利用细胞模型研究EGFR与细胞凋亡的关系
ATF4基因与肿瘤
ATF4基因与肿瘤王慧;刘勤江【摘要】转录激活子4(ATF4)属于ATF/CREB家族,在缺氧、氨基酸缺失、氧化应激和内质网应激等应激反应中发挥重要作用.在多数肿瘤中ATF4表达上调,并能增强肿瘤的缺氧耐受和促进肿瘤的生长及血管生成因子的表达,进而参与调节肿瘤发生发展的相关过程.因此,ATF4可能成为肿瘤治疗领域中的潜在新靶点.本文通过复习相关文献对ATF4基因在肿瘤研究中的相关进展进行综述.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2018(015)018【总页数】4页(P36-39)【关键词】肿瘤;转录激活子4;内质网应激【作者】王慧;刘勤江【作者单位】兰州大学生命科学学院,甘肃兰州730000;甘肃省肿瘤医院头颈外科,甘肃兰州730050【正文语种】中文【中图分类】R730转录激活子 4（activatingtranscriptionfactor4，ATF4）是一种普遍的胁迫反应响应基因，被称为环腺苷酸（cAMP）连接效应元件 2（CREB2），同时也是综合应激反应途径中的重要响应器，属于激活转录因子/循环AMP反应元素结合蛋白（ATF/CREB）家族，在由缺氧、氨基酸缺失、氧化应激和内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）等应激信号诱导的反应中发挥重要作用。
近年来，许多研究发现，ATF4表达在多种肿瘤中上调，并参与调节肿瘤进展的相关过程，这提示ATF4有可能成为肿瘤治疗的潜在新靶点。
1 ATF4基因ATF4基因定位于22号染色体的q13.1，大小约2122 bp，含有3个外显子，编码蛋白包含351个氨基酸，属于ATF/CREB家族[1]。
ATF家族是一群含有碱性亮氨酸拉链区域（bZIP）的转录因子，而此区域与蛋白之间的相互作用有关，该家族成员除了ATF4外还包括 ATF1、CREB/CREM、CREB314、CREB-H、ATF2、ATF3、ATF6、ATF7、B-ATF 和 ATFX（也称为 ATF5），根据每个激活子与cAMP的结合位点不同可以区分各个成员[1]。
EGFR蛋白的生物信息学初步分析
EGFR蛋白的生物信息学初步分析作者：刘一凡来源：《科技风》2019年第02期摘要：EGFR（Epidermal Growth Factor Receptor）是表皮生长因子受体（HER）中的一种重要蛋白，属于EGF（Epidermal Growth Factor）家族。
作为一种跨膜蛋白，其信号通路对细胞多种生理过程起重要作用。
本文中从该蛋白的氨基酸组成、亲水性分析、系统发育分析，亚细胞定位，三级结构模拟等多个方面对该蛋白进行了生物信息学分析，这些结果有助于我们更进一步地了解EGFR蛋白的结构与功能。
关键词：EGFR；生物信息学；初步分析；EGFR蛋白；系统发育分析；亚细胞定位预测；三级结构预测EGF以及其受体于1953年由范德堡大学的Stanley Cohen教授发现。
Cohen教授因此与意大利的Rita Levi-Montalcini共享了1986年诺贝尔医学奖。
在许多癌症病例中，影响EGFR表达或活性的突变是癌症的重要诱因。
导致EGFR过度表达的突变被证明与多种癌症的产生有关。
其中包括肺部鳞状细胞癌（80%有关），肠癌、恶性胶质瘤（50%有关）与头颈部上皮肿瘤（80%至100%有关）。
[1]上述与癌症有关的突变与EGFR的联系主要体现在前者能导致EGFR保有异常的持续活性，间接引发不受控制的细胞增殖与分化。
对EGFR的抑制是当前开发相关癌症疗法的一个重要发展方向。
研究EGFR蛋白质的结构是研究EGFR的作用机理、信号传递和抑制方法的基本。
本文从氨基酸组成分析、系统发育分析、亚细胞定位预测和三级结构预测四个方面对EGFR的结构做了研究和探讨，以期为EGFR及其致病机理的研究和相关癌症治疗方法的开发提供参考。
1 材料与方法1.1 材料从uniprot[2]上下载EGFR蛋白氨基酸序列（FASTA格式），以人的EGFR蛋白序列为例：>sp|P00533|EGFR_HUMAN Epidermal growth factor receptor OS=Homo sapiens OX=9606 GN=EGFR PE=1 SV=21.2 方法1.2.1EGFR氨基酸组成分析利用Bioedit进行氨基酸分析。
肺癌中凋亡信号途径及其与EGFR通路的关系
