高效液相色谱法测定多种维生素多种矿物质片中的维生素D3含量
复方钙片中维生素D3的含量测定
复方钙片中维生素D3的含量测定目的建立高效液相色谱法测定复方钙片中维生素D3的含量。
方法采用Venusil MPC18（4.6×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相：甲醇；流速：1 ml/min；检测波长：265 nm；柱温：25℃；进样量：20 μl。
结果维生素D3在0.6～3.0 μg/ml 的范围内有良好的线性关系，平均回收率为98.62%。
结论本实验建立的高效液相色谱法快速，简便，准确，可用于复方钙片中维生素D3的含量测定。
标签：维生素D3；高校液相色谱法；含量测定维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。
它可以帮助人体更好地吸收钙，增强骨骼韧性和密度，预防骨质疏松，此外还能预防很多慢性病像癌症，糖尿病，风湿性关节炎，多发性硬化，自体免疫等疾病[1-3]。
人体所需钙量因年龄、生理及病理等不同而异。
人们可以根据自己的需求适当补充维生素D和钙。
维生素D3是维生素D家族中的重要成员。
实验室前期制备了维生素D3和钙的复方制剂，为了控制该制剂中维生素D3的质量，建立了高效液相色谱法测定维生素D3的含量。
1仪器与试药Agilent1100高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；KQ5200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RJ-TGL-16C臺式高速离心机（无锡市瑞江分析仪器有限公司）；复方钙片（本院自制）；维生素D3对照品（1000611-200607，中国药品生物制品检定所）；甲醇、乙醇均为分析纯。
2方法与结果2.1色谱条件色谱柱：Venusil MPC18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇；流速：1 ml/min；检测波长：265 nm；柱温：25℃；进样量：20 μl。
2.2溶液的制备2.2.1对照品溶液的制备精密称取5 mg的维生素D3对照品置于250 ml的棕色量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，使成为20 μg/ml的对照品溶液。
精密吸取该对照品溶液3 ml置于50 ml棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得1.2 μg/ml的对照品溶液。
HPLC法测定多维片中痕量维生素D3的含量
HPLC法测定多维片中痕量维生素D3的含量王乔飞【摘要】建立了运用HPLC法对痕量VD3进行含量测定的分析方法.实验中采用菲罗门硅胶(silica)柱,以异丙醇:正己烷(0.5:99.5) 为流动相, 流速:2ml/min,紫外检测波长:264nm,柱温:30℃.实验表明:VD3在0.1μg/ml ～0.8μg/ml范围内,其色谱峰面积与质量浓度呈良好线性关系,r=0.9999(n=5),平均回收率为99.04%,进样精密度为1.26%.本法操作简便、快速,准确,适用于痕量成分的含量测定.【期刊名称】《淮阴工学院学报》【年(卷),期】2010(019)003【总页数】3页(P82-84)【关键词】维生素D3;高效液相色谱;含量测定【作者】王乔飞【作者单位】江苏江山制药有限公司,江苏,靖江,214500【正文语种】中文【中图分类】R917多维片是综合营养保健品，其成份极其复杂，不但包括各种水溶性和脂溶性维生素，还有多种补充的微量元素，其中VD3是一种脂溶性维生素，其含量极低，样品中仅约含2.5ug/g，且性质不稳定，遇光和空气均易变质、降解，而且其它杂质对其稳定性和检测都有影响和干扰，其含量测定一直是个瓶颈难题。
有关资料提供的方法，主要采用添加碱液进行皂化反应，然后采用石油醚、乙醚多次萃取，再用氮气流吹干处理。
不但操作过程繁琐，而且样品的回收率不稳定，操作的重现性很差。
有的方法在对样品中VD3充分溶出作了考虑，但在处理过程中缺少抗氧、防吸附，减少干扰等措施，致使成分仍有损失而回收率偏低。
有文献报道，采用反相色谱系统测定，但对于脂溶性维生素采用反相系统，样品回收率不满意。
本文提供了一个实用、易操作的检测方法，无需进行皂化处理和反复萃取等繁琐操作，而是针对VD3性质不稳定，制剂成分复杂的情况，分别采取了避光、抗氧，抗干扰分离手段，取得了较好效果。
特别适用痕量VD3的准确测定。
该方法未见报道。
1 仪器与试药1.1 仪器Agilent 1200 HPLC系统，配紫外检测器。
