一株硝化反硝化菌的筛选鉴定及反硝化特性研究

第36卷 第1期

水生生物学报

Vol. 36, No.1 2012年1月

ACTA HYDROBIOLOGICA

SINICA

Jan., 2 0 1 2

收稿日期: 2010-08-31; 修订日期: 2011-06-28

基金项目: 国家重点基础研究发展计划(2009CB11870)资助

作者简介: 郑佳佳(1987—), 女, 浙江余杭人; 在读硕士生; 主要研究方向为微生物与基因工程。E-mail: 06dwkxzjj@https://www.360docs.net/doc/9e16286663.html, 通讯作者: 李卫芬, E-mail: wfli@https://www.360docs.net/doc/9e16286663.html,

DOI: 10.3724/SP.J.1035.2012.00161

一株硝化反硝化菌的筛选鉴定及反硝化特性研究

郑佳佳 沈 涛 傅罗琴 邓 斌 李卫芬

(浙江大学动物科学学院, 杭州 310058)

IDENTIFICATION AND DENITRIFICATION CHARACTERISTICS OF A

DENITRIFER PSEUDOMONAS PUTIDA F6

ZHENG Jia-Jia, SHEN Tao, FU Luo-Qin, DENG Bin and LI Wei-Fen

(College of Animal Sciences Zhejiang University , Hangzhou 310058, China )

关键词: 硝化; 好氧反硝化; 筛选; 温度; pH; 溶氧

Key words: Nitrification; Aerobic denitrification; Screen; Temperature; pH; DO 中图分类号: Q935 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207(2012)01-0161-07

近年来随着人们生活水平的提高和环保意识的增强, 对水产品的安全和品质提出了新的更高要求, 但是由于水产养殖集约化、高密度饲养模式的大规模应用, 使得养殖水体中有机物、氨氮和亚硝酸氮等污染物的浓度增加, 不但导致水质恶化, 而且直接毒害养殖动物, 引起病害的频繁发生, 水产品品质也在不断下降, 养殖水体生态遭到严重破坏[1]。黄翔鹄等表示对虾长期处于高浓度的亚硝酸盐氮的水体中会发病[2]。养殖水体中高浓度的氨态氮及硝态氮是导致鱼虾发病的直接或间接因素[3]。对水体中含氮物质的控制一直是水产养殖工作者研究和探索的问题。近几年, 我国池塘养殖水体环境的控制和修复的生态技术发展快速, 出现了一些新的技术方法, 如水生植物修复系统、浮床植物系统、微生态技术等, 其中微生态技术因具有众多优点而广受关注, 应用比较成功[3]。 池塘中的氮循环主要是通过氨化细菌的氨化作用、亚硝化菌的亚硝化作用、硝化菌的硝化作用和反硝化菌的

反硝化作用来完成[4]

。生物脱氮技术以其无污染、脱氮彻底和安全等优点被认为是最经济、有效、可行性高的水体除氮方法[5]。生物脱氮是指微生物在合适的条件下, 将水中的有机氮和无机氮转化为气态氮(N 2和N X O Y )排出水体的过程, 它主要包括硝化作用和反硝化作用等过程。反硝化作用又称脱氮作用或硝酸盐呼吸作用, 实质上是一个硝酸盐或亚硝酸盐的生物还原反应, 即硝酸盐或亚硝酸盐被还原成气态氮化物(主要是N 2, 少量是N 2O)的过程。

反硝化过程主要包括如下四个反应: NO 3? → NO 2? → NO → N 2O → N 2, 这四步反应细菌分别利用硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、NO 还原酶和N 2O 还原酶四种酶的作用完成[6]。因为NO 对生物剧毒, 以NO 为最终产物的细菌往往难以存活, 所以通常我们将能够还原硝酸盐或者亚硝酸盐, 产生N 2O 或者N 2的细菌称为反硝化细菌。传统理论认为细菌的反硝化是一个严格的厌氧过程, 现已有研究证明, 反硝化在有氧条件下也可发生。

