CCK-8 划痕 transwell侵袭
山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响
352018.01论著·论述山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响林晓燕 孙晓红 张璐萍滨州医学院 山东省烟台市 264003【摘 要】目的：研究山慈菇水煎剂对胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移的影响。
方法：山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）分别作用于胶质瘤U118细胞0h、24h、48h，分别采用CCK-8实验、划痕实验、Transwell 实验对细胞的增殖、迁移、侵袭能力进行检测。
结果：山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）作用于胶质瘤U118细胞24小时和48小时均能显著降低细胞的增殖能力（P<0.05），且当山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）作用于U118细胞48小时，增殖抑制率分别高达20.64%、47.61%、51.23%；划痕实验结果表明，不同浓度山慈菇水煎剂作用24小时及48小时均能明显降低胶质瘤U118细胞的迁移能力（P<0.05），且48小时药物降低细胞迁移的能力高于24小时；体外侵袭实验显示，山慈菇水煎剂（200，400，600mg/mL）培养24h 和48h 均能明显的降低侵袭细胞数目，差异具有统计学意义（P<0.05）；结论：山慈菇水煎剂能够减轻U118胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力，但对于其具体的机制还需要进一步的研究。
【关键词】山慈菇水煎剂；胶质瘤细胞；增殖；侵袭；迁移胶质瘤是一种发病率高、致死率高的恶性脑肿瘤，5年内脑胶质瘤患者的生存率小于10%，该病多发于30岁至40岁的中年人群，其约占中年颅内肿瘤患者的1/3至2/3。
胶质瘤侵袭性高，发病机制复杂，对于该疾病还没有完全根治的治疗方法[1]。
目前，对于脑胶质瘤的治疗，临床上主要采用手术配合术后放化疗为主。
放化疗不仅对肿瘤细胞存在杀伤力，对机体内正常的细胞也有很强的杀伤力[2]，副作用强，加重患者的不良反应，严重影响患者的生存质量及生活质量[3-5]。
超声微泡介导miR-545-3p通过调节SEPT2抑制乳腺癌的恶性进展
超声微泡介导miR-545-3p通过调节SEPT2抑制乳腺癌的恶性进展李雯静;张强【期刊名称】《现代肿瘤医学》【年(卷),期】2024(32)7【摘要】目的:研究超声微泡介导miR-545-3p通过调节胞裂蛋白2(septin2,SEPT2)抑制乳腺癌恶性进展的机制。
方法:以实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测人正常乳腺上皮细胞MCF-10A、人乳腺癌细胞MCF-7、HS-578T及HCC-1937细胞中miR-545-3p、SEPT2表达。
体外培养MCF-7细胞并随机分为对照组、空微泡组、miR-545-3p微泡组、miR-545-3p+SEPT2过表达微泡组,分组处理后以实时荧光定量PCR和免疫印迹实验检测各组细胞miR-545-3p、SEPT2表达;以CCK-8、集落形成实验与流式细胞实验检测各组细胞增殖与凋亡;以细胞划痕、Transwell侵袭实验检测各组细胞迁移与侵袭。
于裸鼠腹壁皮下接种MCF-7细胞构建其移植瘤模型并以同样方法分组,经分组处理后检测各组裸鼠肿瘤体积与质量。
结果:与MCF-10A细胞相比,MCF-7、HS-578T及HCC-1937细胞中miR-545-3p表达降低(P<0.05),SEPT2 mRNA与蛋白表达升高(P<0.05)。
与对照组相比,miR-545-3p微泡组细胞miR-545-3p表达、凋亡率升高(P<0.05),细胞SEPT2 mRNA与蛋白表达、细胞活力、集落形成率、迁移率、侵袭数、裸鼠肿瘤体积与质量降低(P<0.05);与miR-545-3p微泡组相比,miR-545-3p+SEPT2过表达微泡组细胞凋亡率降低(P<0.05),细胞SEPT2 mRNA与蛋白表达、细胞活力、集落形成率、迁移率、侵袭数、裸鼠肿瘤体积与质量升高(P<0.05)。
结论:超声微泡介导miR-545-3p可通过降低SEPT2表达而减弱乳腺癌细胞增殖、迁移与侵袭,促使其凋亡,并抑制裸鼠移植瘤生长,最终抑制乳腺癌细胞恶性进展。