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１ ６・ ０１
广 东医学
２１ ０ ２年 ４月 第 ３ ３卷 第 ７期
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含表皮生长因子受体(EGFR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌细胞模型的建立
918细胞与分子免疫学杂志（Chin J Cell M ol ImmU n〇l)2020, 36(10) .论著•文章编号：1007 -8738(2020)10 -0918 -06含表皮生长因子受体（E G FR)启动子萤光素酶报告基因的三阴性乳腺癌 细胞模型的建立梁丹丹、王春苗\李俊莹、覃良淑\粟正英2,侯华新|+G广西医科大学药物分析教研室，广西南宁530021; 2广西国际壮医医院药学部，广西南宁530201)[摘要]目的建立稳定表达人表皮生长因子受体（EGFR)启动子及萤光素酶（Luc)报告基因的三阴性乳腺癌细胞系，并对其 应用进行初步验证。
方法采用基因重组技术，构建含有EGFR启动子以及Luc报告基因的慢病毒载体，并感染MDA-M B231 细胞，经过嘌呤霉素筛选获得能稳定表达Luc活性的MDA-M B231-EGFR-Luc2细胞系；分别采用EGFR激活剂EG F以及抑制剂 吉非替尼处理细胞后检测Luc活性变化。
结果通过基因测序和质粒双酶切鉴定，EGFR基因启动子Luc报告基因-慢病毒表 达载体构建成功，经过嘌呤霉素筛选获得稳定表达Luc的MDA-MB231-EGFR-LU C2细胞；EGF可剂量依赖性的增加细胞中Luc 的活性，而吉非替尼则相反。
结论建立了MDA-M B231-EGFR-Luc2稳定表达EGFR启动子及Luc报告基因细胞系，为高通量 筛选靶向EGFR的抗肿瘤药物提供一类新的细胞模型。
[关键词]表皮生长因子受体；启动子；萤光素酶报告基因；三阴性乳腺癌；MDA-MB231细胞[中图分类号]Q279, R737.9, R392-33, R965 [文献标志码]A表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,E G F R)为跨膜酪氨酸激酶蛋白，是酪氨酸 激酶受体超家族的成员之一。
E G F R调控的信号通 路在细胞增殖、存活、分化、迁移中发挥着关键作 用[1_3]，E G F R在肺癌、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌等 多种恶性肿瘤中均呈高表达且与患者的预后不良密 切相关[4_6]。
EGFR通路在动脉粥样硬化机制中的作用研究
EGFR通路在动脉粥样硬化机制中的作用研究涂艳虹程波（江汉大学附属医院武汉市第六医院综合科，武汉 430015）中图分类号R392 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2024）02-0278-05［摘要］目的：通过巨噬细胞构建泡沫细胞，探讨EGFR通路在动脉粥样硬化机制中的作用。
方法：采用C57BL/6J小鼠巨噬细胞诱导泡沫细胞，油红O染色鉴定模型。
qRT-PCR、Western blot检测各靶点干扰效率。
qRT-PCR检测IL-6和TNF-α表达。
Western blot检测EGFR、p-EGFR、CHOP、ATF4、EIF2α、p-EIF2α和Cyt-C蛋白表达。
流式细胞术检测ox-LDL的提取和活性氧的生成。
ELISA检测IL-6和TNF-α含量。
结果：EGFR抑制剂转染细胞后，EGFR表达下降（P<0.01），其中EGFR sh-RNA3干扰效率最好。
EGFR抑制剂（AG1478或EGFR shRNA3）能够显著降低细胞对ox-LDL的提取（P<0.01），显著降低IL-6、TNF-α和活性氧水平（P<0.01），抑制细胞质中Cyt-C表达，显著降低p-EIF2α、Chop和ATF4表达（P<0.01）。
结论：EGFR通路可能通过降低炎症和氧化应激减轻动脉粥样硬化。