自Robertson, et al .[7]首先从污水处理厂反硝化单元分离出了一株好氧硝化反硝化菌——泛养硫球菌(Thiosp- haera pantotropha )Esol 后, 国内外进行了很多硝化反硝化的研究。杨宗政等[8]研究发现, 一株革兰氏阴性异养硝化菌能在好氧条件下分别代谢氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮, 并通过好氧反硝化实现对总氮的去除。目前已发现的此类菌种有Thiosphaera pantotropha 、Bacillus sp.等, 主要来源于污水处理器, 而从养殖池水中分离该类菌的研究较少。为此, 本研究从草鱼池中分离、筛选出一株硝化反硝化细菌, 并对其反硝化特性进行了研究, 为其应用于水产养殖、调节水质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验所用草鱼养殖池塘水样来源于杭州某草鱼养殖场。

162 水生生物学报36卷

硝酸钠(亚硝酸钠、氯化铵)反硝化液体培养基。主要成分为: 柠檬酸钠 5.66 g, Na2HPO4 7.9 g, NaNO3 0.8415 g/ NaNO2 0.683 g/NH4Cl 0.5296 g, KH2PO4 1.5 g, Mg2SO4·7H2O 0.01 g, 微量元素溶液 2 mL, 去离子水1000 mL, pH 7.2。

Luria-Bertani(以下简称LB)培养基用于分离纯化菌种。主要成分为: 1%胰蛋白胨, 0.5%酵母膏, 0.5%NaCl, 2.5%琼脂, 蒸馏水溶解。

各培养基在高压蒸汽灭菌锅中灭菌后使用。

1.2 方法

分离菌株取草鱼池水, 稀释涂布于LB上, 30℃恒温箱内培养24h, 挑单菌落, 进行氮转化途径定性测定。

菌株的初筛根据不同含氮化合物的化学性质, 用相应的显色剂分别与每株菌利用四种氮源后产生的代谢产物(含氮化合物)进行显色反应, 根据颜色的有无或深浅, 定性地鉴定该菌种是否参与水体氮转化以及在氮循环中的具体作用。

亚硝酸盐氮的定性检测: 培养液用亚硝酸盐显色剂点样, 若出现红色则说明培养液中存在亚硝酸盐氮, 且颜色越深浓度越大。

氨氮的定性检测: 用钠氏试剂点样, 若出现黄色反应, 说明培养液中存在氨氮, 且颜色越深浓度越大。

硝酸盐氮的定性检测: (1)含有亚硝酸盐的培养液: 对于 1 mL培养液中残余的亚硝酸盐(浓度≤150 mg/L), 加入1 mol/L的盐酸50 μL, 混匀, 加入50 g/L的氨基磺酸铵溶液50 μL, 混匀, 以消除亚硝酸盐对硝酸盐显色的影响。将2 μL的该培养液滴入10 μL的二苯胺溶液中, 根据是否显示蓝色及蓝色的深浅, 初步判断培养液中硝酸盐含量的多少。(2)不含有亚硝酸盐的培养液: 对于1 mL 的待检测培养液, 由于已知培养液中不含有亚硝酸盐, 直接将2 μL的该培养液滴入10 μL的二苯胺溶液中, 根据是否显示蓝色及蓝色的深浅, 初步判断培养液中硝酸盐含量的多少。

测定方法采用国家环保总局推荐方法[9]。

菌株反硝化性能的复筛经初筛的菌株涂布于BTB培养基上进行复筛[10]。

硝化反硝化菌在三种氮源的生长和脱氮作用接种50 μL纯菌液至5 mL分别以硝酸钠/亚硝酸钠/铵盐为唯一氮源的反硝化液体培养基中(每个试验组设三个重复), 其中氮含量为0.1386 g/L, 30, 200 r

℃/min, 培养24h。测定初筛菌株的生长和反硝化能力, 包括A600、NO3?-N、NO2?-N和NH4+-N的初始浓度和最终浓度。其中NO3?-N、NO2?-N和NH4+-N 分别用紫外分光光度法、N-(1-萘基)-乙二胺光度法和纳氏试剂光度计法测定。

