嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质

嗜热脂肪土芽孢杆菌普鲁兰酶基因的异源表达及重组酶性质肖亚朋;沈微;李婷霖;陈献忠;樊游【摘要】用PCR方法扩增得到嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)XQ3506的普鲁兰酶编码基因GsP,在大肠杆菌中进行异源表达.在没有外源信号肽的条件下,重组酶部分分泌到周质中,少量分泌到培养液中.重组酶表观分子量约为81 kDa,纯酶比活力为38.2 U/mg.重组酶最适温度为60℃,能短时耐受70℃高温;重组酶最适pH6.5,在pH5.5～7.5的范围内具有较好的稳定性;重组酶Km值为0.086 μmol/L,Vmax为0.083μmol/min;K+和Mg2+对重组酶有激活作用,而Ca2+则有抑制作用.重组酶水解普鲁兰糖产物为单一麦芽三糖,对直链淀粉未发现降解作用,是一种Ⅰ型普鲁兰酶.重组酶GsP在直链淀粉、抗性淀粉生产和粉丝酶法生产工艺中有一定的应用前景.%Gene GsP encoding pullulanase was amplified from genome DNA of Geobacillus stearothermophilus XQ3508 by PCR and heterologously expressed in Escherichia coli.Despite absence of exogenous signal peptide,part of the recombinant enzyme was secreted to periplasm and culture medium.The apparent molecular weight of GsP was approximately 81.3 as measured by SDS-PAGE.Specific activity of the purified enzyme was 38.2 U/mg,and optimum pH and temperature of the recombinant enzyme were 6.5 and 60 ℃C,respectively.The enzyme could keep active within a short time at 70 ℃C.The maximal reaction velocity and Michael constant of the GsP was 0.083 μmol/min and 0.086 μmol/L,respectively.The enzyme activity of GsP could be increased by K + and Mg2 + and partially inhibited by Ca2+ The GsP did not degrade amylose.High-performance liquid chromatographyanalysis showed that pullulan could be hydrolyzed by GsP and maltoriose was the single product.Thus,GsP belongs to type Ⅰ pullulanase and it is thermostable.GsP can be applied in production of resistant starch and pure amylose.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2017(043)005【总页数】7页(P30-36)【关键词】嗜热脂肪土芽孢杆菌;异源表达;Ⅰ型普鲁兰酶;蛋白纯化;酶学性质【作者】肖亚朋;沈微;李婷霖;陈献忠;樊游【作者单位】江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,中国高校工业微生物资源数据平台,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡,214122;江南大学,中国高校工业微生物资源数据平台,江苏无锡,214122【正文语种】中文普鲁兰酶是一类淀粉脱支酶，目前工业化生产的普主要是针对淀粉制糖工业中的糖化工艺开发的耐酸性普鲁兰酶[1-3]。

近年来，随着社会发展和产品的日益丰富，以普鲁兰酶为催化剂的新产品和新工艺不断被开发，例如以普鲁兰糖为原料的麦芽三糖制作工艺[4]，以淀粉为原料的直链淀粉、抗性淀粉[5-7]生产工艺，以及粉丝酶法生产工艺[8]等都需要用到普鲁兰酶。

在这些产品的生产工艺中，反应条件不一定是酸性，但酶的热稳定性都对反应的顺利进行、防止杂菌污染以及酶的节约使用有所帮助。

嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)具有较高耐热性，土芽孢杆菌属的模式株即属于该种。

近年来，土芽孢杆菌属的Geobacillus thermoleovorans，以及该属的近缘种厌氧芽孢杆菌属的普鲁兰酶基因先后被克隆并报道了酶学性质[9-11]，而嗜热脂肪土芽孢杆菌的普鲁兰酶基因的表达与重组酶性质却未见报道。

本研究将报道嗜热脂肪土芽孢杆菌 XQ3506普鲁兰酶基因在大肠杆中的高效表达以及重组酶的酶学性质。

1.1 实验材料1.1.1 菌株及质粒出发菌株嗜热脂肪土芽孢杆菌和表达载体pLac03购自无锡先秦生物技术有限公司，产品编号分别为： XQ3506和XQ3619。

G. stearothermophilus XQ3506的16S rDNA基因序列和pLac03全序列已登录美国国家生物技术信息中心(NCBI: )，登录号分别为：KX674365和KX674364。

XQ3506的16S rDNA基因序列与嗜热脂肪土芽孢杆菌模式株IFO12550只有1个碱基差异。

载体pLac03是一种以lac启动子控制外源基因表达的大肠杆菌表达载体。

1.1.2 工具酶和主要试剂核酸内切酶EcoRI、HindIII，以及T4连接酶、Extaq DNA聚合酶等均购自大连宝生物有限公司；胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒为康宁生命科学(吴江)有限公司产品；氨苄青霉素、IPTG 、SDS均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；普鲁兰糖以及葡萄糖、麦芽糖等HPLC 检测标准品均购自Sigma公司；考马斯亮蓝G-250购自国药集团化学试剂有限公司；TB培养基购自北京吉美生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯试剂。