［关键词］巨噬细胞源性泡沫细胞；动脉粥样硬化；炎症Study of role of EGFR pathway in mechanism of atherosclerosisTU Yanhong， CHENG Bo. Department of General Medicine， Wuhan Sixth Hospital， Affiliated Hospital of Jianghan University， Wuhan 430015， China［Abstract］Objective：To investigate role of EGFR pathway in pathogenesis of atherosclerosis by constructing foam cells from macrophages. Methods：Macrophages from C57BL/6J mice were induced into foam cells， and identified by Oil Red O staining. Inter‐ference efficiency of each target was detected by qRT-PCR and Western blot. IL-6 and TNF-α expressions were detected by qRT-PCR. EGFR，p-EGFR，CHOP，ATF4，EIF2α，p-EIF2α and Cyt-C protein expressions were detected by Western blot. Extraction of ox-LDL and formation of reactive oxygen species were detected by flow cytometry. IL-6 and TNF-α contents were detected by ELISA. Results：EGFR expression inhibitor decreased in turn after transfection of EGFR inhibitor （P<0.01）， and interference efficiency of EGFR sh-RNA3 was the best. EGFR inhibitors （AG1478 or EGFR shRNA3） were able to significantly reduce cellular extraction of ox-LDL （P<0.01）， significantly reduced levels of IL-6， TNF-α and reactive oxygen species （P<0.01）， inhibited expression of Cyt-C in cytoplasm， and decreased expressions of p-EIF2α， Chop and ATF4 （P<0.01）. Conclusion：EGFR pathway may reduce atheroscle‐rosis by reducing inflammation and oxidative stress.［Key words］Macrophage derived foam cells；Atherosclerosis；Inflammation动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）作为一种威胁人类健康的心血管疾病，是老年人最常见的死亡原因之一［1］。
细胞凋亡与干细胞研究
细胞凋亡与干细胞研究细胞凋亡是指细胞主动死亡的一种程序性过程，旨在维持组织稳态和消除异常细胞。
干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞，对于组织修复和再生具有重要作用。
细胞凋亡与干细胞研究是生命科学领域的热点课题，对于深入了解机体生长发育、疾病治疗以及抗衰老等方面具有重要意义。
一、细胞凋亡的机制细胞凋亡是通过调控基因表达来实现细胞死亡的过程。
在此过程中，细胞会经历细胞凋亡信号的识别、活化、执行和清除等多个阶段。
1.细胞凋亡信号的识别在细胞内外环境发生变化时，细胞会接收到相应的信号，触发细胞凋亡的启动。
这些信号可以来自内源性刺激，如DNA损伤、细胞内蛋白质异常等，也可以来自外源性刺激，如细胞因子、生长因子的变化等。
2.细胞凋亡信号的活化一旦细胞凋亡信号被识别，细胞内会启动一系列的反应，如线粒体膜的通透性增加、细胞色素c的释放等。
这些反应会导致细胞内酶的活化，特别是半胱氨酸蛋白酶家族蛋白的活化，进而引发细胞内的一系列级联反应。
3.细胞凋亡的执行细胞凋亡执行期是细胞死亡的关键阶段。
在这个阶段，细胞的核糖体失活，蛋白质合成停止，细胞核DNA发生断裂和DNA片段化等。
最终形成的细胞按照特定的结构和标志特征开始被清除。
