基因治疗(概述)知识分享42页PPT
有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
基因治疗(概述)知识分享
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
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51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
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基因治疗
基因矫正、基因置换、基因失活、基因修饰
从临床治疗角度，目前肿瘤基因基因治疗的策略
直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长； 增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤胞； 改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效；
肿瘤基因治疗常用方法
基因干预技术 反义RNA技术：①封闭异常表达的癌基因； ② 作用癌基因的易位和重排部位；⑶抑制肿瘤细胞 的耐药性，提高化疗效果。 RNA干扰技术：用于阻断、抑制癌基因异常表 达的恶性肿瘤治疗。 反义基因技术：设计原癌基因启动子的竞争剂， 从而抑制原癌基因转录。
遗传病的基因治疗研究
人类遗传病4000多种，发病率为40-50%， 必须符合以下要求的遗传病才可考虑开展 基因治疗研究：（30余种） 在DNA水平上明确其发病原因及机制； 单基因遗传病，而且属隐形遗传； 该基因的表达不需要精确调控； 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞 中表达并发挥其生理作用； 该遗传病不经治疗将有严重后果。
基因转移的生物学与非生物学方法
生物学方法：以病毒载体作为转移系统
逆转录病毒基因组经过改造后作为载体 ( retrovirus vector) 腺病毒(adenovirus,AV)基因组可作为载体携带治疗基因
腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus, AAV)载体适合治疗基因的稳定长效表达。
几种已经或可望在临床进行基因治疗的 人类单基因遗传病
腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP) 缺乏症； 血友病：针对凝血因子Ⅸ基因； 中国科学家1991年12月成功进行了血友病B的基因 治疗。 将携带凝血因子Ⅸ基因的巨细胞病毒载体导入患者 自身皮肤的成纤维细胞—— 经体外培养---再植入患者皮下----患者血浆中凝血因子Ⅸ浓度 上升，凝血活性改善。
基因治疗ppt课件
发夹(Hairpin)状核酶的结构。 核酶和底物组成螺旋1、2及 对称的环1、5。4个螺旋包 括18个碱基对，只有一个非 正规碱基对A-G。发夹核酶 分别为2个结构域，结构域I 由螺旋1、2和环1、5组成， 结构域II由螺旋3、4和环2 、 3、4组成。腺苷酸残基 A15连接两个结构域，使它 们相互靠近相互作用，形成 催化反应所必需的三级结 构。环3被认为与催化作用 无关。
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另一类为重组1型单纯疱疹病毒。即 删除了与复制相关及非必需基因， 以减少细胞毒性，可用于宿主神经 元细胞中长期表达外源治疗基因。 但如果宿主神经元已经潜伏了野生 型单纯疱疹病毒，这就很可能重新 激活病毒而进入裂解期。
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基于此哈佛大学的姚丰博士利用病毒自身的 “反式显性失活”（trans-dominant negative）而构建了一个既可抑制自身病毒 复制，又可抑制野生型病毒复制的重组病毒。
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构建腺病毒载体系统，释放和表达端粒酶RNA反义寡
核苷酸(anti-hTR) siRNA。
（a）pAdeno-X的圆形图。此pAdeno-X载体的DNA来
源于5型腺病毒(Ad5) 基因组，通过删除了E1 和E3区
而构建。siRNA表达盒来自pSIREN克隆的PI-Sce I 和
I-Ceu I酶切片段，再将该片段插入到通过PI-SceI 和
（四）单纯性疱疹病毒载体
单纯性疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）基因组为152kb的双链DNA，有3个 复制起始点，3个包装信号位点。 特点： 1.缺失多个基因 仍能复制； 2.只要有包装信号，外源DNA就可 被包装入
病毒颗粒。
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基因治疗ppt课件
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质粒载体介导的细胞内表达siRNA法
通常通过带有RNA pol Ⅲ启动子的siRNA表达 质粒载体，将长度为21nt的针对特定基因的双 链siRNA或者长度为45～50nt的小分子发夹 RNA (small hairpinRNA ,shRNA)转染到细胞 中，shRNA在细胞内会自动被加工成siRNA， 从而引发“沉默”或表达抑制。
此病毒可以作为新型、安全性单纯疱疹病毒 载体，用于临床实验的研究。HSV载体不仅 感染神经元细胞，亦可感染非神经元细胞如 上皮细胞，目前HSV载体已用于恶性间皮瘤、 帕金森症等疾病的治疗研究中。
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HSV作为基因治疗载体有以下特点：
（1）基因组序列已十分清楚； （2）可容30kb外源DNA； （3）宿主范围广，可感染脊椎动物的各种细
（四）单纯性疱疹病毒载体
单纯性疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）基因组为152kb的双链DNA，有3个 复制起始点，3个包装信号位点。 特点： 1.缺失多个基因 仍能复制； 2.只要有包装信号，外源DNA就可 被包装入
病毒颗粒。
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1型单纯疱疹病毒（HSV-1）属于人嗜神经病毒，可
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虽然siRNA在哺乳动物细胞中的应用才开始不久， 但它正以飞快地速度发展成为基因治疗的一种新方 法。
如果siRNA通过尾静脉高压注射能有效到达肝脏， 那么他将有希望广泛应用于治疗各种肝病。
A.P.McCaffrey等（2003）通过表达shRNA的载体 在培养细胞水平和转染HBV质粒后免疫活性缺失 的Ceu I消解的pAdeno-X载体中。
基因治疗(Gene Therapy)PPT精品课程课件讲义
• 基因干预（gene interference）：采用 特定的方式抑制某个基因的表达，或 者通过破坏某个基因而使之不能表达， 以达到治疗疾病的目的。
Hale Waihona Puke 基因置换或基因添加的必要条件
对导入的基因及其产物有详尽的了解 外来基因能有效地导入靶细胞 导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留 导入基因能有适度水平的表达 基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全 无害
• 产物功能：结构基因，调节基因。
基因治疗的概念
• 一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞， 以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗 方法。 • At the most basic level, gene therapy can be described as the intracellular delivery of genetic material to generate a theraputic effect by correcting an existing abnormality or providing cells with a new function.