雷公藤甲素在胶质瘤细胞迁移、侵袭及EMT样表型变化中的研究
摘要目的：观察雷公藤甲素对胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭及EMT样表型的影响，并探讨引起EMT表型改变的可能机制。
方法：雷公藤甲素作用于U87、U251胶质瘤细胞系，CCK-8法检测TP对两种细胞的半数抑制浓度IC50，及IC50浓度下细胞的增殖能力受到抑制的情况。
细胞的迁移能力通过细胞划痕实验来检测，细胞的侵袭能力则通过Transwell侵袭实验检测。
Western Blot分析TP作用于细胞后，上皮间质化（EMT）标志物E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、Slug等蛋白表达水平，同时检测自噬标志物LC3B、Beclin-1、Atg-7。
转染pEGFP-C2-LC3B质粒进入胶质瘤细胞，细胞免疫荧光检测TP对细胞自噬的影响。
裸鼠皮下瘤实验检测TP在体内对肿瘤细胞的增殖抑制情况，免疫组化检测肿瘤组织EMT标志物的表达水平。
结果：U87、U251细胞在雷公藤甲素的作用下，其增殖活力受到明显的抑制，而且这种抑制效应呈现出随着剂量、时间的增加而增加的趋势。
U87细胞的半数抑制浓度IC50为20ng/ml，而U251细胞的IC50为50ng/ml。
雷公藤甲素对胶质瘤细胞系U87、U251细胞的迁移、侵袭能力有明显的抑制作用。
Western Blot实验表明TP在胶质瘤细胞中逆转了EMT的过程，即以E-Cadherin为代表的上皮标志物出现表达上调，而以N-Cadherin、Vimentin、ZEB1、Snail、Slug等为代表的间质标志物则出现表达下调。
雷公藤甲素引起胶质瘤细胞自噬增强，LC3B II/I 比值升高，Beclin-1、Atg-7表达上调。
细胞免疫荧光显示TP作用于细胞后自噬小体数量明显增多。
裸鼠皮下瘤实验在体内验证了TP对胶质瘤细胞的增殖抑制作用。
免疫组化证实TP作用后肿瘤组织EMT标志物E-Cadherin出现表达上调，而间质标志物，如N-Cadherin、Vimentin则出现表达下调。
青龙衣有效成分的提取纯化及其体外抑制胃癌侵袭转移作用
青龙衣有效成分的提取纯化及其体外抑制胃癌侵袭转移作用目的:研究青龙衣通过挤压预处理后对有效成分多糖和鞣质的提取影响、采取分级醇沉多糖与鞣质进行配伍研究其体外对人胃癌BGC-823细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。
方法:对青龙衣先采取挤压技术进行破壁预处理再对青龙衣中抗肿瘤的主要成分多糖和鞣质进行提取,同时对青龙衣粗多糖进行醇沉分级,明确得到不同级别粗多糖,将分级多糖与不同浓度的鞣质进行配伍,并通过CCK8、Transwell小室和划痕实验测定对肿瘤BGC-823细胞的增殖、侵袭和迁移能力的抑制作用。
结果:1、通过扫描电镜可以清楚的观察到挤压前后的青龙衣具有不同的表面结构,说明通过挤压膨化后,青龙衣分子间的结构发生了变化。
2、通过对挤压膨化条件进行单因素试验,得到优化的提取多糖和鞣质的挤压条件分别为:挤压温度为140℃,物料含水量为45%,螺杆转速为190r/min和挤压温度为160℃,物料含水量为45%,螺杆转速为220 r/min。
挤压预处理后,采取热水煮提并使用不同浓度的乙醇沉淀得到青龙衣水溶性多糖50%T和70%T;同时采取热水煮提和乙酸乙酯萃取法纯化,得到鞣质。
未经挤压预处理得到的粗多糖和总酚含量分别为7.448%和19.07mg/g,经挤压预处理得到的粗多糖和总酚含量分别为10.195%和24.78mg/g。
3、根据红外光谱分析50%T和70%T的官能团特征,结果显示50%T和70%T 都具有多糖特征吸收峰,同时50%T在1030cm-1处有一强峰920cm-1处呋喃环的对称伸缩振动引起和816cm-1处呋喃环的C-H变角振动,明显与70%T有差异。
同时根据DSC检测得到70%T具有跟稳定的固态构型。
4、CCK-8法检测结果表明,50%T50与鞣质F(1-5)共同作用时,抑制肿瘤BGC-823细胞增殖能力较为显著,从中优选的配伍组为50%T50+F(1～3),抑制率均达到50%以上。
对配伍浓度优选后进行划痕实验,结果显示,各浓度组均具有良好的抑制BGC-823细胞迁移能力。
长链非编码RNA
《中国癌症杂志》2019年第29卷第12期 CHINA ONCOLOGY 2019 Vol.29 No.12927欢迎关注本刊公众号·论 著·基金项目：国家自然基金青年项目（81502042）；江苏省自然基金青年项目（BK20140171）； 无锡市“科教强卫工程”-无锡市医学重点人才（ZDRC008）；无锡市卫计委卫生科研项目（Q201731）。
