的分离、培养和人工重建
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定
人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定何黎顾华昆明医学院第一附属医院皮肤性病科云南[摘要]目的：探索实验条件下人表皮干细胞的体外分离、培养及鉴定。
方法：利用细胞工程方法进行组织分离及细胞培养：通过免疫组化方法，利用角蛋白单克隆抗体对培养的角质形成细胞进行鉴定，并利用表皮干细胞的相对特异标识分子——CK19对其进行检测分析。
结果：表皮自真皮较完整分离，电镜及免疫组化证实培养细胞为角质形成细胞，免疫组化结果显示：CK反应阳性，部分细胞CK19阳性，表明有表皮干细胞存在。
结论：体外分离、培养角质形成细胞成功，且分离得到的角质形成细胞中有表皮干细胞存在。
[关键词]：角质形成细胞表皮干细胞细胞培养角蛋白——19对于烧伤、急性创伤、某些疾病导致的皮肤缺损，尤其是大面积烧伤一直以自体皮移植作为首选方案，而自体皮肤不足是临床遇到的主要问题。
随着细胞培养技术和组织工程的出现，使许多脏器或组织体外重建成为可能。
人工皮肤的研制就是一个典型例子。
在这一技术中，种子细胞——角质形成细胞的体外培养，以及体外分离到的角质形成细胞中是否有在体外能大量增殖的表皮干细胞决定了能否成功构建人工皮肤。
为此本课题采用组织分离方法及细胞培养方法进行角质形成细胞体外分离及培养；通过免疫组化方法，利用人广谱单克隆抗体对培养细胞进行鉴定；并利用CK19对体外培养细胞中是否有表皮干细胞进行检测。
材料和方法一、材料1、取材选择6-26岁健康男性，行包皮环切术切除的包皮。
2、主要培养基及试剂(1)磷酸盐缓冲溶液（PBS和D-Hank’s液）：（2）培养基：K-SFM（Gibco公司），编号：37010，内含2.5ug表皮细胞生长因子（EGF）和25mg小牛垂体(BPE)：（3）分离酶：dispase（4）胰蛋白酶；（5）抗人广谱角蛋白单克隆抗体；（6）CK19单克隆抗体；（7）SP 超敏免疫组化试剂盒。
二、方法1、取材将包皮环切术切除的健康包皮组织放入50ml离心管中（内装10mlDMEM培养基，含青、链酶素及硫酸庆大酶素）。
人体生物医学中的组织工程和再生医学
人体生物医学中的组织工程和再生医学随着生物科技的不断发展，人们对于人体生物医学的研究也越来越深入，其中包括了组织工程和再生医学的领域。
这两个科学领域的诞生，对于医疗科技的发展和人类健康的提升，起到了非常重要的作用。
一、组织工程组织工程是一种应用生物技术和工程技术，通过研究分子、细胞、生物材料等多个方面的知识，构建出人工组织和器官来替代或修复患病的组织和器官。
组织工程是一门交叉学科，需要结合生物学、医学、化学、生物材料学、生物工程学等多个学科的知识。
它的目的是提供一种替代品，可以取代不再有用或分解的组织或器官，比如经过严重外伤或疾病切除的组织或器官。
人工组织和器官的制作主要分为三步：首先是通过分离多能干细胞、成体干细胞等不同的原始细胞，接着将原始细胞与生物材料等新型成型材料进行混合，通过培养、支架植入等方式进行培育，最终使其成为人工组织和器官。
组织工程技术的应用范围广泛，不仅可以治疗疾病，还可以在体外制造出肌肉、骨骼、皮肤等人类体内的器官和组织。
此外，组织工程技术也可以制作出动物器官和组织，应用到医疗治疗、新药研发、食品安全检测等多个领域。
二、再生医学再生医学是指通过干细胞、干细胞分化、细胞再生、组织再生等技术，使人体内的组织或器官产生再生能力，实现对病损组织的修复，以促进健康恢复。
再生医学的研究方向主要集中在三个方面：组织再生、细胞再生和干细胞再生。
组织再生是通过细胞材料、生物材料等途径，让受损或失去的组织重新生长，最终让人体恢复正常视觉、听力等人体器官的功能。
细胞再生是指通过细胞复制和培育培养等技术，制造出与原有细胞相同的新细胞。
干细胞再生则是将多能干细胞进行分化，令其形成与原有器官或组织相同的新调节器或组织。
再生医学技术的应用越来越广泛，涉及到多个领域，比如生物医学、生物化学、医学工程、生物医学物理学等。
除了治疗各种疾病外，还可以用于生殖医学、种植体器官等领域。
三、共同点和不同点虽然组织工程和再生医学是两个不同的领域，但它们之间也有了不可分割的联系。
微生物学期末考复习
一、名词解释1.微生物学：研究微生物形态构造以及生命活动规律的学科叫做微生物学。
2.噬菌斑:由于噬菌体粒子对敏感菌宿主细胞的侵染和裂解，而在菌苔上形成具有一定大小、形状、边缘的透明圈，称为噬菌斑。
3.溶源性: 温和噬菌体侵入宿主细胞后，由于基因组整合到宿主细胞的基因组上，与宿主细胞 DNA 同步复制，因此，一般情况下不引起宿主细胞裂解，这称为溶源性。
4.转化：受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，就称转化。
5.消毒：消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌。
6.无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染，自身也不污染操作环境的技术称为无菌技术。