高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D_2和维生素D_3的含量
高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D_2和维生素D_3的含量梁晓艳【期刊名称】《广西中医学院学报》【年(卷),期】2007(10)2【摘要】[目的]建立反相高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素133的含量。
[方法]采用KromasilC18反相色谱分离柱，流动相为甲醇．乙腈（90：10），检测波长为265nm，流速为0．8ml／min，加入维生素A和维生素E进行干扰试验。
[结果]维生素耽、D3在0．5～100mg／L浓度范围内线性关系良好，维生素D2平均加样回收率98．9％～108．4％，RSD2．22％～4．28％；维生素A和维生素E不干扰测定。
[结论]本方法简单，易于操作，分离效果好，结果准确，受干扰因素小，适宜测定片剂中的维生素D2和维生素D3。
【总页数】4页(P58-61)【关键词】维生素D2;维生素D3;高效液相色谱法;钙镁D片【作者】梁晓艳【作者单位】广西中医学院附属瑞康医院【正文语种】中文【中图分类】R917【相关文献】1.高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素D3的含量 [J], 梁晓艳2.浅谈高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素D3的含量 [J], 张良;毕翠芳;杜昕;王会强3.正相高效液相色谱法测定钙加维D咀嚼片中的维生素D3含量 [J], 胡桂丽;钱金华;张晓燕;朱荣成4.高效液相色谱法测定碳酸钙D3咀嚼片中维生素D3的含量 [J], 邢俊波;姜春来;靳守东;曹红;陈玉敏;水彩红;单婷婷;胡丹5.浅谈高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素D3的含量 [J], 张良; 毕翠芳; 杜昕; 王会强因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
高效液相色谱法测定维多宝泡腾片中的维生素D3的含量
高效液相色谱法测定维多宝泡腾片中的维生素D3的含量
张玫;刘新宇
【期刊名称】《上海医药》
【年(卷),期】1998(019)002
【摘要】目的：探讨维多宝泡腾片中维生素Ｄ３的含量的测定方法。
方法：高效
液相色谱法。
采用Ｎｏｖａ－Ｐａｋ硅胶色谱柱，二氧六环－１－辛醇－正乙烷（３：１：９６）为流动相，紫外检测波长２６５ｎｍ。
结果：维生素Ｄ３平均回收率为９９．４０％，ＲＳＤ为１．４０％（ｎ＝３）。
结论：本方法简便、准确、快速，且重现性好，适用于维生素Ｄ３的常规分析。
【总页数】2页(P36-37)
【作者】张玫;刘新宇
【作者单位】上海市药品检验所;上海市药品检验所
【正文语种】中文
【中图分类】R977.24
【相关文献】
1.反相高效液相色谱法测定复方维生素泡腾片中维生素C的含量 [J], 薛继雄;刘金来
2.高效液相色谱法测定碳酸钙D3咀嚼片中维生素D3的含量 [J], 邢俊波;姜春来;
靳守东;曹红;陈玉敏;水彩红;单婷婷;胡丹
3.一维反相高效液相色谱法测定保健食品中维生素D2和维生素D3 [J], 刘剑;易
路遥;晏亮;吉伟佳;虞雪军
4.高效液相色谱法测定多种维生素多种矿物质片中的维生素D3含量 [J], 韦月早;杨世联;黄艳芳;韦艳妮
5.高效液相色谱法测定婴幼儿营养米粉中维生素A、D3和E含量的不确定度评定[J], 张荣彬;戴志勇;李梦怡;陈振桂;任国谱
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高效液相色谱法同时测定钙镁D片中维生素D2和维生素D3的含量
（ 辑 编
陈明 伟 ）
高效液 相 色谱法 同时测定钙镁 Ｄ片 中 维生 素 Ｄ 和维生素 Ｄ 的含量 ‘ ２ ３
梁晓 艳
（ 西 中 医学院 附属 瑞康 医院 ， 西 南宁 广 广
摘
５０１） ３ ０ １
要 ： 目的］ ［ 建立反相 高效液相 色谱 法 同时测定钙镁 Ｄ片中维生素 Ｄ 和维生素 Ｄ 的含 量 。［ 法］ 用 Ｋｏ ａ ｌ ｌ ２ ３ 方 采 ｒ ｓ Ｃ８ ｍ ｉ
宜测定 片剂 中的维生 素 Ｄ 和 维生素 Ｄ 。 ２ ３
关键词 ： 维生 素 Ｄ ； 生 素 Ｄ ； ２维 ３ 高效 液 相 色谱 法 ； 镁 Ｄ 片 钙
中图分 类号 ： ９ ７ 文献标识码 ： 文章编号 ：０ ８ ４ ６ ２ ０ ）２ ０ ８—０ Ｒ １ Ａ １ ０ —７８ （０ ７０ —０ ５ ４
．
Ｖ
图 ３ 金花茶 叶 乙醇液 二阶导数光谱 图
Ｖ 一
图 ６ 金 花茶叶氯仿液二 阶导 数光谱图
３ 讨