通信作者简介：葛晓松 E-mail:85410328@长链非编码RNA ZEB1-AS1促进食管鳞癌侵袭转移刘 芬1，刘晓媛2，高 翔3，葛晓松31.江南大学附属医院肿瘤研究所，江苏 无锡，214062；2.江南大学附属医院药剂科，江苏 无锡，214062；3.江南大学附属医院肿瘤内科，江苏 无锡，214062［摘要］ 背景与目的：长链非编码RNA （long non-coding RNA ，lncRNA ）锌指E-盒结合同源异形盒1-反义链1（Zinc finger E-box binding homeobox 1 antisense 1，ZEB1-AS1）在多种肿瘤中高表达，与肿瘤患者临床病理学特征及预后相关，但其在食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma ，ESCC ）中的作用及其机制尚不清楚。
从细胞与分子生物学水平探讨lncRNA ZEB1-AS1在ESCC 细胞侵袭转移中的作用。
方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ，RTFQ-PCR ）方法检测9株ESCC 细胞株中lncRNA ZEB1-AS1的表达水平，筛选出一株高表达细胞株。
采用小干扰RNA （small interference RNA ，siRNA ）转染Eca-109细胞，分成干扰组（siZEB1-AS1）、干扰对照组（siNC ）和空白组（Eca-109）。
PHF19对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响
ability of HeLa and HCC94 cells decreased after siRNA transfection ( P<0.05) . Conclusion tion， invasion and migration of Hela and HCC94 cells.
Key words: cervical cancer； PHF19 gene； invasion and migration； proliferation
2结果
2.1 7丨；\\ 作- 用后’Hd.!细胞和HC94细胞中 PHL19的川；\\表达减少 RT-qPCR实验结果表 明,siRNA作用后与Hela组和HCC94组相比，siR NA-2-50 组中PHF19 mRNA的水平表达降低，差 异有统计学意义(P<0.05)(图1)。
A
Hela
表2 RT-qPCR反应体系
vical cancer cells.Results RT-qPCR results showed that the expression of PHF19 mRNA in HeLa and HCC94 cells decreased after
siRNA transfection (P<0.05). CCK-8 results showed that the proliferation activity of HeLa and HCC94 cells decreased after siRNA transfection ( P<0.05) . Wound and Transwell experiments confirmed that compared with the control group， the invasion and migration
细胞功能学分析实验概述第四版(含荧光兼容性叙述)
细胞功能学分析实验概述细胞功能学分析实验概述一、增殖实验1.MTT/CCK82.BrdU渗入实验（需要标记FITC，和GFP一般不兼容）3.Ki67免疫荧光实验（需要标记荧光，和GFP/RFP等荧光标记一般不兼容）推荐抗体:abcam cat.ab166674.Cellcycle流式细胞检测实验5.克隆形成实验colony forming assay1）平板克隆形成试验（贴壁细胞适用）2）软琼脂培养克隆形成试验（悬浮细胞等适用）二、凋亡实验1.AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡（早期凋亡，需要标记FITC，和GFP一般不兼容）2.TUNEL法检测细胞凋亡（晚期凋亡）一般采用Roche的一步法kit，需要标记FITC，和GFP一般不兼容。
