酶作为生物催化剂的特点

酶作为生物催化剂的特点：1，用量少而催化效率高；2，专一性高；3，反应条件温和

4，可调节性

影响酶催化作用的因素：1，底物浓度对酶促反应速度的影响在低底物浓度时, 反应速度与底物浓度成正比，表现为一级反应特征。当底物浓度达到一定值，几乎所有的酶都与底物结合后，反应速度达到最大值（Vmax），此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为零级反应。2. pH 的影响在一定的pH 下, 酶具有最大的催化活性,通常称此pH 为最适pH。pH影响酶活力的原因可能有以下几个方面：（1）过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏，引起酶构象的改变，酶活性丧失。（2）当pH改变不很剧烈时，酶虽未变性，但活力受到影响。（3）pH影响维持酶分子空间结构的有关基团解离，从而影响了酶活性部位的构象，进而影响酶的活性3. 温度的影响一方面是温度升高,酶促反应速度加快。另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。4．酶浓度的影响在一个反应体系中，当[S]>>[E]反应速率随酶浓度的增加而增加（v=k[E]）,这是酶活测定的基础之一。5 抑制剂对酶活性的影响使酶的活性降低或丧失的现象，称为酶的抑制作用。能够引起酶的抑制作用的化合物则称为抑制剂酶的抑制剂一般具备两个方面的特点：a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。能够与酶的活性中心以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。6．激活剂对酶反应的影响凡能提高酶活力的物质都称为激活剂，有的酶反应的系统需要一定的激活剂。

酶的分类与命名(1) 氧化还原酶AH2 ＋ B ＝ A ＋BH2主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶

例，醇＋NAD＋＝醛或酮＋NADH ＋H＋→氢供体是醇，氢受体是NAD＋

系统命名→醇：NAD＋氧化还原酶；推荐名→采用某供体脱氢酶，如醇脱氢酶

(2) 转移酶AB ＋C ＝A ＋BC系统命名：“供体：受体某基团转移酶”。推荐名：“受体（或供体）某基团转移酶。例，L-丙氨酸＋2-酮戊二酸＝丙酮酸＋L-谷氨酸丙氨酸氨基转移酶→L-丙氨酸：2-酮戊二酸氨基转移酶表明该酶催化氨基从L-丙氨酸转移到2-酮戊二酸。(3) 水解酶系统命名：先写底物名称，再写发生水解作用的化学键位置，后面加上“水解酶”。推荐名：在底物名称的后面加上一个酶字。

(4) 裂合酶系统命名：“底物-裂解的基团-裂合酶”。

如L-谷氨酸1-羧基-裂合酶，表明该酶催化L-谷氨酸在1-羧基位置发生裂解反应。

推荐名：在裂解底物名称后面加上“脱羧酶”（decarboxylase）、“醛缩酶”（aldolase）、“脱水酶”（dehydratase）等，在缩合反应方向更为重要时，则用“合酶”( synthase)。

例子，如谷氨酸脱羧酶（L-谷氨酸＝γ-氨基丁酸＋CO2），

苏氨酸醛缩酶（L-苏氨酸＝甘氨酸＋乙醛），

柠檬酸脱水酶（柠檬酸＝顺乌头酸＋水），

乙酰乳酸合酶（2-乙酰乳酸＋CO2 ＝2-丙酮酸）。

(5) 异构酶Isomerase 异构酶按照异构化的类型不同，分为6 个亚类。命名时分别在底物名称的后面加上异构酶（isomerase），、消旋酶（racemase）、变位酶（mutase）、表异构酶（epimerase）、顺反异构酶（cis-trans-isomerase）等。

(6) 合成酶Ligase or Synthetase

系统命名：在两个底物的名称后面加上“连接酶”。如谷氨酸：氨连接酶，其催化反应式为：L-谷氨酸+ 氨+ ATP ===== L-谷氨酰胺+ ADP +Pi。

推荐名：在合成产物名称之后加上“合成酶”。

如，天门冬酰胺合成酶，其催化反应式为：

L-天门冬氨酸+ 氨+ATP == L-天门冬酰胺+ AMP +PPi。

酶活力测定的步骤：

(1)根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成溶液。

(2)根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH值、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。

(3)在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，反应时间。

(4) 运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。

注意：若不能即时测出结果的，则要及时终止反应，然后再测定。

酶活力：酶催化一定化学反应的能力。酶催化的反应速率快，酶活高。

酶活单位U：在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量。（浓度/时间）

酶的比活力：用每mg蛋白质所含酶活力单位数，比活愈大，纯度愈高。

比活力＝酶活力U/mgPr＝总活力U/总蛋白mg

酶的转换数Kp，又称为摩尔催化活性（molar catalytic activity ），是指每个酶分子每分钟催化底物转化的分子数。即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。是酶催化效率的一个指标。通常用每微摩尔酶的酶活力单位数表示。单位为min-1 。

底物转变摩尔数（mol）酶活力单位数（IU）

Kp ＝＝

酶摩尔数。分钟（mol·min）酶微摩尔数（μmol）

一般酶的转换数在103 min-1左右，碳酸酐酶的转换数最高，达到3.6×107

转换数的倒数称为酶的催化周期。催化周期是指酶进行一次催化所需的时间。单位为毫秒（msec）或微秒（μsec）。即T = 1/ Kp

酶结合效率（酶的固定化率）是指酶与载体结合的百分率。酶结合效率的计算一般由用于固定化的总酶活力减去未结合的酶活力所得到的差值，再除以用于固定化的总酶活力而得到。

加入的总酶活力—未结合的酶活力

酶结合效率=

加入的总酶活力

酶活力回收率是指固定化酶的总活力与用于固定化的总酶活力的百分率。

固定化酶总活力

酶活力回收率= x 100%

用于固定化的总酶活力

相对酶活力的测定：具有相同酶蛋白（或酶RNA）量的固定化酶活力与游离酶活力的比值称为相对酶活力。

组成型酶（Constitutive enzyme）：生物细胞中合成的酶的量比较恒定，这些酶的合成速率影响不大。如DNA聚合酶、RNA聚合酶、糖酵解途径的各种酶等。