论
３ １ 在可见 紫外 鉴别中 ， 花茶 叶可 供鉴别 的特征峰较 多 ， ． 金
特别是其 氯仿提取液在 可见 光区和紫外 光 区特征 峰更 明显 。 在 乙醇液零 阶光 谱图 中， ２ ３ ２ ６ ６ ３１ Ｉ 长处 有 明显 在 ４ 、 ７ 、 ６ １ 波 ２ Ｔ
骨质 疏松 症 ， 以及 预 防癌 症 、 多囊 性 卵巢综合 征 、 牛皮癣 、 糖
Ａ ｎ：３ ．９ Ｃ一１ １７ ， ＝０ ９ ９ ６ ３５ ９ ．９ ９ ｒ ．９ ９ 。结果 表明维 生素 Ｄ 、 ２ 在 ０．～１ ０ ／ ５ ０ ｍｇ Ｌ浓 度范围内均有 良好的线性关系 。
一维反相高效液相色谱法测定保健食品中维生素D2和维生素D3
一维反相高效液相色谱法测定保健食品中维生素D2和维生素D3分析检测一维反相高效液相色谱法测定保健食品中维生素D2和维生素D3刘剑易路遥* 晏亮吉伟佳虞雪军江西省药品检验检测研究院江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心章提出利用一维反相高效液相色谱法测定片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健食品中维生素D的含量。
方法：样品经淀粉酶水解，其中加入抗氧化剂；水解后加入氢氧化钾皂化，再用石油醚提取，经氮吹至近干，用甲醇溶解摇匀。
经0.22μm 有机滤膜过滤后供液相色谱仪分析。
以Thermo Accucore Polar Premium(100mm*4.6 mm)为分离柱，甲醇-乙腈为流动相，流速为0.8ml/min，进样量为20μL,在DAD波长264nm处作检测。
检出限为0.7μg/100g，方法中维生素D2平均回收率为93.7%-98.8% ；相对标准偏差0.5%-5.6 %；维生素D3平均回收率为92.8%-99.1% ；相对标准偏差0.3%-6.7 %。
该方法快速、简便、准确，适用于片剂、颗粒、软胶囊和硬胶囊保健食品中维生素D测定。
试验部分仪器与试剂。
高效液相色谱仪(美国，型号Ultimate)，电子天平(美国，型号XS205DU)、紫外可见分光光度计(日本，型号U-3900)，氮吹仪（美国Orgnomation公司）。
维生素D2（中国食品药品检定研究院）标准品和维生素D3标准品（中国药品生物制品鉴定所）。
乙腈、甲醇、2，6-二叔丁基对甲酚、无水乙醇均为色谱纯；石油醚、抗坏血酸、氢氧化钾为分析纯；α-淀粉酶活力300U/mg。
标准溶液配制。
标准储备液的制备:精密称取维生素D2标准品11.86mg，置50mL棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密称取维生素D3标准品12.09mg，置50mL棕色量瓶中，用乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；于4℃条件下储存备用。
标准储备液浓度的校正：精密吸取维生素D2和D3标准储备液各500μl于各10ml棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度,混匀，分别用1cm比色皿中，以无水乙醇为空白参比，在264nm波长处测定吸光值，得维生素D2储备液浓度为222.4μg/ml和维生素D3储备液浓度为236.8μg/ml。
高效液相色谱法测定保健品中维生素D 含量
高效液相色谱法测定保健品中维生素 D 含量
□ 罗 骁 吴帅龙 李彩玲 广电计量检测（合肥）有限公司
摘 要：建立了一种使用液相色谱 - 紫外检测器，以维生素 D2、D3 互为内标，测定保健食品中维生素 D 的方法。样 品经淀粉酶水解，无水乙醇 - 氢氧化钾皂化，皂化液用石油醚萃取、水洗、干燥，旋转蒸发至约 2 mL，氮吹至干，甲醇溶 解定容，内标法定量。维生素 D2 和维生素 D3 的分离度为 1.5，线性范围为 0.01 ～ 5.0 μg/mL，相关系数 R2 ≥ 0.999； 相对标准偏差 RSD（n=6）为 2.82% ～ 5.10%；加标回收率 96.23% ～ 104.26%。当取样量为 5.000 g 时，VD2、VD3 的 检出限均低于 0.2 μg/100 g。
关键词：维生素 D；保健食品；液相色谱（HPLC）；内标法
维 生 素 D3 与 维 生 素 D2 为 脂 溶 性 维生素，主要功用是调节细胞生长分 化和人体免疫功能，有利于新骨生成 和钙化，促进骨骼生长 [1]，预防骨质 疏松症。但维生素 D 摄入过多，可引 起高血钙、甚至软组织异位骨化等 [2]。
Toledo），高效液相色谱仪（LC-20A， 5009.82-2016）第四法，准确称量某
维生素 D2 D3
线性范围 μg/mL 0.01 ～ 5.0 0.01 ～ 5.0