3.Caspase3/8/9Western Blot检测4.DNA Ladder（现在极少用）5.彗星实验（现在极少用）三、迁移、侵袭实验1.划痕实验2.Transwell实验检测迁移（不需要Matrigel）3.Transwell实验检测侵袭（需要Matrigel）四、内皮成管实验通过condition medium或者coculture模型，检测肿瘤细胞对内皮成管能力的影响：HUVEC Matrigel tube formation Model五、细胞移植动物实验1.裸鼠成瘤实验检测成瘤能力2.小动物活体成像实验（需要荧光标记，最好是Luciferase，可深度观测，RFP次之，GFP效果最差，只有皮下才能检出信号）3.移植后的血液/组织液中物质检测（LDH等）六、分子生物学与蛋白实验1.Western Blot检测下游通路变化2.Co-IP（最好带FLAG或His tag）3.免疫荧光（与之前的所带的荧光通道GFP/RFP等不兼容）七、其他分子探针型细胞功能学检测1.ROS检测：DCF法（绿光发射波长，和GFP不兼容）,DHE法(红光发射波长，与RFP不兼容)2.线粒体膜电位：JC-1（与GFP、RFP皆不兼容）；TMRE、TMRM：（和RFP不兼容）3.Ca2+（Indo-1,Fura-2,FLuo-4等，和GFP不兼容）注：其他探针不一一列举。
姜黄素抑制涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭、转移的作用及相关机制研究
姜黄素抑制涎腺腺样囊性癌细胞增殖、侵袭、转移的作用及相关机制研究蒋烈浩;许世莹;钱晨宏;谭卓;周政;郑国湾;葛明华;王佳峰【期刊名称】《现代中西医结合杂志》【年(卷),期】2022(31)21【摘要】目的探讨姜黄素对涎腺腺样囊腺癌(SACC)细胞增殖、侵袭和迁移能力的抑制作用及其相关机制。
方法取人源涎腺腺样囊性癌高转移株SACC-LM细胞株,将细胞暴露于含姜黄素浓度分别为0μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的培养基中,采用CCK-8法检测SACC-LM细胞增殖情况;取SACC-LM细胞株,分为姜黄素0μmol/L组、姜黄素1μmol/L组、姜黄素5μmol/L组、姜黄素10μmol/L组,采用Transwell法和划痕实验检测各组细胞的侵袭和迁移能力,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;取SACC-LM细胞株,分为姜黄素0μmol/L组、姜黄素10μmol/L组,采用Western blot法检测SACC-LM细胞中JAK-STAT3信号通路相关因子(STAT3、TIMP1、SNAIL、CyclinD1、MMP-9、MMP-2)蛋白表达情况。
结果培养72 h后,细胞存活率随姜黄素浓度的增高而降低;10μmol/L姜黄素处理时细胞增殖抑制比较合适。
姜黄素5μmol/L组、姜黄素10μmol/L组细胞侵袭率、细胞迁移率均明显低于姜黄素0μmol/L组和姜黄素1μmol/L组(P均<0.05),且姜黄素10μmol/L组均明显低于姜黄素5μmol/L组(P均<0.05);姜黄素5μmol/L组、姜黄素10μmol/L组细胞凋亡率均明显高于姜黄素0μmol/L组和姜黄素1μmol/L组(P均<0.05),且姜黄素10μmol/L组明显高于姜黄素5μmol/L组(P<0.05)。
姜黄素10μmol/L组SACC-LM细胞中STAT3、TIMP1、SNAIL、CyclinD1、MMP-9、MMP-2蛋白表达量均明显低于姜黄素0μmol/L组(P均<0.05)。
DNA高甲基化介导FOXO1转录表达下调促进鼻咽癌细胞增殖和侵袭能力
DNA高甲基化介导FOXO1转录表达下调促进鼻咽癌细胞增殖和侵袭能力于鹏;金金欣;冀火金;黄兰川;刘进;蔡永林【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2024(41)3【摘要】目的:探索叉头盒O1(FOXO1)在鼻咽癌(NPC)中异常表达的分子机制,及其对NPC细胞恶性生物学行为的影响。
方法:采用GEO数据集分析NPC中FOXO1表达水平,采用R4.2.1软件进行基因集富集分析。
构建FOXO1过表达的NPC细胞系5-8F、HONE1(FOXO1-5-8F、Ctrl-5-8F、FOXO1-HONE1、Ctrl-HONE1)。
分别通过CCK-8法、划痕实验、Transwell侵袭实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力,流式细胞术分析细胞周期。
通过重亚硫酸氢盐基因测序技术进行DNA甲基化测序。