1.1.3 引物在NCBI公布的嗜热脂肪土芽孢杆菌菌株22的基因组序列(登录号：NZ_JQCS01000088.1)中有一条推测为普鲁兰酶编码区的基因，据此设计扩增普鲁兰酶编码基因GsP的引物如下：Pgst1: 5’-AATTACCGGAATTCTTATGCTTCAC￣A￣T￣C￣AGCCGAAC-3’Pgst2: 5’-AATTACCGGGATCCTTATTTTCCGT￣T￣T￣T￣C￣CAC-3’引物Pgst1与鲁兰酶基因编码区5’端一致，引物Pgst2与普鲁兰酶基因编码区3’端互补，引物5’-端各添加了EcoRI和BamHI识别位点。

引物设计后由上海赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2 方法1.2.1 大肠杆菌重组表达载体的构建提取嗜热脂肪土芽孢杆菌XQ3506的染色体DNA，以其为模板，用引物Pgst1和Pgst2进行PCR扩增，得到目标基因片段，用EcoR和BamHI酶切，电泳分离后回收目的片段，与经同样酶切的表达载体pLac03连接后转化大肠杆菌JM109 感受态细胞，在含氨苄青霉素的平板上挑取阳性转化子并提取质粒进行酶切验证和测序。

1.2.2 重组普鲁兰酶诱导表达及产物的SDS-PAGE分析取重组菌单菌落接种含有氨苄青霉素的LB液体培养基，37 ℃，200 r/min振荡培养过夜。

以1%的接种量转接至含有氨苄青霉素的50 mL TB液体培养基，37℃，200 r/min振荡培养。

当菌体的OD600达到0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L继续振荡培养36 h，取适量菌液分别进行胞外、周质和胞质酶活检测。

检测方法如下：12 000 r/min 离心1 min，收集上清液检测胞外酶活。

菌体重悬于含有25%(w/v)蔗糖的高渗处理液中，冰浴4 h，离心去上清，菌体重悬于与发酵液等体积的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，离心，上清液为周质组分，沉淀部分超声波破碎获胞质组分。

SDS-PAGE电泳分析重组酶在细胞周质及全细胞中的表达情况，使用Image Lab 4.0分析重组普鲁兰酶表观分子量。

1.2.3 重组普鲁兰酶的纯化与酶活测定酶的纯化方法：取周质空间粗酶液2 mL，经0.22 μm滤膜过滤，pH 7.0，0.02mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液平衡后上QFF 1 mL阴离子交换柱，用含1mol/L NaCl的pH 7.0，0.02 mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液线形梯度洗脱，流速1 mL/min，自动部分收集器收集洗脱液，每管1 mL，逐管测定酶活力。

然后SDS-PAGE 蛋白电泳验证纯化效果，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，计算酶比活力，纯化倍数和回收率。

酶活检测方法同文献[3]。

1.2.4 重组普鲁兰酶酶学性质研究酶的最适温度测定：在45～70 ℃的范围内，间隔5 ℃测定不同温度对酶活性的影响，以最高酶活性为100%，计算各温度条件下酶的相对活性。

最适pH测定：在pH4.5～8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，间隔0.5，测定酶活，以酶活最高者为100% ，计算相对酶活性。

重组普鲁兰酶稳定性测定：将酶液分别在50、55、60、65、70 ℃金属浴中保温，间隔1.5、3、4.5、6、7.5、9 h分别取样测定酶活性，未经热处理的酶活性为100%，计算酶相对活性；金属离子对酶活影响的测定：以10 mmol/L浓度的金属离子盐溶液代替反应体系中的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，为避免金属离子与磷酸根反应，用去离子水替代缓冲液，用盐酸或NaOH调整至pH6.5，对照用水取代金属离子溶液，测定酶活力，对照为100%，计算酶相对活性。

1.2.5 重组普鲁兰酶动力学参数的测定取8支1.5 mL离心管，依次加入浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4μmol/L 普鲁兰多糖溶液250 μL和最适pH缓冲液175 μL，预热5 min，再各加75 μL适当稀释的纯普鲁兰酶液(各管反应体系中的底物终浓度依次为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 μmol/L)，最适温度下反应5 min．空白管为对应的不同浓度的底物250 μL+缓冲液175 μL+蒸馏水75 μL，最适温度下进行反应。