脱氮率[11] =(初始氮浓度?终末氮浓度)/初始氮浓度× 100%

好氧硝化反硝化菌的鉴定总DNA提取及特异性16S rDNA的PCR扩增[12, 13]: 利用DNA提取试剂盒提取菌株总DNA, 以菌株的总DNA为模板, 以细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增。

引物序列为: 上游引物(P1): 5′-AGAGTTTGATCCT GGTCAGAACGAACGCT-3′; 下游引物(P6): 5′-TACGGC TACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′, 由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。PCR反应体系(50 μL)为: 10×Buffer 5.0 μL, P1 1.0 μL, P6 1.0 μL, dNTP 1.0 μL, Taq酶0.5 μL, 模板1.0 μL, ddH2O40.5 μL; 反应条件为95℃预变性3min, 94℃变性1min, 52℃退火45s, 72℃延伸1min, 共30个循环。

琼脂糖凝胶电泳, 选择目的DNA片段并切下, 采用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化回收, 送英潍捷基(上海)贸易有限公司测。

好氧硝化反硝化菌的反硝化特性研究每个实验组设置三个重复。实验中所用菌株F6已于实验开始前经LB培养基活化。实验容器为200 mL锥形瓶。

氮浓度: 实验分别以NO3?-N、NO2?-N作为反硝化培养基的氮源, 氮浓度分别为0、20、40、60、80、100 mg/L。将已活化的F6按1%的接种量接种至上述培养基, 置于30℃、200 r/min摇床内培养。定时测定A600, NO3?-N、NO2?-N和NH4+-N吸光度值, 计算脱氮率。

时间: 将F6接种至氮含量为10 mg/L的反硝化液体培养基, 置于30℃、200 r/min摇床内培养。每隔4h, 即0、4、8、12、16、20、24h时, 取一定量样品测定各指标, 计算脱氮率。

pH: 将F6接种于pH分别为5、6、7、8、9的反硝化培养基, 置于30℃、200 r/min摇床内培养。定时测定各指标, 计算脱氮率。

温度: 参照王铭等[14]方法进行, 将F6接种至反硝化液体培养基。分别于15、20、25、30℃下, 200 r/min摇床内培养。定时测定各指标, 计算脱氮率。

溶解氧: 将F6接种至反硝化液体培养基。置于30℃摇床内培养, 转速分别设置为0、50、100、150、200 r/min(溶解氧0、1.8、3.4、5.1、7.2 mg/L)。定时测定各指标, 计算脱氮率。

F6 在模拟草鱼池中的稳定性模拟草鱼池水的配置: 在草鱼池水中添加10 mg/L NH4Cl和5 mg/L NaNO2。

接菌: 取LB培养的100 μL菌液, 接种于100 mL的废水培养基中。

培养条件为25, 50 r

℃/min, 每隔2天平板计数一次。2结果

2.1 初筛、复筛和鉴定

经定性测定筛选获得了10株具有硝化和反硝化功能的菌, 经BTB反硝化培养基进一步复筛得到一株反硝化效果较好的菌, 命名为F6。图1为F6在BTB培养基上的菌落形态。

1期郑佳佳等: 一株硝化反硝化菌的筛选鉴定及反硝化特性研究

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图1 F6在BTB培养基上的菌落形态

Fig. 1 The morphological properties of F6 in BTB culture medium

经16S rDNA序列测定发现, 它与Pseudomonas putida 恶臭假单胞菌同源性最高, 达98%, 命名该菌为Pseudo- monas putida F6。

2.2 硝化反硝化菌的生长和脱氮作用

在三种氮源的生长和脱氮作用由表1可知, F6在氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮培养基中都能生长, 但因NO2?-N有毒性, 浓度太高时不利于F6生长, 故在亚硝酸盐氮中A600相对较低。该菌对氨氮、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的去除率分别为91.44%、37.79%和63.37%, 总无机氮的去除率分别为89.06%、37.58%和62.88%, 说明该菌具有硝化和反硝化功能, 脱氮效果较好。