结果:FOXO1 mRNA在NPC细胞和组织中表达下调。
FOXO1过表达组的细胞增殖能力和细胞迁移能力明显低于对照组(P<0.05),相同时间内,空白对照组的细胞侵袭数量高于FOXO1过表达组(P<0.05),FOXO1过表达抑制细胞周期(P<0.05)。
在NPC组织中,FOXO1 DNA启动子区域存在甲基化位点,其甲基化水平明显高于非癌组织(P<0.05)。
结论:NPC中FOXO1基因DNA高甲基化导致其转录下调,由此促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。
FOXO1可能是NPC的肿瘤抑制基因。
【总页数】9页(P364-372)【作者】于鹏;金金欣;冀火金;黄兰川;刘进;蔡永林【作者单位】桂林医学院临床医学院;梧州市红十字会医院医学检验科;右江民族医学院公共卫生与管理学院;广西卫生健康委员会鼻咽癌分子流行病学重点实验室〔梧州市红十字会医院〕【正文语种】中文【中图分类】R739.6【相关文献】1.SATB1高表达通过促进上皮-间充质转化而介导鼻咽癌细胞侵袭和转移2.miR-27a下调肾癌细胞FOXO1表达并促进其细胞增殖3.慢病毒介导shRNA靶向下调Cx26表达对人高侵袭性肝癌细胞上皮间质转化及侵袭的影响4.下调HOX转录反义RNA对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、周期及侵袭能力的影响5.miR-493-5p下调METTL3表达影响鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
天冬酰胺合成酶通过促进β-catenin核转位驱动胆管癌转移
天冬酰胺合成酶通过促进β-catenin 核转位驱动胆管癌转移*褚珍珍1，2， 周栩萱1，2， 刘力豪1， 张鲍欢3△， 姚楠1，2△（1暨南大学基础医学院病理生理学系，广东 广州 510632；2国家中医药管理局病理生理科研实验室，广东 广州510632；3暨南大学基础医学院形态学实验教学中心，广东 广州 510632）［摘要］ 目的：检测天冬酰胺合成酶（ASNS ）在胆管癌（CCA ）中的表达情况，探讨ASNS 在CCA 转移中的作用及其机制。
方法：通过公共数据库分析各肿瘤组织中ASNS 的mRNA 表达；收集CCA 患者病理组织（n =27），构建硫代乙酰胺诱导的大鼠自发CCA 模型和左中位胆管结扎联合二乙基亚硝胺诱导的小鼠自发CCA 模型，通过免疫组化、Western blot 和免疫荧光法检测ASNS 蛋白表达。
采用CCK8、划痕和Transwell 实验检测ASNS 对人CCA 细胞HuCCT1和HCCC -9810增殖、迁移和侵袭的影响。
构建ASNS 稳定敲减的CCA 细胞株HuCCT1shNC 、HuCCT1shASNS 、HCCC -9810shNC 和HCCC -9810shASNS ，通过肝原位种植和尾静脉注射研究ASNS 对CCA 细胞肝内生长和肺转移的影响。
利用公共数据库富集与ASNS 相关的信号通路，并用免疫荧光和Western blot 验证相关分子机制。
结果：无论在人或动物CCA 组织中，ASNS 表达水平均高于癌旁组织（P <0.01）。
ASNS 以酶活性非依赖性方式促进CCA 细胞HuCCT1和HCCC -9810的增殖、迁移与侵袭。
生物信息学分析显示，β-catenin 在ASNS 高表达的CCA 组织中富集，ASNS 通过促进β-catenin 核转位，启动CCA 细胞上皮-间充质转化（EMT ）。
β-catenin 抑制剂XAV -939可显著抑制CCA 细胞的侵袭与迁移。
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Transwell：实验步骤
2. 取出已稀释好的 Matrigel，冰浴融化，
以50ml 的体积铺于Transwell小室（24孔 板）聚碳酸酯膜上（注意：体积不可太大，
以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好），37°C
放置1h，使Matrigel 聚合成凝胶（注意： 加基质胶时最好将24
孔板放置在冰盒上，
确保胶完全覆盖孔底 ，不要有气泡）。
效靶比10:1的效应细胞孔 效靶比20:1的效应细胞孔
杀伤率计算公式为：杀伤率(%)=[1-(A实验孔-A效应细胞孔)/A靶细胞孔]×100%
肿瘤细胞的增殖实验
CCK-8：注意事项
1