• 重组型病毒载体:以完整的病毒基因组为改造对
象，选择性删除病毒的某些必需基因（早期基因、 控制表达的基因），缺失的功能由互补细胞反式提 供；利用同源重组方法将适当长度的外源基因插入 病毒基因组的非必需区,不改变病毒复制和包装所 需的顺式元件。
• 无病毒基因的病毒载体：由载体质粒和辅助系
统组成。载体质粒：由外源基因表达盒、病毒复制 和包装所必需的顺式作用元件及质粒骨架组成；辅 助系统：由病毒复制和包装所必需的反式作用元件 组成
基因治疗方式
• 回体基因治疗（ex vivo） • 体内基因治疗（in vivo）
细胞与基因治疗PPT.
• 编码β2肾上腺素能受体的 质粒注入约克猪的右房的起 搏部位, 上调肾上腺素能受体 的表达。 电生理的检测显示, 心房组织 的局部过表达肾上腺素能受体 可以明显增强起搏组织的变时 效应，使现存的或病变的起搏 细胞的功能得到改善和加强。
心速 108→127→163 50%↑
生物性的起搏细胞
• 起搏离子流If是一种超极化激 活的内向离子流, 它介导窦房结的 四期自动除极。
• 干细胞是一种具有多分化潜能和自我复 制功能的早期未分化细胞，在特定的条件下 可能分化为不同的功能细胞，形成多种组织 和器官。
• 目前主要进行的是体外干细胞培养移植研 究，包括胚胎干细胞（embryonic stem cell ， ESC）、骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）等。
Qu J et al. Circulation 2003;107:1106-1109
Pacemaker function in in vitro model
• mHCN2转染的hMSCs 影响耦合的心脏细胞 的兴奋性。
• 综上，过表达HCN2 基因可以增大起搏电 流, 使移植的心肌细胞 具有起搏能力。
• 超极化激活的环核苷酸门控的 ( Hyperpolarization activated cyclicnucleotide gated, HCN ) 通 道是心脏起搏离子流If 产生的基 础。
• HCN基因家族的四个成员目 前发现在心脏中存在的有3 个： HCN1、HCN2 和HCN4。
ECG leads I, II, and RA, and LA (overlying injection site) electrograms during normal sinus rhythm in an anesthetized dog previously injected with HCN2+GFP
心速 108→127→163 50%↑
生物性的起搏细胞
• 起搏离子流If是一种超极化激 活的内向离子流, 它介导窦房结的 四期自动除极。
• 干细胞是一种具有多分化潜能和自我复 制功能的早期未分化细胞，在特定的条件下 可能分化为不同的功能细胞，形成多种组织 和器官。
• 目前主要进行的是体外干细胞培养移植研 究，包括胚胎干细胞（embryonic stem cell ， ESC）、骨髓间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）等。
Qu J et al. Circulation 2003;107:1106-1109
Pacemaker function in in vitro model
• mHCN2转染的hMSCs 影响耦合的心脏细胞 的兴奋性。
• 综上，过表达HCN2 基因可以增大起搏电 流, 使移植的心肌细胞 具有起搏能力。
• 超极化激活的环核苷酸门控的 ( Hyperpolarization activated cyclicnucleotide gated, HCN ) 通 道是心脏起搏离子流If 产生的基 础。
• HCN基因家族的四个成员目 前发现在心脏中存在的有3 个： HCN1、HCN2 和HCN4。
ECG leads I, II, and RA, and LA (overlying injection site) electrograms during normal sinus rhythm in an anesthetized dog previously injected with HCN2+GFP