7.菌落：固体培养基中，单个或少数细菌细胞生长繁殖后，会形成以母细胞为中心的一堆肉眼可见、有一定形态构造的子细胞集团是菌落。
8.平板：是被用于获得微生物纯培养的最常用的固体培养基形式，是冷却凝固后固体培养基在无菌培养皿中形成的培养基固体平面称作平板。
9.发酵：发酵是指在无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力[H]不经过呼吸链传递而直接交给某一内源氧化性中间代谢产物的一类低效产能反应。
10.培养基：人工配制的、适合微生物生长、繁殖和产生代谢产物用的混合营养基质。
1．微生物：是一类个体微小、结构简单的低等生物。
包括原核微生物、真核微生物以及属于非细胞类的病毒和亚病毒。
2．病毒：病毒粒子指成熟的、结构完整和有感染性的单个病毒,基本成分为核酸和蛋白质。
3．营养：指生物体从外部环境中摄取对其生命活动必需的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。
４．无氧呼吸: 底物按常规方式脱氢后，经部分呼吸链递氢，最终由无机化合物或有机化合物接受氢的过程称无氧呼吸。
5．同步生长：这种通过同步培养而使细胞群体处于分裂步调一致的状态，就称同步生长。
3.营养物质可以通过被动扩散、协助扩散、主动运输和基团移5.证明遗传物质的基础是核酸的三个著名的实验为转化实验、噬菌体感染实1.发明了外科消毒术的科学家是（ B ）。
骨组织工程研究的新进展:修复骨缺损的完美技术
骨组织工程研究的新进展：修复骨缺损的完美技术李凯【摘要】骨组织工程自20世纪80年代诞生以来,取得了飞速的发展,为临床上骨缺损的治疗带来新的希望.纵观骨组织工程研究的二十多年里,其构成的三大要素:种子细胞方面、支架材料方面和组织构建方面都取得了一定的进展.但是距离组织工程骨在临床中正式使用尚有一定距离,有待进一步的研究.本文就目前骨组织工程研究的现状及最新进展作一综述.%Bone tissue engineering has developed rapidly since the 1980s and brought new hope for the treatment of bone defects. Throughout twenty years, the three major elements of bone tissue engineering: seed cells, scaffolds and organizations to build have made great progress. However, there is still certain distance for tissue engineered bone to be used officially in clinic. In this paper, the current status of bone tissue engineering research and the latest developments are reviewed.【期刊名称】《中国医药导报》【年(卷),期】2012(009)018【总页数】3页(P15-17)【关键词】骨组织工程;骨缺损;研究进展【作者】李凯【作者单位】哈尔滨医科大学附属第三医院骨科,黑龙江哈尔滨150081【正文语种】中文【中图分类】R681.2临床上由于各种原因导致的骨缺损很常见，然而修复骨缺损的惟一方法是通过骨移植来实现。
1132024年再生医学的最新发展和培训需求
加强了人才培养，为再生医学领域输送了 大量优秀专业人才。
展望未来发展趋势，提出建设性意见
趋势一
随着基因编辑技术的不断发展，未来再生医学将更加注重个体化治 疗和精准医疗。
趋势二
人工智能和大数据技术将在再生医学领域发挥越来越重要的作用， 为疾病诊断和治疗提供更加智能化的解决方案。
趋势三
随着社会老龄化趋势加剧，再生医学将更加注重老年相关疾病的防治 和康复。
知识产权保护
加强知识产权保护，鼓励创新，促进再生医学领域的科技成果转化 。
伦理道德问题在再生医学中挑战和应对
伦理原则
在再生医学研究中，应遵循伦理原则，保护受试者的权益和安全 ，避免不必要的人体伤害。
隐私保护
在收集和处理患者数据时，应严格保护患者隐私，防止数据泄露 和滥用。
利益冲突
避免利益冲突，确保研究结果的客观性和公正性。
05 政策法规环境及伦理道德考量
CHAPTER
国家政策法规对再生医学领域影响分析
政策支持
国家出台了一系列政策法规，支持再生医学领域的发展，包括科 研项目资助、技术推广、市场准入等方面的政策。
法规监管
再生医学领域涉及到医疗、药品、生物技术等多个领域，因此需要 遵守相关法律法规的监管，确保行业的规范发展。
展望未来发展趋势，提出建设性意见
趋势四
加强国际合作与交流，共同推进再生医学领 域的科技创新和产业发展。
建议一
加大对再生医学领域的研发投入，鼓励创新 和探索。
建议二
加强人才培养和队伍建设，提高专业人员的 素质和能力。
建议三
建立健全相关法规和政策体系，为再生医学 的可持续发展提供保障。
谢谢
THANKS
开发出新型生物材料、细胞因子和生长因子等，提高组织工程的效 率和安全性。