表 1 线性方程、相关系数（r2）及定量下限
线性方程
相关系数，r2
检出限 μg/100 g
C=1.0575A-0.0552
0.9999
0.1954
C=1.3888A-0.4966
0.9996
0.1723
Hale Waihona Puke 定量限 μg/100 g 0.6513 0.5743
药片中维生素D含量的测定方法
测定药片中的维生素D含量的方法摘要：本方法采用高效液相色谱法测定维生素D(包括维生素D2和D3,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D 的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D是0.025μg。
关键词：高效液相色谱法、维生素D、半暗室、避免氧化、第一种方法、第二种方法、第三种方法引言：本方法采用高效液相色谱法测定维生素D(包括维生素D2和D3,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D 的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D是0.025μg。
测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。
无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一种方法测定，否则应按第二种方法处理后测定；如果按第二种方法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三种方法测定。
第一种方法(1)对照品贮备溶液的制备根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D2或D3对照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存。
测定维生素D2时，应另取维生素D3对照品25mg，同法制成维生素D3对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。
(2)内标溶液的制备称取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。
(3)色谱条件与系统适用性试验用硅胶为填充剂，正己烷－正戊醇（997∶3)为流动相，检测波长为254nm。
量取维生素D3对照品贮备溶液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出迅速冷却，加正己烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254和365nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5～6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3；取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D3的峰值，先后进样5次,相对标准偏差应不大于2.0％；前维生素D3(与维生素D3的比保留时间约为0.5)与反式维生素D<[3] >(与维生素D3的比保留时间约为0.6)以及维生素D3与速甾醇D3(与维生素D3的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。
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高效液相色谱法测定多种维生素多种矿物质片中的维生素D3含量韦月早1杨世联2黄艳芳2韦艳妮2（1.广西壮族自治区产品质量检验研究院，广西南宁530007；2.南宁富莱欣生物科技有限公司，广西南宁530007）【摘要】建立高效液相色谱法快速测定多种维生素多种矿物质片中维生素D3的含量，并采用加标回收率试验进行方法确认。
样品在0.2%的氨水中用碱性蛋白酶破坏维生素D3的包埋物质，用乙醇浸提，正己烷萃取游离出维生素D3。
供试品溶液用正相液相色谱法净化，反相液相色谱法分离。
维生素D3在0.0498μg/mL～0.9963μg/mL浓度范围内线性关系良好（r＝0.9999），平均加标回收率为97.78％，RSD为3.26％，精密度和稳定性良好，RSD分别为2.69％和1.58％。
该方法准确、快速，可作为多种维生素多种矿物质片中维生素D3含量的测定方法。