表1 F6在不同氮源培养基的生长和脱氮

Tab. 1 Growth and nitrogen degradation rate of strain F6 in dif-ferent nitrogen source culture mediums

培养基

Culture medium 24h A600

氮源去除率

The degradation

rate of nitrogen

source (%)

总无机氮(TIN)

去除率

The degradation

rate of TIN (%)

NH4+-N 1.290 91.44 89.06 NO2--N 0.419 37.79 37.58 NO3--N 1.159 63.37 62.88

反硝化特性氮浓度: 图2A表明, 亚硝酸盐氮浓度为10—60 mg/L时F6菌株生长较好, 在10 mg/L和20 mg/L时F6对亚硝酸盐氮去除率较高, 均达到99.90%以上, 超过20 mg/L时脱氮率下降; 图2B表明硝酸盐氮浓度为10—40 mg/L时适宜F6生长, 10 mg/L时F6对硝酸盐氮的去除率率最高, 达74.86%, 超过10 mg/L, 脱氮率下降。

F6菌株生长和脱氮的动态变化: 从图3A和图3B看出, 在亚硝酸盐和硝酸盐两个培养基中, 0—4h为F6生长迟缓期, 4—24h为对数期。亚硝酸盐氮、硝酸盐氮和TIN 浓度都在12h前随着时间增加而减少, 到了12h之后趋于恒定, F6脱氮作用集中在前12h, 对数生长后期的脱氮作用相对较弱。在以硝酸盐为氮源时, F6反硝化过程中的亚硝酸盐积累很少(数据未显示)。

pH: 图4A和图4B表明, pH为5.0时F6基本不生长。pH在6.0—9.0之间F6生长良好, 亚硝酸盐氮去除率接近100%, 硝酸盐氮去除率在50%左右。亚硝酸盐培养基中的TIN去除率最高达74.98%, 硝酸盐培养基中TIN去除率最高达61.88%。这表明该菌生长和脱氮对pH的适应性较广。

温度:从图5A和5B可见, 20—30℃时F6均能生长, 30℃时生长最好; 20—30℃时, F6在硝酸盐亚硝酸盐培养基中的脱氮率均在60%以上, 对NO2?-N的去除率达100%。25℃和30, NO

℃3?-N去除率分别达74.57%和78.20%。草鱼生长期间的养殖池水温在20—30,

℃说明该菌能适应草鱼池水温度进行反硝化脱氮。

溶氧: 图6A和图6B表明, 摇床转速在50 r/min(溶解氧1.8 mg/L)以上F6均能较好生长, 且NO2?-N去除率接近于100%, 当转速达到200 r/min(溶解氧7.2 mg/L)时NO2?-N能被完全去除; 而NO3?-N去除率在转速100 r/min(溶解氧3.4 mg/L)以上时高于70%。亚硝酸盐培养基中TIN去除率在100 r/min(溶解氧3.4 mg/L)时最大, 硝酸盐培养基中TIN去除率在150 r/min(溶解氧5.1 mg/L)时最大。这说明该菌对氧的耐受性较高。

2.3 F6在草鱼池中的稳定性

经平板计数, 得出F6在模拟废水中的稳定性。如图7, F6在草鱼池水中 2d后存活率为67.80%, 4d后存活率为94.50%, 6d后存活率为54.50%, 8d后存活率为46.50%。这说明F6在模拟废水中有一定的稳定生存能力。

3讨论

3.1硝化反硝化菌的筛选方法

最早对好氧反硝化菌的研究始于20世纪80年代。Robertson和Kuenen在除硫和反硝化处理系统出水中, 首次分离出好氧反硝化菌泛养硫球菌Thiospkaera panto-tropha(现更名为脱氮副球菌Paracoccus denitrificans[15])和粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)等[5]。此后, 陆续有不少学者分离得到好氧反硝化菌。Frette, et al.[16]从间歇厌氧／好氧污水处理池中分离出16株反硝化细菌, 它们无论是在好氧条件还是在厌氧条件下, 都具有反硝化作用。Pai, et al. [17]从稻谷沉淀物中分离而得到3株好氧反硝化菌, 其中T6菌株利用无机氮生长繁殖。