安徽省合肥市一六八中2024届高三下学期期中调研考试生物试题含解析
安徽省合肥市一六八中2024届高三下学期期中调研考试生物试题注意事项1．考试结束后，请将本试卷和答题卡一并交回．2．答题前，请务必将自己的姓名、准考证号用0．5毫米黑色墨水的签字笔填写在试卷及答题卡的规定位置．3．请认真核对监考员在答题卡上所粘贴的条形码上的姓名、准考证号与本人是否相符．4．作答选择题，必须用2B铅笔将答题卡上对应选项的方框涂满、涂黑；如需改动，请用橡皮擦干净后，再选涂其他答案．作答非选择题，必须用05毫米黑色墨水的签字笔在答题卡上的指定位置作答，在其他位置作答一律无效．5．如需作图，须用2B铅笔绘、写清楚，线条、符号等须加黑、加粗．一、选择题：（共6小题，每小题6分，共36分。
每小题只有一个选项符合题目要求）1．机体能响应外界温度的变化，调整代谢的强度，如下图所示。
寒冷刺激和注射去甲肾上激素（NE）都能引起机体能量消耗提升，其中产生的热量一部分来源于骨骼肌不自主战栗，另一部分来源于棕色脂肪组织代谢产热。
注：解偶联蛋白（Uncoupling protein）是一种线粒体内膜蛋白，这种蛋白质能消除线粒体内膜两侧的跨膜质子浓度差，令利用质子浓度差驱动的氧化磷酸化过程减慢，阻碍了三磷酸腺苷（ATP）的正常产生。
以下有关叙述中，不正确的是（）A．注射NE导致的产热增加有明显的“记忆”效应B．棕色脂肪组织由丰富的交感神经控制，其节后神经元释放的是NEC．骨骼肌不自主战栗产生的热量来自于代谢反应放热和肌肉摩擦等D．棕色脂肪细胞中存在解耦联蛋白，抑制呼吸链，使葡萄糖直接分解散热2．近年来的研究初步表明，βAP（β淀粉样蛋白）沉积是Alzheimer型老年痴呆的主要病因。
βAP是由其前体蛋白APP（一种含695个氨基酸的跨膜蛋白）在病理状态下异常加工而成的。
APP形成βAP的过程如图所示。
根据上述信息所做的推论错误的是（）A．用双缩脲试剂检测βAP，有紫色反应B．βAP的效果可能是引起大脑功能异常C．一个βAP分子中至少含有39个肽键D．β分泌酶很可能是突变基因表达的产物3．对正常二倍体生物而言，以下哪种性状肯定能稳定遗传（不考虑变异）A．优良性状B．隐性性状C．显性性状D．相对性状4．大肠杆菌拟核DNA 是环状DNA 分子。
动物基因工程技术在动物遗传育种上的应用现状与发展前景
工作研究2021.07 畜牧业环境33摘 要：动物基因工程是在分子水平上操纵基因的复杂技术。
它是体外将重组外源基因导入受体细胞的过程，使基因能够被复制、转录和翻译成受体细胞，是当下动物机体改造中最热门的技术。
动物转基因技术、克隆技术和转基因克隆技术是动物基因工程的三个热门技术。
其重要功能与重大意义会成为21世纪最炙手可热的研究领域。
本研究对这三大类技术的发展应用进行了综述，着重说明了基因工程技术在动物育种、遗传检测等方面的应用情况，并讨论了该技术的发展前景。
关键词：动物；基因工程；转基因技术；克隆技术；遗传育种1 动物基因工程技术概述1973年，HBoyer和Cohen及其团队成功进行了体外重组实验，获得了具有双重抗性的大肠杆菌转化子（卡那霉素和四环素），标志着基因工程的诞生。
基因工程是指狭义的基因工程。
它是指在体外剪接和重组供体基因和载体，然后将它们转移到另一个有机体（受体），并根据人们的需要稳定地遗传它们，表达新的性状或产生新的产品。
重组DNA分子在受体细胞中扩增，因此可以称为分子克隆或基因克隆。
动物基因工程一般包括传统操作技术中的杂交技术、现代操作技术中的基因工程和细胞生物工程，充分体现了重组DNA技术的工业化设计和实际应用，包括进行基因重组、克隆和表达（DNA重组技术）的设计和构建的上游技术，以及规模化培养基因工程菌和提取外源基因表达产物并纯化的下游技术。
将下游操作工艺和装备复杂化会为上游重组DNA技术带来困难与麻烦，同理忽视上游重组的实现则是下游技术的桎梏——基因工程产业化的基本原则。
基因工程是利用基因重组，进行体外剪切拼接，获得重组后的新的目的基因，然后导入细胞或微生物体内并成功得到表达，从而产生人类需要的产物。
基因工程是极具理论与技术性的当代前沿技术。
设计重组和表达分别在基因水平及细胞、组织和动物个体水平进行的便是动物基因工程。
主要分为三大类。
1.1 转基因动物人工培养从动物体内分离提取或人工构建的目的基因，并进行重建和扩增，再将此目的基因导入受精卵原核或细胞质中，使其在受体细胞的基因组中稳定存在，移入母体，形成新个体。
组织工程技术在医学中的应用
组织工程技术在医学中的应用一、引言随着科技的不断发展和医疗水平的提高，医学界对于治疗和修复组织的需求也越来越高。
而在这个领域中，组织工程技术的应用便得到了广泛的关注和研究。
组织工程技术是一项将工程学和生物学相结合的技术，可以用于重建、修复、甚至是再造组织。
本文将介绍组织工程技术在医学中的应用。
二、组织工程技术的概述组织工程技术是一种利用生物材料、生物工程和细胞培养等技术，来创造完整生物组织或器官的技术。
它的出现主要是为了解决传统的人工修复或移植无法解决的问题，如移植排异反应、供体不足等。
组织工程技术的具体步骤包括：细胞分离和培养、生物材料筛选、构建组织结构和培养器官等。