当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，增大OD值。在做加药实验时，如果药物具有还原性，应在 含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450nm的吸光度，如果OD值有增大，则证明药物有影响，应在加 CCK-8之前更换培养基，排除药物的影响。
Transwell：实验结果举例
肿瘤细胞的增殖实验 肿瘤细胞的侵袭实验
Transwell：实验结果举例
划痕实验是测定肿瘤细胞的运动特性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，
划痕致伤，然后在加入药物等实验条件下观察其对肿瘤细胞迁移的影响。
肿瘤细胞的迁移实验
1．先用marker笔在6孔板背后，用直尺比
着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一 道，横穿过孔。每孔至少穿过3条线。
划痕实验：实验步骤
2. 在孔中加入约5×105个细胞，具 体数量因细胞种类不同而不同，接 种原则为过夜后融合率达到100%；
CCK-8：实验原理
肿瘤细胞的增殖实验
实验举例：细胞活性检测
研究某基因 对肿瘤细胞 增殖的影响
以A450平均 值为纵坐标，
时间为横坐标
绘制生长曲线
肿瘤细胞的增殖实验
实验举例：细胞增殖-毒性检测
研究某药物 对肿瘤细胞 增殖的影响
肿瘤细胞的增殖实验
实验举例：细胞杀伤
效靶比10:1的实验孔
效靶比20:1的实验孔 靶细胞孔
肿瘤细胞的迁移实验
划痕实验：注意事项
1. 在用PBS缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。
2. 一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（<2%）否则细胞增殖就不能忽略。
3. 按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决前后观 察位置不固定的问题。
肿瘤细胞的迁移实验
4．放入37℃ 5% CO2培养箱培养。每3h 测量一次
划痕实验：实验步骤
3.用200ml枪头用力均匀地在培养 皿中划痕，PBS洗涤2次，去除划 下的细胞，加入无血清培养基。
细胞运动的距离，拍照(具体时间依实验需要而定)。
划横宽度越小，伤口越小 ，伤口愈合能力越强，细胞迁移能力越强； 划横宽度越大，伤口越大，伤口愈合能力越弱，细胞迁移能力越弱。
2
3CCK-8显色时间：
贴壁细胞最易显色，加入CCK-8后30min即可肉眼观察显色 程度并上机检测； 悬浮细胞稍难显色，加入CCK-8后1-4h肉眼观察，若显色困 难，则继续培养直到显色完成； 白细胞最难显色，需要较长的CCK-8反应时间或增加细胞数 量（~105个细胞/孔）；
接种细胞数： 贴壁细胞每孔至少接种1×103个细胞/100ml培养基； 白细胞每孔至少接种2.5×103个细胞/100ml培养基； 进行预实验，梯度接种细胞，摸索接种细胞的数量。
直接检测活细胞数量的变化。
有些抗原（如Ki-67）只存在于 增殖细胞中，而非增殖细胞缺乏 这些抗原，因此可以通过特异性 的单抗来对细胞增殖进行检测。
死亡细胞或即将死亡的细胞几乎不 含ATP，在细胞溶解物或提取物中 测得的ATP浓度与细胞数之间存在 严格的线性关系。 利用荧光素酶luciferase及其底物荧 光素luciferin的ATP检测以生物发光 为基础，如果有ATP存在荧光素酶 就会发光，而且其发光强度与ATP 浓度成正比。
肿瘤细胞的增殖实验 肿瘤细胞的侵袭实验
Transwell：实验步骤
7. 4%中性甲醛固定10min，Giemsa 染色10min，PBS 洗涤3次，干燥，取下微孔滤
膜，倒置显微镜下观察穿过膜的细胞(200×)。
8. 每张膜中央部分和周围部分各随机取3个视野，计数每个视野内的穿过微孔的细胞数。
肿瘤细胞的增殖实验 肿瘤细胞的侵袭实验
不同的细胞需摸索加入CCK-8后的培养时间，以OD值在1左
右为最佳。
肿瘤细胞的迁移实验
肿瘤Байду номын сангаас转移过程
恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋 巴道， 血管或体腔等途径，到达 其他部位继续生长，称肿瘤转移。 肿瘤细胞的迁移和侵袭是肿瘤转 移必须具备的能力。
肿瘤细胞的迁移实验
划痕实验：实验原理
划痕实验（伤口愈合实验，Scratch Assay）
VEGF信号通路 抑制剂
HGF/c-Met 抑制剂
Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 2011.