4.细胞凋亡的清除细胞凋亡后产生的细胞碎片和细胞间隙内的细胞外DNA等垃圾需要被及时清除。
这主要依赖于食细胞、胶质细胞和天然杀伤细胞等吞噬细胞对细胞碎片的识别和清除功能。
二、干细胞研究干细胞是一类特殊的细胞，具有两个主要特点：自我更新和多向分化潜能。
自我更新意味着干细胞可以无限分裂，并产生与自身相似的干细胞。
多向分化潜能是指干细胞可以分化成多种不同类型的细胞，如神经细胞、心肌细胞等。
1.干细胞分类根据来源和分化潜能的不同，干细胞可以分为多种类型。
根据来源来分，包括胚胎干细胞和成体干细胞。
胚胎干细胞来源于早期胚胎，具有最大的分化潜能，可以分化为身体上几乎所有类型的细胞。
成体干细胞则存在于成体组织中，分化能力相对较低，主要用于组织修复和再生。
乳腺癌他莫昔芬耐药机制的研究进展
乳腺癌他莫昔芬耐药机制的研究进展陈卓婷【期刊名称】《《海南医学》》【年(卷),期】2019(030)006【总页数】4页(P808-811)【关键词】乳腺癌; 他莫昔芬; 耐药机制; 相互关系【作者】陈卓婷【作者单位】广东医科大学附属医院血管甲状腺乳腺外科广东湛江 524002【正文语种】中文【中图分类】R737.9近年来恶性肿瘤相关统计学数据显示，从2012年登记乳腺癌每年新发病例约为27.3万到2014年登记的每年新发病例约为27.9万[1-3]，乳腺癌持续位居全国女性恶性肿瘤第一位，我国局部地区已经成为了女性恶性肿瘤的第一位或第二位[3]。
乳腺癌以其发病率逐年增长、趋于年轻化等特点严重影响着全国女性的生命健康。
在《中国抗癌协会乳腺癌诊疗指南与规范》[4](以下简称为指南)中指出，乳腺癌的标准化规范化治疗包括外科手术治疗、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗和靶向治疗等，其中内分泌治疗是除手术以外最古老也是最常用的方法之一。
乳腺癌的内分泌治疗是雌激素受体阳性乳腺癌患者综合治疗的重要组成部分，主要包括拮抗雌激素受体类药物[他莫昔芬(TAM)、托瑞米芬]、芳香化酶抑制剂(AI)(阿那曲唑、来曲唑等)及下调雌激素受体药物(氟围司群)。
长期以来，内分泌辅助治疗，尤其是他莫昔芬，凭借其低毒、经济、效应作用持久成为ER+乳腺癌患者综合治疗的一线药物，并一直运用于早期和晚期ER+乳腺癌患者的治疗。
虽然治疗早期使用TAM 有明显的获益，但临床应用中发现患者容易对TAM产生耐药，并导致肿瘤进展和转移。
绝经后早期乳腺癌患者起初对TAM反应有良好的应答，但容易产生耐药，其耐药性仍然是临床上面临的主要难题。
在《晚期乳腺癌国际指南共识》(ABC2[5]、ABC3[6])中对内分泌耐药进行了明确的定义：原发性内分泌耐药是指辅助内分泌治疗不超过2年或者晚期一线内分泌治疗不超过6个月及出现复发转移或进展；继发性内分泌耐药是指辅助内分泌治疗超过2年或结束后1年内出现复发转移，或者晚期一线内分泌治疗超过6个月出现进展。
肺腺癌临床病理特征与EGFR基因突变的关系研究
- 160 -[7]夏蓉晖，秦冬.高龄冠心病患者多重用药1例[J].临床药物治疗杂志，2019，17（1）：52-53.[8] Masumoto S，Sato M，Maeno T，et al.Factors associated with the use of dietary supplements and over-the-counter medications in Japanese elderly patients[J].Bmc Family Practice，2018，19（1）：20.[9]李金芳，马利，余玉善，等.石河子市老年高血压住院患者衰弱影响因素分析[J].广东医学，2018，39（22）：53-57.[10]闫雪莲，孙雪，付乐宸，等.末期老年住院患者多重用药及药物重整调查[J].中华老年多器官疾病杂志，2018，17（12）：12-15.[11]张佳颖，郭西芮，吴行伟，等.居民用药风险“知识-态度-行为”调查及影响因素研究[J].中国药房，2018，29（11）：1445-1448.[12] Gunawan H，Hanum H，Abidin A，et al.Relationship betweendepression with FEV 1 percent predicted and BODE index in chronic obstructive pulmonary disease[J].IOP Conference Series Earth and Environmental Science，2018，125（1）：012149.