Ｓ ｔ ｅ ｍ
１ ５ ０ ０ ０ １ ， Ｈ ｅ ｉ ｌ ｏ ｎ ｇ ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ， Ｃｈ ｉ ｎ ａ ）
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ：Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ａ ｎ （ 】 （ ： ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｕ ｍｂ ｉ ｌ ｉ ｃ ａ ｌ ｃ ｏ ｒ ｄ ｂ ｌ ｏ ｏ ｄ — ｄ ｅ ｒ ｉ ｖ ｅ ｄ ｍｅ ｓ ｅ ｎ ｃ ｈ ｙ ｍａ ｌ ｓ ｔ ｅ ｍ
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解剖科学进展 Progress of Anatomical Sciences 2010 Jul,16(4):327~330临床应用型人脐血间充质干细胞分离培养与鉴定11，21，2111，2*肖 娟，陈 琳，王洪美，李 莹，任玉水，黄红云（1. 北京市虹天济神经科学研究院；2. 北京康复中心神经外科， 北京 100144）【收稿日期】*通讯作者（To whom correspondence should be addressed）2009-12-03【基金项目】国家自然科学基金资助项目（No.30971527），北京 市优秀人才培养资助基金（No.20081D1101000337）【摘要】 目的 探讨能够达到临床细胞治疗标准的人脐血间充质干细胞的体外培养与纯化方法。
方法 以15%FBS/DMEM作为培养基，采用淋巴细胞分离液间接分离法，分离MSCs，以贴壁培养法进行原代培养和纯化。
倒置显微镜下观察生长状态和形态学变化，共聚焦显微镜下观察细胞表面抗原CD34，CD44免疫组化染色的鉴定。
结果 细胞计数显示人脐血间充质干细胞产品的细胞成活率大于95%，其纯度大于85%，符合卫生部第三类医疗技术的有关标准。
结论 脐带血内含MSCs，可在体外分离培养纯化增殖，获得大量相对纯化的MSCs，达到临床应用水平。
【关键词 】 人；脐血；间充质干细胞；细胞培养；免疫组化 【中图分类号】 Q592.1 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-2947（2010）04-0327-04Culture and purification of mesenchymal stem cells of human cord blood11,21,211,21,2*XIAO Juan , CHEN Lin , WANG Hong-mei , LI Ying , REN Yu-shui HUANG Hong-yun （1. Beijing Hongtianji Neuroscience Academy; 2. Department of Neurosurgery, Beijing Rehabilitation Center, Beijing 100144 China , ）【Abstract】 Objective To explore a practical method of culture and purification of mesenchymal stem cells (MSCs) from human cord blood in vitro in order to satisfy the clinical application. Methods The MSCs from human cord blood were cultured in 15% FBS/DMEM and separated indirectly by lymphocyte separating medium. The primary culture and purification were performed by adherent method. Growth condition and morphology change of MSCs were observed under the inverted microscope, and the cell surface antigen was identified by CD34 and CD44 immunohistochemistry and observed by laser scanning confocal microscope. Results The obtained human MSCs showed CD44 positve and CD34 negative. The purity of human MSCs was more than 85% and about 95% of them were viable, which was in line with the standard of third category of national medical technology issued by Ministry of Health of China. Conclusion The MSCs from human cord blood were separated, cultured and purified successfully, which meets the need of clinical treatment by MSCs transplantation.【Key words】 human; cord blood; mesenchymal stem cells; cell culture; immunohistochemistry细胞移植是治疗中枢神经系统疾病的重要手化能力强，免疫原性很弱，无伦理问题等诸多优[1-3][5，6]段，脐血间充质干细胞（mesenchymal stem cell，点。
本研究探寻一种适合脐血MSCs的体外培养及MSC）是候选细胞之一。
它来源于发育早期的中胚纯化方法，以达到临床治疗标准要求。