适应型酶（Adaptive enzyme）或调节型酶（Regulated enzyme）：生物细胞中合成的酶的含量却变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。如大肠杆菌β-半乳糖苷酶。

发酵条件及控制：

pH值的控制细胞生产某种酶的最适pH值通常接近于该酶催化反应的最适pH值。

（随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累, 培养基的pH值往往会发生变化。这种变化的情况与细胞特性有关，也与培养基的组成成分以及发酵工艺条件密切相关。

含糖量高的培养基，由于糖代谢产生有机酸，会使pH值向酸性方向移动；

含蛋白质、氨基酸较多的培养基，经过代谢产生较多的胺类物质，使pH值向碱性方向移动；

◆以硫酸铵为氮源时，随着铵离子被利用，培养基中积累的硫酸根会使pH值降低；

◆以尿素为氮源的，随着尿素被水解生成氨，而使培养基的pH值上升，然后又随着氨被细胞同化而使pH值下降；

◆磷酸盐的存在，对培养基的pH值变化有一定的缓冲作用。

◆在氧气供应不足时，由于代谢积累有机酸，可使培养基pH值向酸性方向移动。

◆调节pH值的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；

◆也可以使用缓冲液来稳定pH值；

◆或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的pH值，以满足细胞生长和产酶的要求。）

温度的控制有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长最适温度有所不同，而且往往低于生长最适温度

溶解氧的控制控制溶解氧方法调节通气量调节氧的分压调节气液接触时间调节气液接触面积改变培养液的性质

蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。

性质方法

分子大小透析、超滤、密度梯度离心、凝胶过滤

溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀

电荷电泳、离子交换层析

吸附性质吸附层析（羟基磷灰石层析、疏水作用层析）

对配体分子的生物亲和力亲和层析

β=LogSo ：取决于酶的性质，也与温度和pH有关。

Ks：主要取决于盐性质。与离子价数成正比，与离子半径与溶液介电常数成反比。

β与Ks确定后，蛋白酶溶解度决定于I

Ks分段盐析: T、pH一定下改变离子强度

β分段盐析: 一定盐和离子强度下，改变T、pH

常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。

离子交换层析原理:根据离子交换树脂对需要分离的各种离子的亲和力不同而达到分离的目的。酶是两性物质，当溶液的pH值大于酶的等电点时，酶分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离，反之，用阳离子交换剂。

离子交换树脂通常是不溶于水的高分子物质，分子中含有可解离的基团.含有酸性可解离基团的称为阳离子交换树脂，可解离出H+，含有碱性可解离基团的称为阴离子交换树脂，可解离出OH-。

离子交换层析的基本原理若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。

离子交换剂的选择与处理是含有若干活性基团的不溶性高分子物质；

引入不溶性母体的活性基团可以是酸性基团，作为阳离子交换剂；也可是碱性基团，作为阴离子交换剂；

平衡常数Ｋ；（１）离子交换剂的选择；（２）离子交换剂的处理。

几种重要的修饰反应：烷基化反应酰化反应氧化还原反应芳香环取代反应

定点突变技术是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（Protein Engineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。

酶分子的定点突变1、基因序列分析2、蛋白质结构分析3、酶活性中心分析4、引物设计进行基因定点突变5、酶基因克隆表达6、变异特性分析

所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。

定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。

定向进化=随机突变+选择

水在酶催化反应中发挥着双重作用:

一方面,水分子直接或间接地通过氢键疏水键及范德华力等非共价键相互作用来维持酶的催化活性所必需的构象,与酶分子紧密结合的一层左右的水分子对酶的催化活性是至关重要的,称之为必需水,不同酶与必需水结合的紧密程度及所结合的必需水数量是不同的;

另一方面水是导致酶的热失活的重要因素,有水存在时随着温度的升高酶分子会发生以下变化而失活:(1)形成不规则结构;(2)二硫键受到破坏;(3)天冬酰胺和谷氨酰胺水解变为相应的天冬氨酸和谷氨酸;(4)天冬氨酸肽键发生水解.

因此在非水相酶反应体系中存在着最佳含水量,该最佳含水量不仅取决于酶的种类也与所选用的有机溶剂有关.

最适水量：蛋白质结构的动力学刚性和热力学稳定性之间的最佳点平衡点，酶活性最大，保证酶的极性部位水合，表现酶活力所必需

水活度与溶剂极性大小无关，最适含水量与溶剂极性成正比，故采用水活度作参数更确切；有机溶剂主要通过以下三种途径发生作用:

一是有机溶剂与酶直接发生作用通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象从而导致酶的活性被抑制或酶的失活;

二是有机溶剂和能扩散的底物或反应产物相互作用影响正常反应的进行;

三是有机溶剂还可以直接和酶分子周围的水相互作用

固定化技术优点(1)提高酶稳定性；(2)可反复或连续使用；(3)易于和反应产物分开；（4）酶反应过程可严格控制；（5）产物溶液无酶残留，简化提纯工艺；（6）较游离酶更适合多酶反应；（7）增加产物收率，提高产物质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。

缺点：（1）固定化时酶活有损失；（2）增加了生产初始成本；（3）只能用于可溶底物且较小分子；（4）与完整菌体相比不适宜于多酶反应；（5）胞内酶须分离。