[13]李丽，曹学云，陈冬玲，等.老年高血压患者家庭治疗方案执行情况及影响因素分析[J].慢性病学杂志，2018，19（7）：876-880.[14] Torres A P，Garc ía M E G，L ópez-Sobaler A M，et al.Assessment of diet in patients with chronic kidney diseases without dialysis and relationship with the nutritional status[J].Nutricion Hospitalaria，2017，34（5）：1399-1407.[15]杨影红，曾幸坤，褚娇娇，等.门诊老年患者衰弱现状调查及相关影响因素分析[J].浙江医学，2018，40（10）：1050-1053.[16]贾春伶，张娟涛，张丽霞，等.社区老年慢性病患者多重用药现状和处方干预认知度调查[J].人民军医，2019，62（6）：534-538，541.[17]贾贺勋，袁诗韵，罗涛.重庆地区部分老年高血压患者现况调查及多学科诊治方案建议[J].重庆医科大学学报，2019，44（5）：642-648.[18]杨翔，张瑗，陈阳希，等.高龄老年患者不合理用药情况调查及影响因素分析[J].医学研究生学报，2018，31（1）：39-43.（收稿日期：2020-07-21） （本文编辑：刘蓉艳）①山东省宁阳县第一人民医院 山东 宁阳 271400通信作者：李文思肺腺癌临床病理特征与EGFR基因突变的关系研究李文思① 苏雷①【摘要】 目的：探讨肺腺癌临床病理特征与表皮生长因子（EGFR）基因突变的关系。
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生命科学学院任婕 2015226011 1.如何利用细胞模型研究EGFR与细胞凋亡的关系
经查文献得知，角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）为碱性成纤维细胞生长因子家族的一员，由间质细胞分泌，通过旁分泌的途径作用于上皮细胞。
因此以研究角质细胞生长因子与口腔黏膜上皮细胞的增殖和凋亡为例，阐述如何利用细胞模型研究EGFR与细胞凋亡的关系。
本实验将不同浓度的KGF 作用于培养的人口腔黏膜上皮细胞，检测其对口腔黏膜上皮细胞凋亡相关基因Bcl-2、BaxmRNA表达水平的影响，探讨其与口腔黏膜上皮细胞的凋亡有何关系。
具体实验操作步骤简要说明：
(1)口腔黏膜上皮细胞的培养及鉴定
通过各种渠道获得状态良好的人口腔黏膜上皮细胞，在37℃、5%CO2培养箱中培养。
每3天换液1次，待细胞生长到覆盖瓶底壁80%时传代。
口腔黏膜上皮细胞体积较小，贴壁生长，呈扁平的卵圆形或多角形如铺路石状。
荧光角蛋白免疫组化标记阳性。
(2)口腔黏膜上皮细胞分组
取对数期口腔黏膜上皮细胞进行传代培养，待细胞密度达到70%~80%融合时，加入D-KSFM培养24h，去除原培养液，根据实验分组分别加入含不同浓度KGF（实验1组5 ng·ml-1，实验2组25 ng·ml-1，实验3组50 ng·ml-1）的D-KSFM，对照组加入等体积无菌PBS（0 ng·ml-1KGF）。
(3)KGF对细胞形态的影响
各组细胞培养12、24、48h后，在倒置显微镜下进行细胞形态学观察。
(4)流式细胞仪检测细胞凋亡率
各组细胞培养48h后，胰酶消化，收集细胞悬液，用预冷的PBS洗涤细胞2次（2000 r·min-1，5 min）。
用400μL 1×Annexin V结合液悬浮细胞，浓度为每毫升1×106个细胞；加入5μL Annexin V-FITC染色液，轻轻混匀后于2~8℃避光孵育15min；加入10μL PI染液后轻轻混匀，2~8℃避光下孵育5min，1h内用流式细胞仪进行检测。
(5)荧光实时定量检测细胞凋亡相关基因Bcl-2、Bax mRNA的表达
各组细胞培养12、24、48h后，收集细胞并提取各组细胞总RNA，经RNA 浓度及纯度检测后，用逆转录试剂盒逆转录成cDNA。
以GAPDH为内参，在8联管中进行Real-Time PCR反应，所有反应在ABI7500型实时荧光定量PCR仪上进行，每个样本检测均重复3次，取其平均值。
存储荧光信号，绘制扩增曲线，得出各样本的扩增循环数（cycle number，Ct）。
采用2-ΔΔCt法计算LOX-1mRNA 的相对表达量，ΔCt=目的基因Ct值-内参Ct值，-ΔΔCt=空白对照组ΔCt值-实验组ΔCt值。