I、肿瘤细胞的增殖实验
II、肿瘤细胞的迁移实验
III、肿瘤细胞的侵袭实验
肿瘤细胞的增殖实验
肿瘤的发生和发展过程
细胞增殖检测通常是检测分裂中的细胞数量或者细胞群体发生的变化。
脱后可用闪烁计数器检测。 变培养基颜色的甲臜染料。通过
特点
最准确可靠 耗时长 放射性危险
灵敏度高 操作简便 目前细胞增殖应用最为广泛
最直接的增殖指标 细胞直接计数法操作繁琐费时 所需细胞量较多
需要组织切片 无法进行高通量分析
适用于高通量细胞增殖检测和筛选
肿瘤细胞的增殖实验
代谢活性检测各类方法比较
肿瘤细胞的增殖实验
肿瘤细胞的增殖实验
增殖实验各类方法比较
细胞数量检测 细胞增殖相关抗原检测 ATP 浓度检测
方法
DNA合成检测
代谢活性检测
原理
放射性标记的3H-胸腺嘧 啶与细胞一同孵育，这样 新增殖细胞的DNA中就 会掺入放射性标记，经洗
在细胞增殖过程中脱氢酶的活性 会增加，因此其底物四唑盐或 Alamar Blue在代谢活跃的细胞 环境中会逐渐减少，形成能够改 分光光度计和酶标仪来读取含染 料培养基的吸光度，从而衡量细 胞的代谢活性，检测细胞增殖的 情况。
肿瘤细胞的侵袭实验
Transwell：实验原理
① Transwell小室 ② 上层培养液
③ 细胞
④ 基质胶 Matrigel ⑤ 下层培养液 ⑥ 细胞培养板 Transwell 侵袭实验示意图
肿瘤细胞的增殖实验 肿瘤细胞的侵袭实验
1. 无菌条件下 Matrigel 于冰浴融 化，用PBS（或对应无血清培养基） 稀释成1mg/ml，-20°C 冻存备用。
4. 实验时应注意细胞生长状况，选择适当的细胞接种浓度。对不同的细胞要观察细胞的贴壁率等， 确定实验时细胞的接种数量和培养时间，保证培养终止时密度适当。
肿瘤细胞的迁移实验
划痕实验：实验结果举例
肿瘤细胞的迁移实验
划痕实验：实验步骤
肿瘤细胞的迁移实验
划痕实验：实验步骤
肿瘤细胞的迁移实验
划痕实验：实验步骤
肿瘤细胞的增殖实验 肿瘤细胞的侵袭实验
Transwell：实验步骤
3. 每孔加入200ml 相应的培养基使胶重构。
4. 在Transwell下室中加入趋化因子或10%FBS培养基600ml/孔。 5. 在上室准确加入细胞 1×105 个/孔，细胞悬液体积200ml，置于5%CO2培养箱于37°C培养 24h（注意：细胞量和时间根据实验条件摸索）。 6. 待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上未穿过膜的细胞。
肿瘤细胞的增殖实验 肿瘤细胞的侵袭实验
Transwell：实验原理
人工重构基底膜材料Matrigel，是一种细胞外基质，4℃时是液体，
在37 ℃ 会逐渐凝固成胶状。主要成分为层黏连蛋白和Ⅳ型胶原，能在培 养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。
滤膜孔径一般为8mm，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能 自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有 Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。
EGFR抑制剂
细胞周期依赖性 激酶抑制剂
有氧糖酵解 抑制剂
细胞内能 量异常
持续的增 殖信号
逃避生长 抑制 逃避免疫 摧毁
抗CTLA-4单克隆 抗体
诱导凋亡的 BH3类似物
抵抗细 胞凋亡
无限复 制潜能
端粒酶抑制剂
基因组不稳 定和突变
促进肿瘤 炎症 诱导血管 生成 组织浸润 转移
PARP抑制剂
选择性抗炎症 药物