好氧反硝化菌为好氧或兼性好氧菌, 在自然界中的含量很少, 采用一般微生物筛选方法很难将其从环境微生物中分离出来[18]。本试验通过BTB固体培养基[10]成功分离到此株好氧反硝化菌, 经鉴定为Pseudomonas putida 恶臭假单胞菌。

本实验室也曾分离到一些不能完全反硝化的菌(有亚硝酸盐的积累)。这种情况在生物脱氮研究中曾被观察到[19]。目前对这种现象有两种解释: 一种解释认为与亚硝酸盐相比, 硝酸盐作为电子受体时基质释放的能量较高,

164 水生生物学报 36卷

图2 F6对不同浓度NO 2?

?N(A)和NO 3??N(B)的好氧反硝化作用

Fig. 2 Aerobic denitrification by strain F6 under different concentration of NO 2??N (A) and NO 3??N(B)

图3 F6在NO 2??N(A)和NO 3?

?N(B)培养基的24h 生长曲线和氮浓度曲线

Fig. 3 Growth curve and nitrogen concentration curve in 24h of strain F6 in NO 2?-N (A) and NO 3??N(B)culture medium

图4 不同pH 下F6对NO 2?

-N(A)和NO 3??N(B)的好氧反硝化作用

Fig. 4 Aerobic denitrification of NO 2?-N(A) and NO 3??N(B) by strain F6 under different pH

图5 不同温度条件下F6对NO 2?

-N(A)和NO 3??N(B)的好氧反硝化作用

Fig. 5 Aerobic denitrification of NO 2?-N(A) and NO 3??N(B) by strain F6 under different temperature

因此微生物优先利用硝酸盐作为反硝化作用的电子供体, 导致亚硝酸盐浓度升高; 另一解释认为硝酸盐还原酶的合成要早于亚硝酸盐还原酶[20], 因此亚硝酸盐的降解要晚于硝酸盐。

3.2 反硝化特性

翟茜等[21]筛得4株TIN 去除率为60%以上的好氧反硝化菌, 经鉴定, 其中2株属于假单胞菌属, 1株属于代尔夫特菌属。张小玲等[18]筛得5株对亚硝酸盐的降解率均

1期 郑佳佳等: 一株硝化反硝化菌的筛选鉴定及反硝化特性研究

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图6 不同摇床转速条件下F6对NO 2?-N(A)和NO 3??N(B)的好氧反硝化作用

Fig. 6 Aerobic denitrification of NO 2?-N(A) and NO 3??N(B) by strain F6 under different rotation speed

图7 F6在模拟废水中的稳定性

Fig. 7 Stability of F6 in simulated wastewater

在95%以上的好氧反硝化菌株, 总氮去除率最高达到68.8%。何伟等[22]从污水处理厂曝气池污水样本中, 筛得1株亚硝态氮去除率为94%的好氧反硝化产碱杆菌BMB-N6。本实验中筛选到的菌株在最适条件下亚硝酸盐氮去除率接近100%, 硝酸盐去除率为78.20%, 总氮去除率达78%, 是高效脱氮的好氧反硝化菌, 具有重要的应用价值。

氮浓度太低, 菌体没有足够的氮源, 不能很好的生长繁殖, 脱氮能力低; 氮浓度过高, 对菌体有毒害作用, 影响其正常的生长繁殖, 进而影响其脱氮能力。因此, 氮浓度在一定的范围内, 菌株才能保持最高的脱氮能力。虽然养殖水中的氮浓度超过2 mg/L 时, 就会影响到鱼虾的正常生长, 国家规定渔业水质标准NO 2?-N 含量不应超过0.1 mg/L [23]。但为了实验能检测到明显的变化, 全面的研究菌株在不同氮浓度下的脱氮能力, 为其在废水处理、养殖水质调节、水产养殖应用中的实际应用提供相应的理论基础, 实验所设的氮浓度不能太低。