(6)统计分析
采用SPSS 16.0软件进行统计，对检测结果进行单因素方差分析和t检验。
P<0.05为差异具有统计学意义。
2.如何鉴别EGFR是否在乳腺癌中存在突变，缺失或重排？
人类表皮生长因子受体家族（epidermal growth factor receptor family, EGFR家族）属于酪氨酸激酶受体家族。
EGFR基因位于第七号染色体短臂上（7p12），长约118kb，由28个外显子组成。
其转录形成的mRNA长约5.6kb，编码的EGFR是分子量为170kD的跨膜糖蛋白，编码蛋白由1186个氨基酸组成，具有酪氨酸激酶（tyrosine kinase,TK）活性，是传递胞外信号到胞内的重要途经蛋白。
EGFR的突变主要发生在胞内TK区域的前四个外显子上（18~21），目前发现的TK区域突变有30多种。
他们能导致不依赖于配体的EGFR TK 激活，称为激活突变。
激活突变有三种类型：缺失突变、替代突变、复制或插入突变，它们都发生在TK区域的ATP结合口袋上。
EGFR突变检测方法
（1）测序法：DNA测序法是进行EGFR突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。
（2）聚合酶链式反应——单链构象多态性分析（PCR-SSCP）：PCR-SSCP 是一种比较经典的基因突变检测的方法，该方法可以对未知的突变进
行检测。
单链构象多态性（SSCP）是指单链DNA由于有链内碱基配
对而具有一定的空间构象，当碱基发生改变时，单链DN A的会形成不
同的构象。
（3）突变体富集PCR（mutant-enriched PCR）：突变体富集PCR是一种用限制性内切酶选择性消化野生型EGFR基因的两步法PCR，在第一次
PCR后选择性消化野生型的EGFR基因，从而使突变的EGFR基因得
到富集，然后用再进行第二次PCR，最后电泳检测PCR产物，根据
PCR产物的性质（大小或有无）来判断EGFR基因是否发生突变。
（4）探针扩增阻滞突变系统（amplification refractory mutation system，ARMS）：ARMS又名等位基因特异PCR（allele specificPCR ,AS-PCR）。
原理为：利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，PCR引物的3'
端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，针对不同
的已知突变,设计适当的引物以检测出突变基因。
该法在设计引物时，
在引物3'端设计错配碱基，一个与野生DNA互补，一个与突变DNA
互补，使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。
扩增产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时荧光定量PCR
（real-time PCR）测定进行分析。
如何确定EGFR的突变对肿瘤转移的作用机制？
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种跨膜糖蛋白,是蛋白激酶超家族的成员之一。
该蛋白作为表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)家族成员的受体,能够与EGF等配基相结合并激活下游细胞内信号转导通路。
在众多EGFR细胞内信号转导通路中,KRAS/RAF/MEK/ERK以及PI3K/AKT通路是其中最重要的两条通路。
正常情况下EGF等配基与受体的结合可引起受体的二聚化以及酪氨酸的自体磷酸化,并主要通过以上两条通路最终调节细胞的增殖、迁徙、存活以及血管形成等生命活动。
EGFR信号转导通路由于在恶性肿瘤的发生和发展过程中起着重要作用,因而成为分子靶向治疗的重要靶点。
因此可以采用免疫组化的方法研究肿瘤蛋白表达及基因状态，检测原发灶和转移灶蛋白表达是否一致，另外还可以检测EGFR基因突变率与肿瘤发生是否存在一定关系，由此进一步揭示其作用机制，这里可以采用焦磷酸测序仪配套的单链纯化装置从PCR反应液中分离单链DNA；将测序反应板放置于测序仪中进行测序。
然后采用焦磷酸测序仪配套的分析软件进行数据分析，首先进行SNP分析，对于存在杂合子的位点，需进一步进行基因频率(AQ)分析，从而检测出样本中基因的突变率。