三、组织工程技术在医学中的应用1、组织重建组织重建是组织工程技术最为广泛应用的领域之一。
以皮肤为例，传统方法需要采用皮瓣移植或人工皮肤移植。
而组织工程技术可以通过细胞培养的方式，培育出已经形成一定组织结构的生物材料，再进行移植和生物毡的应用，最终达到修复皮肤的效果。
此外，组织工程技术还可用于修复骨骼、软骨、肌肉等生物组织。
2、器官修复和再生器官修复和再生是组织工程技术在医学中的另一个研究热点。
由于器官损坏或因疾病无法正常工作，再造器官便是重要的研究方向。
例如，血管再造便是组织工程技术在心血管领域中的应用之一。
研究人员可以利用生物工程和细胞培养，构建出需要的血管类型，再进行移植。
此外，类似的技术也可以用于心脏、肝脏、肺等器官的修复和再生。
3、药物筛选和药效评估组织工程技术还可以用于药物筛选和药效评估。
对于传统的药物研发，往往需要进行动物实验，然后才能够进行临床试验。
而且动物实验往往不完全符合人体的生理情况，导致药物研发效率低下。
而利用组织工程技术，研究人员可以构建出人工器官，进行药物筛选和药效评估，从而降低了药物研发成本和时间。
四、面临的挑战和未来展望尽管组织工程技术在医学中的应用已经取得了许多进展，但它还面临着一些挑战。
例如，目前在组织重建方面仍然存在许多技术上的限制，如难以控制生长、细胞寿命短、缺乏多种功能等。
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THANKS
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思考题： 1．衣共生菌的分离方法有哪些？并简述孢子释
放法步骤。 2．共生藻的分离培养方法有哪些？ 3．简要说明地衣人工重建的研究进展。
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1、地衣型真菌常用的培养基
• WA4培养基——含4%蒸馏水的琼脂培养基
琼脂 4g 蒸馏水补足100ml
• MY培养基——麦芽酵母提取物培养基
麦芽提取物 20g / 酵母提取物 2g / 琼脂20g / 蒸馏水补足1000ml
• LB培养基——Lilly and Barnett’ s培养基
第三章 地衣共生菌藻的分离、 培养和人工重建
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• 地衣是否能分为单 个生物
• 不同有机组织的相 互关系
• 更多的了解地衣的 生理、形态、发育 和分子生物学方面 的问题
• 次生代谢物的研究
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一、共生真菌的分离和培养
1、地衣型真菌常用的培养基 2、子囊孢子释放法 3、组织培养法 4、培养共生菌的保存
• 共生菌可以存放很长时间 （大约一年左右）。 • 通常共生菌在15~20℃时表现出最大生长率。每
种均有其最适生长PH值，通常PH范围为5~6。 太高或太低的PH均会阻碍其生长。
• 在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。
• 地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍能保 持活性。
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二、共生藻及蓝细菌的分离和培养
的土壤。 （2）用筛孔约1~2mm的筛子将500g土壤过筛，然后在其中
加入100ml的二次蒸馏水。 （3）将湿的土壤放入100×15mm的玻璃皮氏皿中，填充高
度为8mm。对其进行高压灭菌后放置24小时，然后再次 高压灭菌。
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（4）用无菌培养的共生绿藻和蓝细菌对土壤进行接种， 然后在以上所描述的培养条件下对其进行培养。
• （2） 每2-3个月将生长的群体转移到相同成分的新鲜培养 基上，在相同的条件下培养。地衣共生藻也可以在液氮下 冷冻保藏相当长的时间仍保持活性。
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三、地衣菌、藻共生的人工重建
Stocker-Wörgötter（1994） 地衣体人工重建的基本操作步骤如下： （1）收集你想重建的地衣（如Peltigera aphthosa）基物处
上。
（4）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的 的共生藻层盖上，轻轻压玻片，将地衣体磨成较小碎片。 这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械 地同共生菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。
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• 较小地衣体：