【关键词】高效液相色谱法；多种维生素多种矿物质片；维生素D3【中图分类号】R927【文献标识码】A【文章编号】1008-1151(2019)06-0040-03 Determination of Vitamin D3 in Multiple Vitamins and Minerals Tabletby High Performance Liquid ChromatographyAbstract: A rapid method for the determination of vitamin D3 in multiple vitamins and minerals tablet by high performance liquid chromatography was established. The method was confirmed by standard-added recovery test. In 0.2% ammonia water, the encapsulated substance of vitamin D3 was destroyed by alkaline protease. Vitamin D3 was extracted by ethanol and n-hexane. The sample solution was purified by normal phase liquid chromatography and separated by reversed phase liquid chromatography. The linear relationship of vitamin D3 was good in the concentration range of 0.0498μg/mL to 0.9963μg/mL (r＝0.9999). The average recovery of standard addition was 97.78%, RSD was 3.26%. The precision and stability of vitamin D3 were good, RSD were 2.69% and 1.58%, respectively. The method is accurate and rapid, and can be used for the determination of vitamin D3 in multiple vitamins and minerals tablet.Key words: high performance liquid chromatography; multiple vitamins and minerals tablet; vitamin D31 引言维生素D是一种脂溶性维生素和激素前体，具抗佝偻病和软骨病作用。
阳光照射皮肤和膳食是人体维生素D的主要来源，又以前者为主。
它有五种化合物，其中维生素D2（麦角钙化醇）和维生素D3（胆钙化醇）对健康有着密切的关系。
然而，现代生活方式使人们接触阳光的机会越来越少，一般膳食中维生素D含量又不高，人们需要依靠含有维生素D的营养补充剂来满足对维生素D的需要[1,2]。
含有维生素D3的保健食品越来越多，有粉剂、片剂、胶囊剂。
目前，维生素D3含量测定方法最常用的是高效液相色谱法，样品的前处理制备是测定维生素D3的关键步骤。
有的需要先水浴回流皂化，再用分液漏斗多次洗涤萃取分离[3-5]，操作繁琐，容易损失，重现性差，分析成本高；有的需要二甲基亚砜-水溶液提取，正己烷多次萃取[6-8]，试剂毒性大，危害人体健康，操作复杂、又耗时；针对组分单一的软胶囊，可以用单纯的甲醇溶剂超声溶解提取[9]。
因此建立一种简单快捷、针对性的前处理方法对维生素D3含量测定是很有必要的。
多种维生素多种矿物质片是以维生素和矿物质等为主要原料制成的保健食品，本文在碱性条件下，采用碱性蛋白酶酶解样品20min，无水乙醇浸提5min，再用正己烷等比例萃取5min，即可将维生素D3与其中的矿物质和维生素等干扰组分分离。
该方法样品制备前处理简单，成本低，易于操作，适合大批量样品的测定。
2 实验仪器与材料2.1实验仪器Waters e2695型高效液相色谱仪，配有UV检测器（美国waters公司）；KQ5200DV型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HMS-350型漩涡混合器（天津市恒奥科技发展有限公司），80-4型电动离心机（金坛市医疗仪器厂）；梅特勒-托利多AUY220电子天平（瑞士梅特勒—托利多公司）；总第21卷238期大众科技Vol.21 No.6 2019年6月Popular Science & Technology June 2019【收稿日期】2019-04-09【作者简介】韦月早（1984－），供职于广西壮族自治区产品质量检验研究院，从事环境检测工作。
- 40 -Evolution 201紫外可见分光光度计（美国Thermo公司）。