本研究结果表明, 0—4h 为F6的迟缓期。4h —24h 为F6的对数期, 此时菌株生长代谢旺盛, 能够充分利用各营养物质, 反硝化作用主要发生在此期间。刘晶晶等[24]研究也表明, 反硝化作用主要发生在细菌对数生长期, 这一阶段随着菌体的快速增殖, 水体中硝态氮、亚硝态氮的量会迅速的下降。本结果也与马放等[25]的研究结果相符。

环境中的氢离子, 通过影响微生物原生质膜的电荷变化, 影响对营养物质的吸收和酶的适应范围, 进而引起酶促反应的速度变化, 从而影响生长代谢[26]。Gupta [27]

研究表明, 细菌生长及反硝化酶活性的最适pH 为中性或微碱性, pH 过高或过低均会对菌株生长及反硝化性能的发挥产生影响。王宏宇等[28]对好氧反硝化菌株C3 (Pseud- omonas sp.)研究也同样表明, pH 为中性条件最有利于菌株生长及反硝化性能的发挥。本研究表明, 在pH 6—9时, 该菌亚硝酸盐氮去除率始终保持近100%, 表明该菌适应偏酸性、中性及稍碱性环境。该菌对水体pH 的改变显示

出了较强的耐受能力, 可在较宽的pH 范围内保持正常生长及反硝化性能的稳定发挥, 能应用于不同酸碱度的养殖水体。

阎胜利等[29]研究发现细菌生长及反硝化活性最适温度范围是25—35, ℃当温度超过这一范围时, 均会抑制细菌快速生长及反硝化性能的正常发挥。本研究结果表明, 水温在20—30, F6℃可以正常生长, 并保持较高的反硝化活性, 而水温30℃是该菌生长及反硝化活性发挥的最适温度。当水温低于20℃时, 细菌生长与反硝化性能发挥表现出了明显的抑制作用。可见, 温度对细菌生长及反硝化性能发挥有重要的影响, 这可能与该菌生长及反硝化酶的机制有关, 需进一步研究。

好氧反硝化菌是能利用好氧反硝化酶, 在有氧条件下进行反硝化过程的细菌。充足的溶氧有利于好氧反硝化菌的生长繁殖, 而过多的氧气则能在一定程度上抑制其反硝化作用。据文献报道[30], 对于反硝化菌而言, 氧气的存在之所以对反硝化过程有抑制作用, 并不是由于氧气对反硝化菌本身有抑制作用, 而是因为电子受体(O 2、NO 2?和NO 3?)之争, 通常O 2接受电子的能力高于NO 2?和NO 3?, 在溶氧较高的条件下, NO 2?和NO 3?不易得到电子, 因此也难以被还原成N 2。张列宇等[31]指出将溶解氧控制0.5mg ／L 以下时, 亚硝酸根更易发生大量积累。Huang, et al.[32]研究指出, 溶解氧是细菌进行好氧反硝化的关键因素, 当ρ(DO)为2—6 mg/L 时, 最适于细菌生长及反硝化性能的发挥。王莹等[33]从人工湿地中分离出的好氧反硝化菌最佳脱氮的ρ(DO)值为1.84—3.57 mg/L 。本研究表明, 在ρ(DO) 为 1.8—7.2 mg/L 时该菌的反硝化活性最高, 其对亚硝酸盐氮的去除率接近100%。与之前研究结果相比, 适应范围更大, 可见不同菌种的好氧反硝化机制存在较大差异, 需作进一步研究。

166 水生生物学报36卷

综合F6的反硝化特性来看, 该菌能在草鱼养殖池水环境中发挥较好的脱氮效果。

4结论

从草鱼池中筛选到一株具有较好脱氮效果的好氧硝化反硝化菌, 命名为Pseudomonas putida F6。该菌在亚硝酸盐和硝酸盐培养基中都有较好的生长和脱氮能力, 且能适应草鱼养殖池水环境。

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