清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之 间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的处理，由于 小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这 样会得到含有菌藻的悬浊液。也可以采用搅拌器 或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱 的细胞受到破坏，因此，应采用较温和的方法处 理，如在两玻片间轻轻磨动。
葡萄糖10g / 天冬酰胺酸2g / KH2PO4 1g / MgSO4•7H2O 0.5g /
F0.e1(mNgO3)/3维•9H生2素O B0.12
mg / 0.1mg
/Z维nS生O4素•7HH2O5ug0.2/m蒸g 馏/ M水n补SO足4•140H02mOl
可以在以上组分上加入15~20g的琼脂，并补足 1000ml，并
• 对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣），可将 其放入装有1~2 ml的无菌水和一滴Tween－20的小试管中。 超声波粉碎约3分钟。离心去除地衣体表面的附属物。
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2）地衣体匀浆液的制备 • 大型地衣（枝状或叶状）： （1）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。 （2）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。 （3）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片
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5、共生藻培养的保存
• 在低光照的条件下，可以培养很长一段时间 （约1年） 。 最好每2~3个月传代一次。大多数的地衣共生藻的最佳生 长温度为15~20℃。其生长的最佳pH范围是4~7。
• （1）用解剖刀将带有琼脂培养基的共生藻群体分为几部 分（约５mm2），将群体放在有合适培养基的皮氏培养皿 中培养2-3个月.
制成固体培养基。
• LBG 培养基——Lilly and barnett gelrite 培养基
LB培养基中以1%的Gelrite 代替琼脂。
注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前应 将所有培养基进
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3、组织培养法
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4、培养共生菌的保存
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3、共生藻的培养
• 含共生藻的悬浊液 • 15天培养：15～20℃ • 共生藻群（1个月左右） • 要注意藻的污染
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4、无菌培养群体的分离
直接挑选法：体视显微镜 喷雾法 微量吸管吸法 离心法
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利用喷射法对共生整理藻课进件 行分离的方法
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利用微量锡罐分离单个细胞的共生藻
1、培养基 2、培养前处理 3、共生藻的培养 4、无菌培养群体的分离 5、共生藻培养的保存
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1、培养基 • BBM培养基——Bold’s Basal Medium • 3× N BBM培养基 • Trebouxia培养基 • MDM培养基
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2、培养前处理
1）清洗
• 对于大型地衣（叶状和枝状）：从地衣体顶端切下约1㎝ 2，然后放在自来水中浸泡5~10分钟，用画笔刷在流动的 自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。
（5）准备好用于人工重建的分离的共生真菌，并将其转 移到无糖的液体培养基上（如BBM），然后培养约1 个月。
（6）将匀浆所得的菌丝体覆盖到绿藻或蓝细菌群体上。
（7）将重建群体在培养室中培养，培养室条件应同他们 共生藻的生长条件一致。
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思考题：
1．地衣共生菌分离方法有哪些？并简述孢子释放法步骤。 2．共生藻的分离培养方法哟哪些？ 3．简要说明地衣人工重建的研究进展。