层，具有全能干细胞的特点，自我更新能力强大， [4]1 材料与方法多向分化潜能。
脐血（umbilical cord blood，UCB）间充质干细胞是从脐带血中分离和培养的一种多潜 1.1 材料与设备能成体干细胞，具有分泌神经营养因子，免疫调DMEM/F12（ GIBCO产品），胎牛血清（FCS，节，血管发生，向神经样细胞分化的潜能；与其他GIBCO产品），人淋巴细胞分离液（1.077g/ml，天来源的MSCs相比具有来源广泛，采集方便，增殖分津TBD公司），甲基纤维素，肝素， 0.25%胰蛋白酶（Amresco 0458）， EDTA，终止液，青链霉素，多聚赖氨酸（Sigma），24孔培养板（Coring公司），双人双面超净台（北京东联哈尔 DL-CJ-2N）、低速·328·解剖科学进展2010年第16卷第4期离心机（KUBOTA 2420）、尼康倒置显微镜（TS 扫描。
100F）、CO培养箱（Thermo 3111）、荧光显微镜22 结果（Leica DMLB2）、尼康数码相机（COOLPIX4500），激光共聚焦显微镜（ZEISS，德国）。
2.1 细胞形态学观察1.2 脐血单个核细胞的分离方法用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基，在多聚在无菌条件下取正常足月或剖腹产的脐血赖氨酸包被过的聚乙烯培养瓶中培养单个细胞，初30ml，肝素抗凝。
所得脐血与PBS按1：1混匀，再与次接种细胞呈悬浮状态，细胞小而圆，24h后开始有5g/L的甲基纤维素按4：1混匀，静止30min后，分2细胞贴壁，3d后细胞呈圆形，椭圆形，纺锤，逗号层，红细胞在下面，吸取上清离心（2000r/5min），样或树枝状，然后细胞数目增多，有少量突起逐渐弃上清，用PBS制成单个细胞悬液，叠加到相对密度伸出，5-7d出现大量的贴壁细胞以间充质细胞为1.077的淋巴细胞分离液上，进行梯度离心（2500r/主，同时有大量破骨样细胞混杂，破骨样细胞镜下20min），然后缓慢吸出界面层白色豆渣状的细胞悬圆形，胞体较大，多核。
此时贴壁的MSCs最初散在液层，加PBS制成单个细胞悬液，离心，洗涤2次，8分布，有少量聚集存在，形态呈梭形或多角形，单个调整密度1.0×10/ml 。
核，胞浆比较大，有较长的突起，折光性强（图1）。
1.3 细胞培养及纯化15d细胞数目大量增多，成较均一的长梭形细胞将细胞悬液以DMEM/F12（含15%FBS）按1.0×82突起明显，类似于成纤维细胞，其他形状的细胞明10个/ml的密度接种到多聚赖氨酸包被的25 cm培养显减少。
21d细胞达90%融合时，多为平行生长或成瓶中，置于37℃、5%CO饱和湿度培养箱内培养，2漩涡状，形状均一长梭形（图2）。
传代后24h内完3天，更换培养基，去掉未贴壁的细胞，根据细胞生全贴壁，7～10d完全融合，传至第3 代后，破骨样细长状况，每3天半量换液一次。
待细胞生长到90%融胞逐渐被去除，剩下的形态均一，宽大扁平的细合时以0.25%胰蛋白酶消化，加EDTA，按1：2比例胞，即为脐血间充质干细胞。
传代接种培养，直到贴壁细胞长满瓶底重复以上操2.2 免疫组化结果作。
荧光显微镜下可见均强烈表达CD44，不表达1.4 细胞活力检测CD34。
表达CD44的细胞比率达85%。
表明脐血MSCs 细胞悬液培养及传代前计数细胞存活率。
制备6表达间充质细胞表面抗原而不表达造血细胞、祖细单个细胞悬液，稀释成10个/ml。
将90μl的细胞悬液胞及内皮细胞表面抗原（图3）。
这与骨髓来源的和10μl的0.4%台盼蓝溶液充分混匀并静止0.5min，MSCs免疫组化结果一致。
微量加样器抽取10μl混合液，沿计数板边缘加样。
2.3 细胞活力的测定200倍显微镜下随机选择9个视野，分别记录活细胞细胞经台盘兰染色后，普通显微镜下可见活细（未染色）和死细胞（染成淡蓝色）数目，计数在胞胞质和胞核透亮，而死细胞胞核蓝染。
在镜下分3min内完成。
根据公式求MSCs细胞活力，即活细胞别计数活细胞数和细胞总数，分离脐血MSCs悬液活总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。
应用性率为（95.60±1.5）％，见表1。
SPSS13.0软件计算脐血间充质干细胞阳性率，相关数据用x+s表示。
3 讨论1.5 脐血间充质干细胞的表面标志的鉴定将4%的多聚甲醛固定的细胞片置于湿盒中，间充质干细胞移植治疗发挥作用的主要作用机PBS清洗3次，每次5min。
10%的山羊血清封闭30制包括分泌营养支持因子，免疫调节，促进血管发min。
将封闭液稀释的一抗（CD44 1:10，CD34 1:[7-9]生，增殖分化成神经样细胞，细胞替代等。
骨髓200）滴加到封闭好的细胞上，室温下1h后，用来源的间充质细胞是临床最早用于治疗的本类细PBS清洗3次，每次5min。
以此加入荧光二抗，室温胞，但存在取材对机体可造成一定损伤，随年龄增下静置30min，核染后封片。
共聚焦显微镜下观察并field of vision living cell/cell total viability rate（％）1232/23997.072201/21195.263186/19296.874215/22097.725197/21093.806247/25696.48.7224/24093.338201/21195.269195/20694.66Table 1. The viability rate of MSCs2010年第16卷第4期·329·肖 娟临床应用型人脐血间充质干细胞分离培养与鉴定等 Fig 1. Primary MSCs cultured for 7 days ×200Fig 2. Primary MSCs cultured for 21 days ×200Fig 3. CD44 positive cells（A ×200）and CD34 negative cells(B ×200) and cell nucleus(C ) and combination of A and C(D)加细胞活性下降，病毒感染率高，儿童和体弱人员离；（3）流式细胞仪分选法，根据MSCs细胞表面取材受限等不足之处。