2.2实验试剂与样品甲醇、无水乙醇（德国merck公司，色谱纯），正己烷、环己烷（天津科密欧化学试剂有限公司，色谱纯），氨水，无水乙醇（广东光华科技股份有限公司，分析纯），水解蛋白酶Alcalase （诺维信（中国）生物技术有限公司），维生素D3标准品（德国DR公司，批号：100656 CAS：67-97-0），氮气（99.999%），氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司，HSC-17-12B），多种维生素多种矿物质片（批次：0301、0302、0303、0304、0305、0306，标示量为1.5μg/片，1000mg/片，美国HPSON公司）。
3 实验部分3.1色谱条件3.1.1半制备正相液相色谱条件色谱柱为Si60Inertsil SIL-100A（5μm 4.6×250mm）；流动相为正己烷＋环己烷＝1＋1，再按体积比加0.8%异丙醇；检测波长为264nm；流速为1.0mL/min；柱温35℃±1℃；进样量为200μL，理论板数按VD3计不低于5000，此条件下VD3与其他成分分离度不低于1.5。
3.1.2反相液相色谱条件色谱柱为C18wondasil TM C18（4.6×250mm，5μm）；流动相为甲醇；检测波长为264nm；流速为1.0mL/min；柱温35℃±1℃；进样量为100μL。
3.2维生素D3标准溶液的配制3.2.1维生素D3标准储备溶液准确称量维生素D3标准品10.0mg，用色谱纯无水乙醇溶解并转移定容至100mL棕色容量瓶，其浓度约为100μg/mL。
3.2.2维生素D3标准中间液精密量取10mL，置于100mL棕色容量瓶中，加色谱纯无水乙醇稀释至刻度，混匀，浓度约为10μg/mL。
临用前，用紫外分光光度法校正其浓度[4]，以无水乙醇为空白参比，用1cm石英比色皿，在264nm处测定吸光度A（A平均值为0.4603），按公式（1）计算其中）。
（1）3.2.3维生素D3标准使用液分别准确吸取维生素D3标准中间使用液0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、10.00mL于100mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀。
此标准系列工作液浓度分别约为0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、1.00μg/mL，准确浓度按校正后的浓度折算。
3.3分析测定步骤3.3.1浓缩与净化分别取每批本品20粒，研磨均匀后，取2.0g（精确至0.0001g）置于25mL容量瓶中，加300mg碱性蛋白酶，5mL0.02%氨水，于65℃水浴超声提取20min，取出冷却后再加15mL无水乙醇室温超声5min，冷却后，加无水乙醇定容至25mL，精密吸取10mL上清液于预先加有10.00mL正己烷、5mL水的50mL棕色容量瓶中，震荡，充分混匀后取部分溶液离心5min，取上层5.00mL，于40℃±2℃水浴氮气吹干，用正己烷定容至1mL（浓缩了5倍），经0.45μm微孔滤膜过滤供半制备正相高效色谱系统半制备，净化待测液。
3.3.2半制备正相高效液相色谱系统适用性试验取约1.00mL维生素D3标准中间使用液于10mL具塞试管中,在40℃±2℃的氮吹仪上吹干。
残渣用10mL正己烷振荡溶解。
取该溶液100μL注入液相色谱仪中测定，确定维生素D3保留时间。
然后将200μL待测液注入液相色谱仪中，根据维生素D3标准溶液保留时间收集维生素D3馏分于试管中。
将试管置于40℃±2℃水浴氮气吹干，取出，准确加入1.0mL 甲醇（稀释了5倍），残渣振荡溶解，即为维生素D3测定液。
3.4上机测定分别将维生素D3标准系列工作液和样品测定液100μL注入反相液相色谱仪中，得到维生素D3的峰面积。
以峰面积为纵坐标，维生素D3工作液浓度为横坐标绘制标准曲线，以外标法计算供试品的维生素D3含量。
对照液和供试液的色谱图如图1和图2所示。
图1对照液色谱图图2供试液色谱图4 实验结果4.1线性关系考察、检出限及定量线分别将各标准系列浓度100μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积，以维生素D3的质量浓度（μg/mL）- 41 -- 42 -对峰面积进行线性回归，得线性方程为：y ＝313143x-2002.8，线性相关系数R 为0.9999，结果表明，在0.0498μg/mL ～0.9963μg/mL 浓度范围内具有良好的线性关系。
将标准溶液逐级稀释后，以约3倍信噪比对应的浓度为检测限，10倍信噪比对应的浓度为定量限，维生素D 3的检测限和定量限分别为0.0199μg/L 和0.0996μg/L 。